真菌检验
真菌检验
医学真菌学检查是诊断真菌病的重要依据,随着真菌感染病例的日益增多,对实验室的诊断也提出了更高的要求.不论是患者浅部或深部感染诊断,几乎全依赖于临床标本的真菌学检查.特别是系统性真菌感染,其早期特异的诊断方法是挽救患者生命的关键,而病原真菌的形态结构十分多样,在不同条件下同一真菌也可有不同特点的形态.因此,在真菌的实验室检查中,必须熟练掌握各类真菌的形态特征以及在不同条件下的演变规律,才能获得对致病真菌正确的诊断.目前真菌感染的实验室检查方法主要包括常规检查法和特殊检查法两类.常规检查法主要包括①形态学检查(直接镜检+染色镜检).②培养检查.③组织病理学检查.特殊检查主要包括①血清学方法.②分子生物学方法.
一,进行真菌实验室诊断的注意事项
①应有独立实验室,不应与其他细菌,病毒等实验室共用,以防发生相互污染.②在每天工作前与工作后,工作台均要以消毒水例如5%石碳酸或0.5%过氧乙酸擦拭,如遇操作台被真菌或标本污染,应即覆盖纸巾,并用5%石碳酸消毒20min,切忌工作台污染后即用水冲洗,以免污染扩散.③培养菌检体及真菌污染的物质在丢弃前,必须高压灭菌或焚烧.④在进行真菌检查时,不可试着闻平板培养基特殊的气味.⑤不可对Histoplasma capsulatum 以及Coccidioides immitis进行载玻片培养技术,因为其等具有高度感染性的孢子能够随着空气传播.⑥实验室禁止任意养花,草,动物等生物,以防实验污染.⑦工作环境应定期消毒.一般紫外线照射不能杀灭真菌,应用40%甲醛(可于每4㎡空间用35ml 40%甲醛加18g高锰酸钾)在密闭情况下熏蒸24h,或用环氧乙烷进行消毒,每2～4周消毒1次.⑧如果用平板培养基接种标本,必须将平板培养基密封,以免发生危险,在不常做真菌检测的实验室,最安全的培养方法是利用含有棉花塞的试管培养基(使空气能够循环).⑨美国梅育诊所主张利用平板培养基进行真菌的分离,步骤如下平板培养基必须在生物安全箱内操作及检查.平板培养必须用胶带封好,平板培养基必须含30ml的量,并保持培养箱60%以上的湿度,同时增加琼脂的浓度至2%,以免脱水.⑩真菌的诊断,需要经验的累积及备有良好的图谱参考书.
二,分离及鉴定真菌的培养基
配制培养基的一般原则
①各成分混匀后以文火缓慢加热,并不断搅拌,煮沸1min,过热会破坏有效成分.②分装试管应在高压灭菌前,而分装平皿应在高压灭菌后.③高压灭菌一般在118～121磅,10～15min.④需加血液或不能高压的成分如抗生素,应在培养基冷却至50 左右时加入混匀.⑤试管分装量约7~8ml,平皿约15ml,如需培养4～6周,平皿内应有35～40ml的量.培养基中抗生素的浓度和添加方法氯霉素,庆大霉素和放线菌酮能耐热,可在培养基高压灭菌前加入,其他抗生素均在培养基高压灭菌后冷却至45℃～50℃时加入.青霉素20～100μgml,链霉素40～200μgml,氯霉素50μgml,放线菌酮500μgml,庆大霉素5μgml.
分离和鉴定真菌的培养基
各种医学真菌所用培养基的成分,又可根据不同要求,分成分离,富集,选择,特性研究等含不同成分培养基,具体见表.
表分离鉴定真菌培养基分类表
培养基种类分离用培养基使用目的
1.Brain heart infusion agar 分离腐生性及病原性真菌
2.Brain heart infusion agar with antibiotics 分离除了皮肤丝状真菌以外的真菌
3.Brain heart infusion biphasic blood
Culture bottles 从血液中分离真菌
4.Dermatophyte test medium 分离皮肤丝状菌,建议仅做筛检用
5.Inhibitory mold agar 分离除了皮肤丝状真菌以外的真菌
6.Mycosel or mycobiotic agar 分离皮肤丝状菌
7.Ssbouraud dextrose agar 分离腐生性及病原性真菌
8.Yeast estract phosphate agar 分离除了皮肤丝状真菌以外的真菌
区分试验培养基
1.Ascospore agar 检测产子囊孢子酵母菌
2.Cornmeal agar with Tween 80 and trypan blue 检测产厚膜孢子酵母菌
3.Cottonseed conversion agar 使双相型真菌由霉菌型转变为酵母型
4.Czapek's agar 分离及区分Aspergillus spp
5.Niger seed agar 鉴定Cryptococcus neoformans
6.Nitrate reduction medium 检测Cryptococcus spp.还原nitrate能力
7.Potato dextrose agar 证实Trichophyton rubrumm 产色素能力制作载玻片培养技术
8.Yeast fermentation broth 测定酵母菌的发酵能力
9.Yeast nitrogen base agar 测定酵母菌的糖类同化能力
三,临床样本的采集与处理
皮屑边缘,疱壁,脓液,深层趾(指)间皮屑或活动边缘皮屑,取材前75%酒精消毒,作KOH涂片,同时种于沙氏琼脂加氯霉素2管,置25℃培养2周.
甲屑用细挫或牙科磨钻取病甲与正常甲交界处并且贴近甲床部的甲屑,标本用酒精浸泡待干燥后种于沙氏(SDA)培养4周,并同时作KOH涂片.
毛发取病发(变色,无光泽,弯曲,脆易折断,松动易拔除)15根,75%酒精消毒,3～5根作直接镜检,5～10根种于沙氏琼脂(加氯霉素),划破斜面掩埋.
(四)脓液无菌采集,注意颗粒,用无菌蒸馏水稀释后寻找.可作G染色或抗酸染色,常规的KOH 涂片及SDA接种培养也是必要的.
CSF 采集于无菌试管3～5ml,立即送检.置冰箱不宜超过1h.离心后以无菌吸管吸取离心沉淀物1ml,作墨汁涂片镜检和培养(SDA)25℃或37℃4周.
血液无菌抽血3～5ml立即于无菌抗凝管中,BHIB血标本量为培养基量的110,37℃5～7d出现浑浊或菌团,挑取镜检同时移种SDA(注每天检查完毕后需摇动培养基,37℃震荡培养可加速真菌的生长,提高检出率.不作直接检查,因其直接检查阳性率低.
体液,痰液,尿液,粪便①体液标本量10ml离心沉淀取2ml沉淀液做直接镜检培养.②晨痰3～5ml集于无菌瓶中(无菌生理盐水漱口数次后),挑取黏液或脓性部分KOH涂片培养.③早晨中段尿或清洁尿10ml,离心取沉淀液1ml做KOH涂片培养(SDA每管种0.5ml).④拭子一般尽量不用,缺点 A.不能得到足量的标本;B.采集的标本也不易从棉花纤维上分离下来;C.容易干竭.采集标本后应迅速放入内装1~2ml无菌蒸馏水的试管送检KOH涂片培养.⑤纸盒送检,挑取黏液,脓血,乳酪样部分KOH涂片培养(加抗生素)注单纯培养阳性,不一定有临床意义,KOH涂片发现菌丝,有诊断意义.
组织标本置无菌平皿中立即送检,置无菌匀浆器加2ml蒸馏水,研磨成浆或1～2mm3的小块,KOH涂片培养.
四,真菌学检验的基本技术
直接镜检
是最简单也是最有用的实验室诊断方法,常用的方法有①氢氧化钾复方氢氧化钾法标本置于载玻片上,加一滴浮载液,盖上盖玻片,放置片刻或微加热,即在火焰上快速通过2～3次,不应使其沸腾,以免结晶,然后轻压盖玻片,驱逐气泡并将标本压薄,用棉拭或吸水纸吸去周围溢液,置于显微镜下检查.检查时应遮去强光,先在低倍镜下检查有无菌丝和孢子,然后用高倍镜观察孢子和菌丝的形态,特征,位置,大小和排列等.浮载液A.10%~20%的KOH.配方氢氧化钾10～20g,蒸馏水加至100ml,待氢氧化钾完全溶解后揺匀存放在塑料瓶内,适用于皮屑,甲屑,毛发,
痂皮,痰,粪便,组织,耵聍等的检查.B.复方氢氧化钾溶液配方氢氧化钾(AR)10g,二甲基亚砜(AR)40ml,甘油50ml, 蒸馏水加至100ml,配制方法将氢氧化钾先加入30ml蒸馏水中溶解后,再依次加入DMSO,甘油揺匀后,用蒸馏水加到100ml,装入塑料瓶内.此配方的优点是配方中加DMSO,能促进角质的溶解,有甘油涂片不易干,不易制成氢氧化钾结晶,氢氧化钾的浓度相对低,腐蚀性亦低,为进行大面积普查或大批量采集标本作镜检带来了方便.②胶纸粘贴法用1cm×1.5cm的透明双面胶带贴于取材部位数分钟后自取材部位揭下,撕去复带在上面的底板纸贴在载玻片上,使原贴在取材部位的一面暴露在上面,再进行革兰染色或过碘酸锡夫染色,在操作过程中应注意双向胶带粘贴在载玻片上时不可贴反,而且要充分展平,否则影响观察.
