细胞周期同步化常用的方法
细胞周期同步化PPT课件
2021/3/7
CHENLI
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（1）.人工选择同步化
• 人工选择同步化：人为的将处于不同细胞 周期的细胞分离开，从而获得不同时期细 胞群体的方法。
• 人工选择同步化的方法：
（1）.有丝分裂选择法密
（2）度梯度离心法
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有丝分裂选择法（反复振摇法）
• 利用有丝分裂细胞变圆隆起，与培养皿的 附着性降低的特点。此法的特点是细胞不 受药物等的伤害，同步化程度高，放入 37℃环境中，收集的细胞即可同步分裂。 缺点是分裂细胞一般占1%-2 ％，分离的细 胞数量少。
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同步化方法
• 1.自然同步化 • 2.人工同步化 • （1）人工选择同步化 • （2）人工诱导同步化
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1.自然同步化
• 自然同步化在自然界中，细胞自然同步化 的现象在动、植物及粘菌中都有所发现， 它们不受人为条件的干扰，因而有可能在 接近自然的条件下进行观察。
• 缺点：自然同步化受到很多条件的限制。
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2.2 DNA分裂中期阻断法
• 某些药物可抑制微管的聚合，将细胞阻断 于有丝分裂中期。非平衡生长问题不十分 明显。但长时阻断释放后许多细胞不能恢 复正常的细胞周期。
• 中期阻断药物最常用者为秋水仙素或其衍 生物秋水仙酰胺。
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DNA分裂中期阻断法的优缺点
• 优点：操作简便，效率高 • 缺点：这些药物的毒性相对较大，若长时
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DNA合成阻断法优缺点
• 优点：同步化程度高，适用于任何培养体 系，可将几乎所有的细胞同步化。
nocodazole同步化方法
nocodazole同步化方法
nocodazole是一种微管解聚剂，常用于细胞周期研究中的细胞
同步化。
细胞同步化是指使细胞群体中的细胞几乎同时进入同一细
胞周期阶段的方法。
使用nocodazole进行细胞同步化的方法如下：
1. 处理细胞，将培养基中含有适当浓度的nocodazole的培养
基加入到细胞培养皿中，通常浓度为10-100 μM。
细胞在nocodazole的作用下会停留在有丝分裂中期，此时微管解聚，细胞
周期受阻。
2. 细胞采集，根据研究需要，可以选择适当的时间点收集细胞。
通常在nocodazole处理后6-18小时进行采集，以确保细胞大部分
处于有丝分裂中期。
3. 细胞处理，收集的细胞可以用于进一步的实验，如免疫荧光
染色、蛋白质组学分析等。
此时可以观察到细胞核处于分裂中期的
形态。
需要注意的是，nocodazole处理可能会对细胞产生毒性作用，
因此在使用过程中需要控制浓度和处理时间，以避免对细胞产生不
可逆的影响。
另外，nocodazole的使用也需要根据具体的研究目的
和细胞系进行优化，以获得最佳的同步效果。
总之，nocodazole是一种常用的细胞同步化方法，通过干扰微
管动力学来阻滞细胞周期，为细胞周期研究提供了重要的工具。
在
使用时需要注意控制处理条件，以确保同步效果和细胞的生存状态。
细胞同步化的方法和原理
细胞同步化的方法和原理细胞同步化是一种实验技术，用于使细胞在特定的时间点进入同一阶段，以便研究细胞周期中的特定过程。
细胞同步化有多种方法和原理，下面将详细介绍几种常用的细胞同步化方法。
1.药物处理法：药物可以通过抑制或促进细胞周期中的特定步骤来实现