③涂片染色检查法在载玻片上滴1滴生理盐水,将所采集的标本均匀涂在载玻片上,自然干燥后,火焰固定或甲醇固定.再选择适当的染色方法,染色后,以高倍镜或油镜观察.
常见镜检染色方法有①革兰染色.所有真菌,放线菌均为革兰染色阳性,被染成蓝黑色.适用于酵母菌,孢子丝菌,组织孢浆菌及诺卡菌,放线菌的感染.②乳酸酚棉蓝染色用于各种真菌培养物的镜检.③印度墨汁用于检测脑脊液(CSF)中的新生隐球菌.④抗酸染色用于抗酸菌及诺卡菌的诊断.⑤瑞氏染色用于组织胞浆菌和马内菲青霉的检测.⑥过碘酸锡夫染色(PAS)用于体液渗出液和组织匀浆等.真菌胞壁中的多糖染色后呈红色,细菌和中性细胞偶可呈假阳性,但与真菌结构不同,不难区别.⑦嗜银染色(GMS)真菌可染成黑色,主要用于测定组织内真菌.
真菌培养
从临床标本中对致病真菌进行培养,目的是为了进一步提高对病原体检出的阳性率,以弥补直接镜检的不足,同时确定致病菌的种类.真菌培养检查除需要一般细菌检验用到的器具外,还应准备真菌专用的接种针,接种环,或接种钩(用铂丝或镍丝制成),微型小铲,刀片,针头等,常规分离鉴定使用的培养基为沙氏葡萄糖琼脂(SDA)斜面培养基,加0.05%氯霉素,还有多种性质的培养基(见第二部分)以满足各种不同的需要,可酌情选用接种的方法,根据不同的临床标本,大体可分为点植法和划线法两种.①点植法适用于皮屑,甲屑,毛发,痂皮,组织等有形固体标本,将标本直接与培养基表面点状接触.②划线法适用于痰,分泌物,脓液,组织液,组织块的研磨液等液体标本,用接种针(环)划线接种在培养基表面.
培养方法有多种,接临床标本接种时间分为直接培养法和间接培养法;按培养方法分为试管法,平皿法(大培养)和玻片法(小培养).①直接培养采集标本后直接接种于培养基上.②间接培养采集标本后,暂保存,以后集中接种.③试管培养是临床上最常用的培养方法之一,培养基置于试管中,主要用于临床标本分离的初代培养和菌种保存.④大培养将培养物接种在培养皿或特别的培养瓶内,主要用于纯菌种的培养和研究.⑤小培养主要用于菌种鉴定,大致分为三种玻片法,方块法和钢圈法.A.玻片法在消毒的载玻片上,均匀地浇上熔化的培养基,不宜太厚.凝固后接种待鉴定菌株,置于平皿中,保湿.待有生长后,盖上消毒的盖玻片,显微镜下直接观察,常用米粉吐温琼脂培养基观察白念珠菌的顶端厚壁孢子和假菌丝.B.方块法适用于霉菌菌落的培养.取无菌平皿倒入约15ml熔化的培养基,待凝固后用无菌小铲或接种刀划成1cm2大小的小块.取一小块移在无菌载玻片上,然后在小块上方四边的中点接种待鉴定菌株,盖上消毒的盖玻片,放入无菌平皿中的V形玻棒上,底部铺上无菌滤纸,并加入少量无菌蒸馏水,孵育,待菌落生长后直接将载玻片置显微镜下观察.C.钢圈法先将固体石蜡加热熔化,取直径约2cm,厚度约0.5cm有孔口的不锈钢小钢圈,火焰消毒后趁热浸入石蜡油,旋即取出冷却,石蜡油即附着于小钢圈中.再取一无菌载玻片,火焰上稍加热,将小钢圈平置其上,孔口向上.小钢圈上石蜡油遇载玻片的热即熔化后凝固,钢圈就会固定在载玻片上.用无菌注射器经孔口注入熔化的培养基,培养基量约占小钢圈容量的12,注意避免气泡.待培养基凝固后取一消毒盖玻片,火焰上加热后,趁热盖在小钢圈表面,也即固定其上.最后用接种针伸入孔口进行接种.这种方法的优点是形成一种封闭式培养,在显微镜下直接观察菌落时可避免孢子吸入人体,而且不易被污染,盖玻片也可取下染色后封固制片保存.
培养检查
标本接种后,每周至少检查2次,观察以下指标①菌落外观A.生长速度缓慢生长菌7～14d,快速生长菌2～7d.一般浅部真菌超过2周深部真菌超过4周仍无生长,可报告阴性.B.外观a.扁平.b.疣状.c.折叠规则或不规则.d.缠结或垫状.e.其他.C.大小菌落大小用cm来表示,菌落大小与生长速度和培养时间有关.D.质地 a.平滑状.b.粉状.c.粒状.d.棉花状.e.粗毛状.f.皮革状.g.粘液状.h.膜状.E.颜色不同的菌种表现出不同的颜色,呈鲜艳或暗淡.致病性真菌的颜色多较淡,呈白色或淡黄色,而且其培养基也可变色,如马尔尼菲青霉等,有些真菌菌落不但正面有颜色,其背面也有深浅不同的颜色.菌落的颜色与培养基的种类,培养温度,培养时间,移种代数等因素有关.所以,菌落的颜色虽在菌种鉴定上有重要的参考价值,但除少数菌种外,一般不作为鉴定的重要依据.F.菌落的边缘有些菌落的边缘整齐,有些不整齐.G.菌落的高度和下沉现象有些菌落下沉现象明显,如黄癣菌,絮状表皮癣菌等,更有甚者菌落有时为之裂开.H.渗出物一些真菌如青霉,曲霉的菌落表面会出现液滴.I.变异有些真菌的菌落日久或多次传代培养而发生变异,菌落颜色减退或消失,表面气生菌丝增多,如絮状表皮癣菌在2～3周后便发生变异.②显微镜检查小培养可置普通显微镜下直接观察,而试管和平皿培养的菌落则需挑起后做涂片检查. 五,组织病理学检查
真菌病的组织病理检查与直接镜检培养同样具有相当重要的价值,尤其对深部真菌病的诊断意义更大,如用特殊染色可提高阳性率.
真菌的组织病理反应与其他一些疾病的组织病理反应极其相似,往往只有在仔细研究了病理切片并发现了真菌之后才考虑到真菌病的诊断.而在这种情况下,标本已被固定,培养有时已不可能进行,组织病理切片就成了真菌感染的主要依据.所以临床上在送病理标本的同时,要尽可能考虑到真菌感染的可能,以便同时采集标本送真菌实验室进行真菌学检查.
真菌在组织内一般表现为①孢子酵母和双相型真菌在组织内表现为孢子.②菌丝许多真菌在组织中只表现为菌丝.组织中发现无色分隔,分支的菌丝多为念珠菌和曲霉.粗大,不分隔少分支的菌丝为接合菌,多为毛霉,根霉,犁头霉等.粗大,少分支有隔的菌丝为蛙粪霉菌.棕色菌丝为暗色丝孢霉病,由暗色孢科真菌引起.③菌丝和孢子,主要见于念珠菌感染.④颗粒为组织内由菌丝形成的团块.⑤球囊或内孢囊球囊内含有内孢子,为球孢子菌或鼻孢子菌在组织内的特征性结构.
组织病理片中根据形态和染色能基本确定种名的真菌为荚膜组织胞浆菌,杜波伊斯组织胞浆菌,副球孢子菌,皮炎芽生菌,链状芽生菌,粗球孢子菌,新生隐球菌和鼻孢子菌等.根据组织病理中真菌的形态能确定属而不能确定种的病为放线菌病,奴卡菌病,无绿藻病,念珠菌病,曲霉病和不育大孢子菌病等.多个属的真菌感染可引起相同的临床表现,在组织病理中真菌的形态无法区别的病有皮肤着生芽生菌病,暗色丝孢霉病,接合菌病,皮肤癣菌病和足菌肿等.足菌肿的颗粒若染色适当,很易确定为放线菌性或真菌性的,也能区别出细菌性颗粒.真菌性颗粒中的菌丝又分为无色或暗色两大类.各种病原菌基本上形成各自颜色,大小,形成和结构的颗粒,可以初步区别,但最后确定必须依靠真菌培养.
六,血清学方法
随着诊断技术的进展,以免疫学方法检测真菌病已成为可能,引起深部真菌感染的病原菌主要有白念珠菌,曲霉菌和隐球菌等,传统的检测方法主要为血培养和组织活检,但血培养历时太长,且深部真菌感染的病原菌常不易培养成功,阳性率较低.而深部真菌感染的临床征象错综复杂,又使得组织活检缺乏典型改变,影响正确诊断,这些都使得这些方法所起的作用极为有限,真菌的抗原,抗体及代谢产物的血清学检查用于深部真菌感染的实验室检测,可取得很好的效果.目前常用的免疫诊断方法有①特异性抗原的检测A.乳胶凝集试验(LA).B.酶联免疫试验(EIA).C.荧光免疫测定法(FA).②特异性抗体检测由于受检者都为免疫低下患者,因其致阳性率低,故现已少用.
七,分子生物学方法
近年来随着分子生物学的发展,已有聚合酶链反应(PCR)扩增,分子探针,限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP),DNA指纹图谱,随机扩增DNA多态性(RAPD)等方法.用于深部真菌病的诊断和分型研究,形成了以PCR技术为基础的一系列分子诊断方法.从这些新技术对多种致病真菌鉴定的应用过程中发现,此类方法具有操作简便,省时省力,特异性,敏感性高的优点.特别是从分子水平对真菌从遗传进化角度阐明菌种间内在的分类学关系,真正达到人们追求已久的自然分类的目的.我们有理由相信,随着PCR及相关技术在临床的应用及更广泛深入的研究,将会对真菌感染的诊断和鉴定产生根本的影响.
(摘自《中国真菌学杂志》,2006年第2期)
真菌的常规检验法
真菌的常规检验法 实验室检查： ?标本采集分离培养 ?直接镜检生化反应 ?染色镜检免疫学试验 一、临床标本的采集 ?1．皮肤的角质性物质：毛发、指(趾)甲、头屑、皮屑等。 2．各种分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳垢、痰、粪便、尿液等。 ?3．血液和体液：体液包括胸水、腹水、脑脊液、淋巴穿刺液等。 4．脓汁及渗出物。 二、检验方法 （一）标本直接检查法
不染色标本检查 染色标本检查 （二）培养检查 （三）鉴定 ①KOH溶液：本液适于检查致密的难以透明的材料（如毛发、指甲、鳞屑等）。 ②墨汁：主要用于检查有荚膜的真菌（如新型隐球菌等） ③水合氯醛－石炭酸－乳酸封固液：此液透明力较强，只限于不透明的标本。 ④生理盐水：为观察真菌的出芽现象可用生理盐水代替氢氧化钾溶液。 微生物学检查步骤： 取患部标本
（毛发、皮屑等）__置载玻片__加10%NaOH（或10%KOH）→微加温消化 →镜检（观察菌丝和孢子） 直接镜检的意义 ①有诊断意义，如浅部真菌病等； ②通过真菌的形态，可确定某些致病性真菌的属或种, 如假丝酵母菌的厚膜孢子等； ③判断某些真菌种的致病性等,如皮肤癣菌、曲霉等。 直接镜检的局限性： ①阴性结果不能排除真菌感染； ②有假阳性结果。 因此，对直接镜检可疑结果应作复查或用其他检验方法鉴定。 2. 染色标本检查 ?（1）革兰染色：各种真菌均染成革兰阳性。 ?（2）乳酸酚棉蓝染色
?（3）糖原染色： ?又称过碘Schiff（简称PAS或PASH）。真菌细胞壁由纤维素和几丁质组成，含有多糖。过碘酸使糖氧化成醛，再与品红－亚硫酸结合，成为红色，故菌体均染成红色。为真菌染色最常用的方法之一。 ?（4）嗜银染色（GMS）：染成黑色 ?（5）粘蛋白卡红染色法（MCS）：主要用于新生隐球菌荚膜的染色。隐球菌荚膜和细胞壁呈红色，细胞核呈黑色。 ?（6）荧光染色：主要使用吖啶橙和氢氧化钾来染直接涂片、培养涂片及组织切片。 （二）培养检查法 ?本法可确定菌种，辅助直接检查的不足。 ①菌落性质：酵母菌还是霉菌； ②菌落大小：致病性真菌菌落小，而条件致病性真菌菌落大； ③菌落颜色：病原性真菌颜色淡，污染真菌颜色深；
真菌检测方法
分离培养：无菌采取病料接种马铃薯琼脂培养基中，置37℃恒温箱中培养24小时，长成绒毛样菌丝，未见其它细菌生长。经48小时培养长成白色菌落。72小时菌落呈纽扣状，由中心向外周逐渐变深，转变成灰白色、灰绿色。取培养物镜检可见大量球形的分生孢子。 通常人们把真菌和霉菌认为是一种病原的两种说法。真正真菌包括霉菌，霉菌只是众多真菌中的一种。真菌是由单细胞或多细胞组成，按有性或无性方式进行繁殖的真核细胞类微生物。根据其侵犯人体的部位分为前部真菌和深部通常人们把真菌和霉菌认为是一种病原的两种说法。真正真菌包括霉菌，霉菌只是众多真菌中的一种。真菌是由单细胞或多细胞组成，按有性或无性方式进行繁殖的真核细胞类微生物。根据其侵犯人体的部位分为前部真菌和深部真菌，包括皮肤癣菌、孢子丝菌、念珠菌、曲霉菌、隐球菌、组织胞浆菌等。而霉菌多为细胞真菌的一种，也为深部感染真菌，包括烟曲菌、黄曲菌、黑曲菌、土曲菌等，常发生于免疫力低下的患者，引起全身播散性感然，影响预后。 培养基的选择应根据实验材料和检验目的来确定。目前国标方法中使用的培养基有:马铃薯葡萄糖琼脂(PDA),孟加拉培养基(RBC)、高盐察氏培养基(CAO),其中PDA和RBC适合于一般的霉菌和酵母菌生长,而CAO则适合于高渗性霉菌生长,酵母菌几乎不长。在日常检测中我们发现,有些常见的耐高渗性霉菌,如局限曲霉、谢瓦曲霉、赤曲霉、Wallemia等在PDA、RBC上生长非常缓慢或不长,而这些菌在高渗培养基如M40Y、DG18(M40Y琼脂配方:蔗糖400g,麦芽提取汁20g,酵母提取汁5g,琼脂20g,氯霉素50mg,蒸馏水1000ml;DG18琼脂配方:葡萄糖10g,蛋白胨5g,KH2PO41g,MgSO4·7H2O 0.5g,氯霉素0.1g,0.2%二氯硝基苯胺1.0mL,琼脂15g,蒸馏水1000mL,PH6.5)上则正常生长,孢子、形态特征发育良好,而且酵母菌也能在M40Y、DG18上生长,因此,若能同时采用PDA和M40Y(或DG18)分离培养各类样品中的霉菌,将能更全面地反映出污染霉菌的菌相。特别是对干燥食品、高糖食品、淹渍食品等,更有必要同时采用M40Y或DG18。 由于霉菌中很多种类不会产生有毒的霉菌毒素,危害较小,而有的菌株即使污染数量不多,但其产生的霉菌毒素却危害较大,因此仅作霉菌计数并不能全面反映其危害程度,重要的是要知道污染菌的菌相,才能更好地判断被污染食品的安全程度。为此,国外有些研究者设计出各类选择性培养基,可以识别产毒的霉菌。如AFPA培养基(配方:酵母提取汁20g,蛋白胨10g,柠檬酸铁铵0.5g,0.2%二氯硝基苯胺1.0mL,琼脂15g,蒸馏水1000mL,PH5.6)用于分离黄曲霉毒素产生菌高污染率的食品。产黄曲霉毒素的菌株黄曲霉和寄生曲霉在AFPA上30℃培养2~3天就形成背面有亮橙黄色的特征性菌落,非常容易识别。有人利用该培养基分离黄曲霉高污染食品花生、玉米等,取得了满意的结果。因此,针对不同样品,有目的地设计出相应的选择性培养基,以筛选污染菌中的危险菌群,将是一个值得探索的方向。 2接种方式 接种方式主要有倾注法和涂布法两种。目前国际方法中采用倾注法,但近来国际上有不少学者认为霉菌计数采用涂布法更合适。Beuchat和Matsuda等人分别对这两种方法作了大
临床医学检验高级职称题-真菌学
临床医学检验高级职称题-真菌学 1、慢性化率最高的病毒性肝炎是（） A.甲型肝炎 B.乙型肝炎 C.丙型肝炎 D.丁型肝炎病毒单独感染 E.戊型肝炎 2、马拉色菌毛囊炎属于（） A.细菌性皮肤病 B.微小棒状杆菌皮肤病 C.病毒性皮肤病 D.真菌性皮肤病 E.非感染性皮肤病 3、肠道病毒不包括（） A.脊髓灰质炎病毒 B.EV71 C.甲型肝炎病毒 D.HDV E.ECHO病毒
4、凝胶过滤法主要用于蛋白和核酸分离，又称为分子筛层析法，其常用介质是（） A.聚丙烯酰胺 B.琼脂糖 C.琼脂糖－聚丙烯酰胺 D.葡聚糖 E.琼脂糖－葡聚糖 5、具有急性肝炎临床表现的病人除去下列哪项均可以确诊为甲型肝炎（） A.抗HAVIgM B.抗HAVIgG C.粪便中检出HAV抗原 D.粪便中检出颗粒HAV E.粪便中检出HAVRNA 6、IFA是（） A.间接免疫荧光检测 B.玻片凝集试验 C.试管凝集试验 D.溶血空斑试验
E.间接凝集试验 7、女性，26岁，1周来发热，乏力，纳差，恶心呕吐，尿黄。近2天来热退，但黄疸迅速加重，嗜睡。查ALT660IU／L，AST450IU／L，总胆红素250μ;mol／L，下列各项检查中，哪一项你认为对进一步诊断最有价值（） A.抗HAv－IgM B.HBsAg C.HCV－RNA D.抗HEV E.凝血酶原活动度（PTA） 8、为预防乙型流感的主要措施是（） A.口服金刚烷胺 B.注射丙种球蛋白 C.接种疫苗 D.注意空气消毒 E.避免到公共场所 9、10月龄男婴，2007年10月突发水样便腹泻，10余次／天。伴呕吐、发热、轻度脱水。大便性状开始为蛋花状，后为水样。该患者所患胃肠炎的致病因子以下哪种最有可能（）
真菌标本检验标准操作规程
真菌标本检验标准操作规程 1.目的 规范真菌标本细菌学检验标准操作规程，确保检验结果准确可靠。 2. 适用范围 各类真菌检测的标本。 3. 标本采集及处理 3.1 标本类型痰、尿、粪、脓液、脑脊液、血、拭子、皮屑、甲屑、气管穿刺抽取的痰液等。 3.2 标本采集与处理 3.2.1 痰液、气管穿刺抽取的痰液。 3.2.2 尿液早晨中段尿10ml，离心取沉淀液1ml，作真菌涂片及培养。 3.2.3 口腔、咽喉、外耳道、阴道、和直肠粘膜的标本应迅速放入内装1-2ml无菌蒸馏水的试管送检。常规KOH 涂片及SDA培养。 3.2.4 粪便无菌盒送检，挑取黏液、脓血接种于含氯霉素培养基上。 3.2.5 脓液脓液标本应置无菌广口有盖玻璃瓶或小的无菌平皿中，立即送检。 3.2.6 脑脊液采集于无菌试管3-5ml，立刻送检。离心后以无菌吸管吸取离心沉淀物1ml，作墨汁涂片镜检和培养
（SDA）25°C及37°一周。 3.2.7 血液分别于左右两侧无菌抽血3-5ml，立即置于脑心浸出液肉汤。 3.2.8 体液支气管积液、关节腔积液、心包积液、腹水等10ml离心沉淀后取0.5ml沉淀液作直接镜检(注意颗粒)及培养。 3.2.9 组织标本置于无菌平皿中立即送检，置无菌研钵或组织匀浆器加2ml蒸馏水，研磨成浆或切成1-2mm3的小块作真菌直接镜检（KOH涂片）及培养。 3.2.10 皮屑皮损的边缘、疱壁、脓液、深层趾（指）间皮屑或活动边缘皮屑。取材前75%酒精棉球消毒取材处，标本作真菌直接镜检（KOH涂片）及培养。 3.2.11 甲屑用细锉或牙签研磨钻取病甲与正常甲交界处并且贴近甲床部的甲屑，标本用酒精浸泡待干燥后以十点接种法分别种于含放线菌酮及不含放线菌酮的SDA平皿，25°C-28°C培养3周，并同时作KOH涂片。 3.2.12 毛发取病发15根、75%酒精消毒，3-5根作直接镜检，5-10根种于SDA斜面（加氯霉素），稍划破斜面掩埋。 3.3 标本拒收标准及处理参见《标本拒收程序》 4.试剂、培养基及仪器 4.1 接种针、电热灼烧器、显微镜、恒温培养箱、冰箱、全排式生物安全柜等。
28.真菌检验
1.真菌是真核细胞型微生物，属真菌界。有细胞壁（几丁质） 2.真菌分类学上，分为①有性孢子②无性孢子。优先考虑的是有性孢子的特征 3.真菌无性繁殖包括①出芽生殖②分裂繁殖③芽管繁殖④生隔繁殖 4.真菌常用沙保弱培养基进行培养，大部分真菌在25-28℃生长良好，少数需要在37℃培养 5.不染色直接镜检真菌是最简单的检查真菌方法，标本检查和培养检查需要使用氢氧化钾处理 6.假丝酵母菌菌落呈灰白色或奶油色，大多数可形成芽管，只有白假丝酵母菌可形成厚壁孢子，可形成较长菌丝，常用革兰染色 7.白假丝酵母菌（白色念珠菌）通常存在于人类呼吸道、口腔（鹅口疮）、肠道、阴道中，当机体免疫力下降时可引起感染 8.隐球菌有肥厚的荚膜，一般染色不易发现。用墨汁染色镜检，可见黑色背景中有圆形透明菌体。新型隐球菌在25℃、37℃均可生长，非致病性隐球菌在37℃不能生长 9.新型隐球菌尿素酶试验（+）白假丝酵母菌尿素酶试验（-） 10.新型隐球菌在免疫功能低下者体内可引起隐球菌性脑膜炎 11.卡氏肺孢菌主要在空气传播，健康人体内多为无症状的隐形感染，免疫力下降后，可导致PCP肺炎（间质性肺炎） 12.卡氏肺孢菌生活史有两种形态；包囊（感染型）和滋养体（繁殖型），采用镀银染色法检查 13.组织胞浆菌与马尔尼菲青霉菌为双向型真菌 14.毛癣菌属：易侵犯人体皮肤、指甲、毛发的角蛋白组织并繁殖生长，标本经10%KOH溶液消化后镜检，可见菌丝或孢子 15.试验 ①厚膜孢子形成试验：白假丝酵母菌 ②TZC反应：鉴定热带假丝酵母菌 ③尿酶试验：鉴别新型隐球菌（+）与白假丝酵母菌（-），荚膜组织细胞菌（+）与杜波组织细胞浆菌（-） ④毛发穿孔试验：须癣毛癣菌（+）与红色毛癣菌（-）
常见的真菌性疾病
常见的真菌性疾病 真菌性疾病是由真菌引起的感染性疾病。真菌是广泛存在于自然界的一类真核细胞生物，具有真正的细胞核和细胞器，不含叶绿素，以寄生和腐生方式吸取营养，能进行有性和无性繁殖。 真菌的基本形态是单细胞个体（孢子）和多细胞丝状体（菌丝）。估计全世界已记载的真菌有10万种以上，其中绝多数对人类无害，只有少数真菌（约200余种）与人类疾病有关。真菌最适宜的生长条件为温度22℃～36℃，湿度95%～100%，pH5～6.5。真菌不耐热，100℃时大部分真菌在短时间内死亡，但低温条件下可长期存活；紫外线和X射线均不能杀死真菌，甲醛、石炭酸、碘酊和过氧乙酸等化学消毒剂均能迅速杀灭真菌。 按照菌落形态，真菌可分为酵母菌（yeast）和霉菌（mold）两大类，前者菌落呈乳酪样，由孢子和芽生孢子组成，后者菌落呈毛样，由菌丝组成，故又称为丝状真菌。有的致病真菌在自然界或25℃培养时呈菌丝形态，而在组织中或在37℃培养时则呈酵母形态，称为双相真菌。 根据真菌入侵组织深浅的不同，临床上把引起感染的真菌分为浅部真菌和深部真菌。 浅部真菌 浅部真菌主要指皮肤癣菌（dermatophyton），包括毛癣菌属（Trichophyton）、小孢子菌属（Microsporum）和表皮癣菌属（Epidermophyton），其共同特点是亲角质蛋白，侵犯人和动物的皮肤、毛发、甲板，引起的感染统称为皮肤癣菌病（dermatophytosis），简称癣（tinea）。目前浅部真菌病仍按发病部位命名（如头癣、体癣、股癣、手癣和足癣等），少数按皮损形态的传统命名，如叠瓦癣、花斑癣。皮肤癣菌病为接触传染，不洁的卫生习惯、多汗浸渍、共用拖鞋、毛巾、梳子及接触患癣的动物是皮肤癣菌传播的主要途径。 深部真菌 深部真菌病一般按致病菌命名（如着色芽生菌病、念珠菌病等）。多数深部真菌系条件致病，多侵犯免疫力低下者，近年来随着广谱抗生素、糖皮质激素、免疫抑制剂、抗肿瘤药物的使用增多，器官移植、各种导管和插管技术的开展以及艾滋病患者的增多，条件致病菌的感染机会也不断增加，同时还发现了许多新的致病菌种。 头癣 头癣是头皮和头发的浅部真菌感染，根据病原菌和临床表现的不同可分为黄癣、白癣和黑点癣三种。 发病原因 头癣是真菌感染头皮和头发所引起的疾病。患了头癣，头皮上会出现很多灰白鳞屑或大片的黄痂，还可引起头发折断或脱落。严重者头发参差不齐甚至所剩无几，即人们所说的“癞痢头”。 头癣的发生主要是通过接触头癣患者或有病的动物而被传染的，从自然界中感染来的极罕见。正常人与患头癣者经常密切接触，特别是儿童在一起玩耍，头碰头的接触，很容易被传染。还有与有病的动物接触后患病，这都属于直接传染。如果使用头癣患者用过的帽子、头巾、枕头、梳子或理发推子、剪刀等也可被传染，这叫做间接传染。可见头癣是很容易传染的。过去头癣在我国流行很广，医院里常可看到头癣患者。 但是，真菌感染后不一定都引起头癣，这与机体对真菌的抵抗力密切相关。大多数成人对真菌抵抗力较强，而儿童较弱，所以头癣多见于儿童。
真菌检验
1、什么是真菌？ 真菌为真核细胞型微生物，属于真菌界。具有典型的细胞核，不具有叶绿素，以腐生和寄生方式摄取营养，细胞壁含几丁质和纤维素，有完善的细胞器，能进行有性生殖和（ 或）无性繁殖。真菌在自然界分布极为广泛，约有20余万种，大多对人无害，仅有约150种对人和动物致病。 2、真菌的基本结构是什么？ 真菌的基本结构为菌丝和孢子，菌丝为微细的管状结构，具有细胞壁，细胞膜，细胞浆和细胞核，分枝或不分枝，分隔或不分隔，有粗有细，着色或不着色。一般致病真菌的菌丝较细而且分隔。孢子是真菌的繁殖器官，也是抵抗不良环境的结构，类似于高等植物的种子，是真菌分类坚定的最主要依据。 3、引起人和动物感染的真菌分为哪两类？ 引起人和动物感染的真菌分为病原性真菌和条件致病菌两大类。病原性真菌本身具致病性，而条件致病菌一般不具致病性，只有在一定条件下，即机体免疫力降低时才致病。 4、引起真菌病的常见诱因有哪些？ 长期使用广谱抗生素，皮质激素和免疫抑制剂，代谢障碍，血液病，尿毒症，慢性消耗性疾病，外伤，大手术，器官移植，静脉高营养，导插管，放化疗及爱滋病等都是重要的诱因。 5、真菌生长的特点？ 真菌在生长过程中有从中心向四周等距离生长形成圆形菌落的倾向。也正因为这一特点使体股癣的皮肤损害表现为环行或多环行。 6、实验室检查真菌包括什么？ 实验室检查主要包括真菌直接检查和真菌培养。 7 、真菌直接检查的意义？ （1）直接检查阳性有诊断意义，一般可确定有真菌感染，但阴性不能排除诊断。 （2）根据直接检查所见的真菌镜下形态可确定少数病原菌的种，如新型隐球菌，花斑癣菌等。有些可确定属，如念珠菌属等。 （3）直接检查所见的真菌形态，代表该菌在组织内的形态即组织象。（4）真菌镜下形态有时可提示该菌的活动性，如念珠菌出现真菌丝和假菌丝，皮肤癣菌的菌丝肥大粗长多分枝，胞浆浓都表示该菌处于活跃状态。 8 、真菌培养的目的是什么？
真菌检验带答案
第十六章医学真菌学 一、单5选1 1.真菌区别于细菌的本质特征是： A.具有高度分化的细胞核（有核膜、核仁） B.有单细胞和多细胞等不同形态 C.有多种增殖方式 D. 对抗生素不敏感 E.细胞壁中无肽聚糖 2.为真核细胞型微生物的是： A.细菌 B.真菌 C.支原体 D.衣原体 E.病毒 3.真菌的繁殖结构是： A.芽孢 B.孢子 C.包涵体 D.原体 E.始体 4.真菌细胞壁不含有的成分是： A.几丁质 B.葡聚糖 C.肽聚糖 D.蛋白质 E.脂质 5.真菌的致病性包括： A.真菌毒素中毒 B.条件致病性真菌感染 C.真菌过敏 D.真菌毒素的致癌作用 E.以上全包括 6.真菌感染率明显上升与下列哪种因素相关性最小： A.抗生素使用不当 B.抗癌药物使用增多 C.机体免疫力下降 D.激素使用增多 E.真菌发生耐药变异 7.培养真菌的最适pH是： A.2.0～4.0 B.3.0～4.0 C.4.0～6.0 D.5.0～7.0 E.6.0～8.0 8.培养真菌首选下列哪种培养基： A.普通琼脂平板 B.半固体培养基 C.玻片小培养 D.米汤培养基 E.沙保罗培养基 9.多细胞真菌的菌落类型是： A.酵母型 B.类酵母型 C.丝状型 D.类丝状型 E.混合型 10.关于条件致病性真菌感染，下列说法错误的是： A.引起的是内源性感染 B.致病性强，常造成AIDS或肿瘤等病人的致死性感染
C.是肿瘤、糖尿病及免疫缺陷性疾病治疗中的疑难问题 D.目前无特异预防措施 E.临床感染率呈明显上升趋势 11.检查新型隐球菌感染常用： A.革兰染色法 B.抗酸染色 C.墨汁染色 D.瑞氏染色 E.吉姆萨染色 12.以下哪种真菌不属于浅部真菌： A.红色毛癣菌 B.铁锈色小孢子菌 C.石膏样小孢子菌 D.卡氏肺孢菌 E.絮状表皮癣菌 13.*鹅口疮的病原菌是： A.衣原体 B.细菌 C.真菌 D.螺旋体 E.立克次体 14.真菌感染不用青霉素治疗，是因为真菌： A.缺乏细胞壁 B.真菌产耐青霉素的酶 C.长期使用青霉素已产生耐药 D.细胞壁缺乏肽聚糖 E.亲和力低 15.关于皮肤癣的描述是错误的是： A.主要侵犯皮肤、毛发和指（趾）甲 B.通过直接或间接触而感染 C.在沙保弱培养基上形成丝状菌落 D.一种皮肤癣仅能引起一种癣病 E.可以根据菌丝、孢子及菌落形成作出初步判断 16.下列何种真菌是我国主要的表面感染真菌： A.着色真菌 B.絮状表皮癣菌 C.许兰毛癣菌 D.红色毛癣菌 E.糠秕马拉色菌 17.表皮癣菌属不引起： A.毛发癣 B体癣 C甲癣 D足癣 E手癣 18.实验室诊断皮肤癣菌感染时，皮屑或病发须经哪种溶液处理后再镜检： A.10%Nacl B.70%乙醇 C.10%KOH D.25%KOH E.15%NAOH 19.具有假菌丝的真菌是：
土黄洗剂抑制皮肤浅部真菌的试验研究
土黄洗剂抑制皮肤浅部真菌的试验研究 【摘要】目的试验研究土黄洗剂对临床分离真菌菌株的抑制和杀灭作用。验证自拟中 药方土黄洗剂治疗皮肤浅部真菌病的药效。方法采用药基混合法和琼脂扩散法对 3 种常见致 病真菌进行土黄洗剂体外抗菌活性、最低抑菌浓度测定。结果土黄洗剂对临床分离常见致病 菌红色毛癣菌、须癣毛癣菌、白色念珠菌均具有抑制作用，最低抑菌浓度分别为12.5mg/ml，25 mg/ml，25 mg/ml。结论土黄洗剂对常见皮肤浅部真菌有抑制和杀灭作用。本研究为临床 应用纯中药制剂治疗皮肤浅部真菌病提供了科学依据,证实了土黄洗剂科学性及可行性。 【关键词】土黄洗剂；真菌菌株；抑菌试验；中药推广 浅部真菌病［1］指是皮肤科最常见的感染性疾病之一，它主要是以皮肤癣菌、马拉色 菌以及念珠菌等病原菌为主，侵袭人体局部皮肤的真菌感染，如甲板、毛发或粘膜等处。该 病占所有皮肤病发病率的25%左右。目前临床上使用抗真菌药物治疗该病，但是无论是从药 物的高效性、广谱性、低毒副作用以及耐药性等方面均无令人满意的疗效。因此，从抗真菌 中草药中提取有效的抗真菌活性成分，以达到更安全、抗菌谱更广的临床疗效成为了学者重 点研究的一个方向。土黄洗剂是笔者根据中医药理论及其抗真菌作用自拟组成的方剂,，并经 过临床应用取得了较好疗效。在此基础上,进一步进行抑菌试验，观察土黄洗剂对临床常见红 色毛癣菌、须癣毛癣菌及白色念珠菌的抑制和杀灭作用。现报道如下。 材料与方法 1．药物：土黄洗剂（由安丘人民医院药房提供）成分含土荆皮25g、黄柏25g、黄精 25g、空心草25g、苦参20g、百部20g、蛇床子20g、蒺藜20g和冰片20g。上述药材均为市 售饮片, 符合中国药典的标准。将上述中药材用清水清洗干净并切碎，筛除杂质后加入清水1000ml并浸泡约90min，然后文火煎煮30分钟，将煎液保存在干净容器内，相同方法在煎 煮依次，将两次的煎液合并，通过低温缓慢加热使煎液蒸发浓缩至每毫升含生药1g。将最终 的药汤放置于4℃冰箱内冷藏保存。 2．菌株：红色毛癣菌1株、须癣毛癣菌1株、白色念珠菌1株。以上为潍坊医学院微 生物教研室保存菌种。 3．仪器和试剂：沙氏琼脂培养基(SDA)：蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，将上述所有物品混合后加入氯霉素200mg，在121℃高压条件下灭菌 15min，室温 下冷却后，4℃冰箱冷藏保存备用。主要设备：恒温箱、试管、高压消毒锅、冰箱、天平、 超净工作台等。 4．方法与步骤：红色毛癣菌、须癣毛癣菌，2种4株接种于沙氏琼脂培养基，在26℃ 温度下培养2周，白念珠菌3株接种于 SDA培养基，在37℃温度下培养 48h，挑取单克隆菌 落继续培养，依据菌落形态及产红特征、尿素酶试验和毛发穿孔试验，并依据培养的镜下结 构特征进行鉴定［2］。根据倍比稀释法，将分别制得的药物浓度为200mg/ml、100mg/ml、50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml、6.25mg/ml、3.13mg/ml、1.51mg/ml的药物培养基，注入试管，分别接种待测试菌种，标记为1～8号，9号试管为阳性对照（生长对照），10号试管 为阴性对照（空白对照）。同一个菌种每种浓度接种3管，将已接种红色毛癣菌、须癣毛癣 菌置于25℃恒温箱2周，将已经接种3株白念珠菌菌悬液的含药培养基放置于37℃温箱中，观察其孵育 24～ 48h后真菌的生长情况。在培养结束后，通过肉眼在自然光线下进行判断。 对于实验结果的判定需要的前提是：生长对照管得菌落生长情况良好，空白对照管得培养基 清晰。然后将每管菌落生长情况与对照组进行对比，以最低药物浓度无培养物生长的药基管 为MIC终点［3］，该药物浓度即为该味药该提取成分对该种菌的MIC值。 5．杀菌试验（MBC的测定）:红色毛癣菌、须癣毛癣菌、白念珠菌 3种7株受试菌的杀 菌试验：将制备好的沙氏液基3ml于121℃、0.15MPa条件下进行15min灭菌，并在无菌条
临床微生物学检验(理论)真菌部分 重点整理
第一节概述 真菌的特点：种类繁多、分布极广、与人关系密切 一、定义：真菌(fungus)是一类具有典型细胞核，有核膜和核仁，胞浆内有完整的细胞器，无根、茎、叶，不含叶绿素，无光合色素，细胞壁含几丁质和纤维素的，单细胞或多细胞异养真核细胞型微生物。 细胞壁：不含肽聚糖，含几丁质及纤维素 二、分类 临床分类(按致病部位)：浅部真菌、深部真菌 形态学分类：单细胞真菌、多细胞真菌 真菌的形态与结构在鉴定上起重要作用 三、生物学形状 （一）形态与结构 1、单细胞真菌：圆形或卵圆形，包括酵母型和类酵母型真菌。 酵母型真菌以芽生方式繁殖，芽生孢子成熟后脱落成独立个体，不产生菌丝，其菌落与细菌菌落相似。 类酵母型真菌也以芽生方式繁殖，菌落与酵母型真菌相似，但它产生的芽体不从母细胞上脱落，而是延伸入培养基内形成假菌丝。 对人致病的主要有新生隐球菌和白假丝酵母菌。 2、多细胞真菌：由菌丝和孢子两种基本结构组成 A.菌丝：在环境适宜情况下由孢子萌发长出芽管，逐渐延长呈丝状，称菌丝。 按照功能分为： ①营养菌丝：伸入培养基；②气生菌丝：露出培养基向空气中生长；③生殖菌丝 按照结构分为： ①有隔菌丝：多数致病性真菌；②无隔菌丝。 菌丝的形态大小不一(螺旋状/球拍状/鹿角状)、菌丝间有无分隔、形状特征(绒毛状/絮状/粉末状) →鉴别真菌 B.孢子：由生殖菌丝产生的一种繁殖体，是真菌的繁殖结构。有有性孢子和无性孢子两类（a）有性孢子：同一菌体或不同菌体上的2个细胞融合经减数分裂形成。包括：卵孢子、接合孢子、子囊孢子、担子孢子，多为非致病性真菌所产生。 （b）无性孢子：菌丝上的细胞分化或出芽生成，不经两性细胞的配合。病原性真菌大多形成无性孢子。 可分为三种 ①分生孢子：又可分为大分生孢子（其大小、细胞数和颜色是鉴定的重要依据）、小分生孢子（真菌都能产生，诊断意义不大） ②孢子囊孢子 ③叶状孢子：又可分为：芽生孢子（一般芽生孢子生长到一定大小仍不与母体脱离，则形成假菌丝）、厚膜孢子（是真菌的一种休眠形态）、关节孢子 真菌种类不同，孢子形状大小也不同→鉴别真菌 （二）培养特性 1、培养条件 营养：一般细菌用培养基上都能生长，常用沙保(Sabouraud)培养基 温度：22 ℃~28℃(深部真菌：28 ℃/ 37℃) pH：4.0~6.0 (弱酸性) 需氧、湿度高
真菌检验
真菌检验 医学真菌学检查是诊断真菌病的重要依据,随着真菌感染病例的日益增多,对实验室的诊断也提出了更高的要求.不论是患者浅部或深部感染诊断,几乎全依赖于临床标本的真菌学检查.特别是系统性真菌感染,其早期特异的诊断方法是挽救患者生命的关键,而病原真菌的形态结构十分多样,在不同条件下同一真菌也可有不同特点的形态.因此,在真菌的实验室检查中,必须熟练掌握各类真菌的形态特征以及在不同条件下的演变规律,才能获得对致病真菌正确的诊断.目前真菌感染的实验室检查方法主要包括常规检查法和特殊检查法两类.常规检查法主要包括①形态学检查(直接镜检+染色镜检).②培养检查.③组织病理学检查.特殊检查主要包括①血清学方法.②分子生物学方法. 一,进行真菌实验室诊断的注意事项 ①应有独立实验室,不应与其他细菌,病毒等实验室共用,以防发生相互污染.②在每天工作前与工作后,工作台均要以消毒水例如5%石碳酸或0.5%过氧乙酸擦拭,如遇操作台被真菌或标本污染,应即覆盖纸巾,并用5%石碳酸消毒20min,切忌工作台污染后即用水冲洗,以免污染扩散.③培养菌检体及真菌污染的物质在丢弃前,必须高压灭菌或焚烧.④在进行真菌检查时,不可试着闻平板培养基特殊的气味.⑤不可对Histoplasma capsulatum 以及Coccidioides immitis进行载玻片培养技术,因为其等具有高度感染性的孢子能够随着空气传播.⑥实验室禁止任意养花,草,动物等生物,以防实验污染.⑦工作环境应定期消毒.一般紫外线照射不能杀灭真菌,应用40%甲醛(可于每4㎡空间用35ml 40%甲醛加18g高锰酸钾)在密闭情况下熏蒸24h,或用环氧乙烷进行消毒,每2～4周消毒1次.⑧如果用平板培养基接种标本,必须将平板培养基密封,以免发生危险,在不常做真菌检测的实验室,最安全的培养方法是利用含有棉花塞的试管培养基(使空气能够循环).⑨美国梅育诊所主张利用平板培养基进行真菌的分离,步骤如下平板培养基必须在生物安全箱内操作及检查.平板培养必须用胶带封好,平板培养基必须含30ml的量,并保持培养箱60%以上的湿度,同时增加琼脂的浓度至2%,以免脱水.⑩真菌的诊断,需要经验的累积及备有良好的图谱参考书. 二,分离及鉴定真菌的培养基 配制培养基的一般原则 ①各成分混匀后以文火缓慢加热,并不断搅拌,煮沸1min,过热会破坏有效成分.②分装试管应在高压灭菌前,而分装平皿应在高压灭菌后.③高压灭菌一般在118～121磅,10～15min.④需加血液或不能高压的成分如抗生素,应在培养基冷却至50 左右时加入混匀.⑤试管分装量约7~8ml,平皿约15ml,如需培养4～6周,平皿内应有35～40ml的量.培养基中抗生素的浓度和添加方法氯霉素,庆大霉素和放线菌酮能耐热,可在培养基高压灭菌前加入,其他抗生素均在培养基高压灭菌后冷却至45℃～50℃时加入.青霉素20～100μgml,链霉素40～200μgml,氯霉素50μgml,放线菌酮500μgml,庆大霉素5μgml. 分离和鉴定真菌的培养基 各种医学真菌所用培养基的成分,又可根据不同要求,分成分离,富集,选择,特性研究等含不同成分培养基,具体见表. 表分离鉴定真菌培养基分类表 培养基种类分离用培养基使用目的 1.Brain heart infusion agar 分离腐生性及病原性真菌 2.Brain heart infusion agar with antibiotics 分离除了皮肤丝状真菌以外的真菌 3.Brain heart infusion biphasic blood Culture bottles 从血液中分离真菌 4.Dermatophyte test medium 分离皮肤丝状菌,建议仅做筛检用 5.Inhibitory mold agar 分离除了皮肤丝状真菌以外的真菌
真菌检测步骤(1)
真菌检查步骤 1.采集标本浅部真菌的标本有毛发、皮屑、甲屑、痂等，标本在分离前常先用75%的乙醇消毒。深部真菌的标本可根据情况取痰、尿液、粪便、脓液、口腔或阴道分泌物、血液、脑脊液、各种穿刺液和活检组织，采集标本时应注意无菌操作。 2.检查方法真菌检查的方法主要有： （1）直接涂片：为最简单而重要的诊断方法。取标本置玻片上，加一滴10%KOH溶液，盖上盖玻片，在酒精灯火焰上稍加热，待标本溶解，轻轻加压盖玻片使标本透明即可镜检。可用于检查有无菌丝或孢子，但不能确定菌种。 （2）墨汁涂片：用于检查隐球菌及其他有荚膜的孢子。医学教育|网搜集整理方法是取一小滴墨汁与标本（如脑脊液）混合，盖上盖玻片后直接镜检。 （3）涂片或组织切片染色：涂片染色可更好地显示真菌形态和结构。革兰染色适用于白念珠菌、孢子丝菌等；瑞氏染色适用于组织胞浆菌；组织切片通常用PAS染色，多数真菌可被染成红色。 （4）培养检查：可提高真菌检出率，并能确定菌种。标本接种于葡萄糖蛋白胨琼脂培养基上，置室温或37℃培养1～3周，必要时可行玻片小培养协助鉴定。菌种鉴定常根据菌落的形态及显微镜下形态判断，对某些真菌，有时尚需配合其他鉴别培养基、生化反应、分子生物学方法确定。 四、真菌学检验的基本技术 （一）直接镜检 是最简单也是最有用的实验室诊断方法，常用的方法有：①氢氧化钾/复方氢氧化钾法：标本置于载玻片上，加一滴浮载液，盖上盖玻片，放置片刻或微加热，即在火焰上快速通过2～3次，不应使其沸腾，以免结晶，然后轻压盖玻片，驱逐气泡并将标本压薄，用棉拭或吸水纸吸去周围溢液，置于显微镜下检查。检查时应遮去强光，先在低倍镜下检查有无菌丝和孢子，然后用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小和排列等。浮载液：A.10%~20%的KOH。配方：氢氧化钾10～20g，蒸馏水加至100ml，待氢氧化钾完全溶解后揺匀存放在塑料瓶内，适用于皮屑、甲屑、毛发、痂皮、痰、粪便、组织、耵聍等的检查。B.复方氢氧化钾溶液配方：氢氧化钾（AR）10g，二甲基亚砜（AR）40ml,甘油50ml, 蒸馏水加至100ml,配制方法：将氢氧化钾先加入30ml蒸馏水中溶解后，再依次加入DMSO、甘油揺匀后，用蒸馏水加到100ml，装入塑料瓶内。此配方的优点是：配方中加DMSO，能促进角质的溶解，有甘油涂片不易干，不易制成氢氧化钾结晶，氢氧化钾的浓度相对低，腐蚀性亦低，为进行大面积普查或大批量采集标本作镜检带来了方便。②胶纸粘贴法：用 1cm×1.5cm的透明双面胶带贴于取材部位数分钟后自取材部位揭下，撕去复带在上面的底板纸贴在载玻片上，使原贴在取材部位的一面暴露在上面，再进行革兰染色或过碘酸锡夫染色，在操作过程中应注意双向胶带粘贴在载玻片上时不可贴反，而且要充分展平，否则影响观察。③涂片染色检查法：在载玻片上滴1滴生理盐水，将所采集的标本均匀涂在载玻片上，自然干燥后，火焰固定或甲醇固定。再选择适当的染色方法，染色后，以高倍镜或油镜观察。常见镜检染色方法有：①革兰染色。所有真菌、放线菌均为革兰染色阳性，被染成蓝黑色。适用于酵母菌、孢子丝菌、组织孢浆菌及诺卡菌、放线菌的感染。②乳酸酚棉蓝染色：用于
最新医学真菌检验技术资料
医学真菌学检查是诊断真菌病的重要依据，随着真菌感染病例的日益增多，对实验室的诊断也提出了更高的要求。不论是患者浅部或深部感染诊断，几乎全依赖于临床标本的真菌学检查。特别是系统性真菌感染，其早期特异的诊断方法是挽救患者生命的关键，而病原真菌的形态结构十分多样，在不同条件下同一真菌也可有不同特点的形态。因此，在真菌的实验室检查中，必须熟练掌握各类真菌的形态特征以及在不同条件下的演变规律，才能获得对致病真菌正确的诊断。目前真菌感染的实验室检查方法主要包括常规检查法和特殊检查法两类。常规检查法主要包括：①形态学检查(直接镜检+染色镜检)。②培养检查。③组织病理学检查。特殊检查主要包括：①血清学方法。②分子生物学方法。 一、进行真菌实验室诊断的注意事项 ①应有独立实验室，不应与其他细菌、病毒等实验室共用，以防发生相互污染。②在每天工作前与工作后，工作台均要以消毒水例如5%石碳酸或0.5%过氧乙酸擦拭，如遇操作台被真菌或标本污染，应即覆盖纸巾，并用5%石碳酸消毒20min，切忌工作台污染后即用水冲洗，以免污染扩散。③培养菌检体及真菌污染的物质在丢弃前，必须高压灭菌或焚烧。④在进行真菌检查时，不可试着闻平板培养基特殊的气味。⑤不可对Histoplasma capsulatum 以及Coccidioides immitis进行载玻片培养技术，因为其等具有高度感染性的孢子能够随着空气传播。⑥实验室禁止任意养花、草、动物等生物，以防实验污染。⑦工作环境应定期消毒。一般紫外线照射不能杀灭真菌，应用40%甲醛(可于每4㎡空间用35ml 40%甲醛加18g高锰酸钾在密闭情况下熏蒸24h，或用环氧乙烷进行消毒，每2～4周消毒1次。⑧如果用平板培养基接种标本，必须将平板培养基密封，以免发生危险，在不常做真菌检测的实验室，最安全的培养方法是利用含有棉花塞的试管培养基(使空气能够循环)。⑨美国梅育诊所主张利用平板培养基进行真菌的分离，步骤如下：平板培养基必须在生物安全箱内操作及检查。平板培养必须用胶带封好，平板培养基必须含30ml 的量，并保持培养箱60%以上的湿度，同时增加琼脂的浓度至2%，以免脱水。⑩真菌的诊断，需要经验的累积及备有良好的图谱参考书。 二、分离及鉴定真菌的培养基 (一)配制培养基的一般原则 ①各成分混匀后以文火缓慢加热，并不断搅拌，煮沸1min，过热会破坏有效成分。②分装试管应在高压灭菌前，而分装平皿应在高压灭菌后。③高压灭菌一般在118～121磅，10～15min。④需加血液或不能高压的成分如抗生素，应在培养基冷却至50左右时加入混匀。⑤试管分装量约7~8ml，平皿约15ml，如需培养4～6周，平皿内应有35～40ml的量。培养基中抗生素的浓度和添加方法：氯霉素、庆大霉素和放线菌酮能耐热，可在培养基高压灭菌前加入，其他抗生素均在培养基高压灭菌后冷却至45℃～50℃时加入。青霉素20～100μg/ml，链霉素40～200μg/ml，氯霉素50μg/ml，放线菌酮500μg/ml，庆大霉素5μg/ml。 (二)分离和鉴定真菌的培养基 各种医学真菌所用培养基的成分，又可根据不同要求，分成分离、富集、选择、特性研究等含不同成分培养基，具体见表。 表分离鉴定真菌培养基分类表
真菌(1-3)-β-d葡聚糖检测操作sop文件
真菌（1-3）-β-D葡聚糖测定规范操作 1.目的 建立真菌（1-3）-β-D葡聚糖检测标准操作规范，保证实验结果的准确性。 2.授权操作人 经培训合格的微生物实验室检验人员。 3.实验原理 （1-3）-β-D葡聚糖检测原理：真菌（1-3）-β-D葡聚糖激活酶反应主剂中的G因子后形成凝固蛋白，根据其所引起的浊度变化对真菌（1-3）-β-D葡聚糖浓度进行定量测定。 4．产品性能指标 4.1 灵敏度10pg/ml 4.2 精密度批间CV≤10% 。 4.3 准确性回收率75-125%。 4.4 标准曲线相关系数r绝对值≥0.980 5．实验组成 5.1实验仪器及器具： MB-80微生物快速动态检测系统、洁净工作台、低速离心机、恒温仪，20~200μl 加样器、100~1000μl加样器、旋涡混合器、定时器。 5.2实验耗材： 200μl无热原吸头、1000μl无热原吸头、无热原平底试管、无热原真空采血管。 5.3试剂盒组成： 真菌（1-3）-β-D 葡聚糖检测试剂盒（光度法）： 试剂盒包括反应主剂和样品处理液。 6．工作环境 相对湿度：20%~80%； 温度控制：10~30℃； 电源电压：220V±10%，50Hz±2%。 7．标本采集及保存 7. 1检测样本： 血液、脑脊液、胸腹水、肺泡灌洗液等。 7.2采集要求： 采样过程要求无菌操作，用专用的无热原真空采血管（肝素类抗凝）。 常规病人早上用药治疗前采血/取样（血透患者透析前采血）。 7.3样本保存： 样本采集后应在3000转/分进行离心，若不能及时检测，应将血浆转移至无热原转移
管内，在-20℃冰箱中冷冻保存，一周内使用。 8．操作程序 8.1 打开MB-80微生物快速动态检测系统主机、电脑及恒温仪预热30min。 8.2 打开MB-80微生物快速动态检测系统软件，录入病人信息、样本种类及检测项目等 信息后点击采集。 8.3 血液前处理过程，无菌操作，用专用无热原真空采血管（肝素类抗凝）抽取静脉血 4ml轻轻混匀，按转速3000r/min进行离心1分钟，得到富含血小板血浆。 8.4 取上述富含血小板血浆100μl，加入到样品处理液中，轻轻摇匀10秒后插入恒温仪 加热区中进行70℃干热10min。 8.5干热结束后，将前处理液冷却5min，至室温后取出（取出时切忌震荡）。 8.6 取上述前处理液中上清液200μl加入到反应主剂中，轻轻混匀（一般混匀10秒即可）， 待完全溶解至透明后，全部移液至平底试管中(不要产生气泡)，立即插入MB-80微生物快速动态检测系统中进行检测。 8.7 反应结束后仪器自动计算结果并保存。 待测血浆样品制备、检测示意图 9．操作注意事项 9.1预热采集 在进行试验之前，仪器一定要提前预热30min，达到工作温度后，按要求填写表头信息，完毕后点击采集，使仪器处于采集状态后再进行试验。 9.2 样本预处理
【干货】真菌检测中常见问题专家解答
【干货】真菌检测中常见问题专家解答 近年来，随着恶性肿瘤的高发、艾滋病的流行、化疗药物、广谱抗生素、糖皮质激素和免疫抑制剂等药物的广泛使用，以及人工导管等侵入性操作、器官移植等有创诊疗技术的应用，由真菌所引起的感染日益成为临床各科室面临的巨大挑战。为了提高临床诊断水平，加强真菌的检验能力显得至关重要，现在临床微生物实验室有关真菌检验的常见问题汇总如下，供大家学习参考。1、为什么培养要设定 35 C? 实验室通常将孵箱温度设定为 35 C,是为了防止温度的波动对细菌或真菌生长的影响。临床常见细菌的最适生长温度为33?37 C （嗜热，嗜中温菌除外，占少数），设定为35C时上下波动2C对培养无影响，如设定为37C C显然就不合适了。至于真菌培养 ,要视标本来源而定。一般怀疑浅部真菌感染的标本如皮屑、甲屑、头屑及毛发等分离培养于26?28 C。来源于人体深部组织的标本如痰、胸腹水、血及骨髓深部脓肿等建议放35 C培养，是刚离体的标本在 35 C更接近于人体温度，其次临床最常见的白念珠菌在35 C能形成更为典型的伪 足样菌落，这与血清出芽试验在 35 C做是同样的道理。同时’ 来源于35 C初分离的光滑念珠菌具有更高的酶活性。怀疑温 度型双相真菌感染或个别真菌需要较高温度生长时则需要两种温度同时培养。还要注意培养环境的湿度 ,一般要求大于 60%,如果培养箱的湿度不够 ,最好在平板附近放置盛有无菌水的容器以保证湿
度。 2、CO2 对真菌生长影响大吗 ?真菌属于异养型微生物，主要从有机化合物中获得碳源 ,而自养型微生物才需要从 CO2 中获得碳源，所以真菌一般不需要在二氧化碳环境中培养，而且CO2 对真菌的生长和繁殖均不利 ,但一定浓度可刺激孢子形成。 3、在血培养中培养出真菌 2 次，但是患儿没有临床表现，而且临床也没用抗真菌药患儿就好了，是考虑污染吗 ? 这种情况要判断是否为污染菌，调查采血过程是否规范、血瓶转运过程是否符合要求、针孔是否适当封口、转运箱是否受到污染等众多因素，最关键的还是患者的临床表现，如没有真菌感染的症状，要么考虑污染，要么考虑定植（可能性不大）。 4、我们基层医院实际工作中做阴道分泌物真菌培养，生化鉴定几乎做不了，很多直接报白念珠菌，这样合适吗？这样做不合适。目前有些检验科甚至分不清酵母菌和霉菌，在阴道白带、尿液和粪便中镜检发现念珠菌后报告为“找到霉菌”。霉菌是指丝状多细胞真菌；酵母菌是指单细胞形态的真菌，二者不可混为一谈。阴道中感染的酵母菌大多是白念珠菌，但不排除其他酵母菌。克柔念珠菌对氟康唑和5- 氟胞嘧啶天然耐药，如果遇到类似存在天然耐药的菌株，会影响后续的治疗。 5、痰标本中少量念珠菌需要在报告中体现吗?还是不报告 ? 标本要求和检验程序用要体现，临床医生会综合考虑。虽然 白色念珠菌导致肺部真菌感染的概率很小，遇到痰标本真菌培养中分离出该真菌，还是建议报告，临床医生结合影像学结果综合考虑。
临床医学检验技师初级(师)微生物学及检验(立克次体、真菌学、浅部真菌感染、深部真菌感染)-试卷1
临床医学检验技师初级（师）微生物学及检验（立克次体、真菌学、浅部真菌感染、深部真菌感染）-试卷1 (总分：104.00，做题时间：90分钟) 一、 A2型题(总题数：1，分数：4.00) 某患者，腿部皮肤被叮咬，局部出现溃疡，伴高热，皮疹，淋巴结肿大，肝脾肿大。外斐反应：抗体效价1：320。（分数：4.00） (1).根据以上描述，该患者可能感染的微生物或疾病是（分数：2.00） A.沙门菌属 B.恙虫病√ C.流行性斑疹伤寒 D.结核分枝杆菌 E.伤寒沙门菌 解析： (2).该病的传播媒介可能是（分数：2.00） A.人虱 B.鼠虱 C.恙螨√ D.蜱 E.蚊子 解析：解析：恙虫病临床症状有发热、虫咬处溃疡、皮疹，淋巴结肿大等特征。恙虫病的传播媒介是恙螨。 二、 B1型题(总题数：1，分数：8.00) A．人虱B．鼠虱、鼠蚤C．恙螨D．蝉E．蚊（分数：8.00） (1).地方性斑疹伤寒的传播媒介是（分数：2.00） A. B. √ C. D. E. 解析： (2).流行性斑疹伤寒的传播媒介是（分数：2.00） A. √ B. C. D. E. 解析： (3).Q热的传播媒介是（分数：2.00） A. B. C. D. √ E. 解析： (4).恙虫病的传播媒介是（分数：2.00）
B. C. √ D. E. 解析：解析：流行性斑疹伤寒的病原体为普氏立克次体，其传播媒介是人虱；地方性斑疹伤寒的病原体为莫氏立克次体(又称斑疹伤寒立克次体)，其传播媒介是鼠虱、鼠蚤；恙虫病的病原体为恙虫病立克次体，其传播媒介是恙螨；Q热的病原体为Q热柯克斯体，其传播媒介是蝉。 三、 A1型题(总题数：35，分数：70.00) 1.关于立克次体说法错误的是 （分数：2.00） A.革兰染色阴性 B.均为专性寄生在宿主细胞内繁殖√ C.大多为人畜共患病原体 D.对抗生素敏感 E.以二分裂方式繁殖 解析：解析：本题主要考查立克次体的共性。立克次体除极少数外均专性寄生在宿主细胞内繁殖。 2.地方性斑疹伤寒是由以下哪种微生物感染引起的 （分数：2.00） A.普氏立克次体 B.莫氏立克次体√ C.恙虫病东方体 D.螺旋体 E.肺炎支原体 解析：解析：地方性斑疹伤寒的病原体为莫氏立克次体，流行性斑疹伤寒的病原体为普氏立克次体。 3.普氏立克次体感染导致的疾病是 （分数：2.00） A.Q热 B.恙虫病 C.流行性斑疹伤寒√ D.结核 E.伤寒 解析：解析：流行性斑疹伤寒的病原体是普氏立克次体。 4.易使外-斐反应呈现假阳性的疾病是 （分数：2.00） A.流感 B.变形杆菌感染√ C.肺炎 D.痢疾 E.沙眼 解析：解析：外斐反应是用变形杆菌OX 19、OX 2和OX k 3种抗原在玻片上做凝集试验。缺乏敏感性和特异性，假阳性反应还发生在变形杆菌尿路感染、伤寒、钩端螺旋体病、回归热、疟疾及各种原因引起的严重的肝病的患者血清检查，孕妇也往往呈假阳性反应。 5.既是恙虫病东方体的寄生宿主、储存宿主，又是传播媒介的是 （分数：2.00） A.恙螨√ B.鼠类 C.牛 D.马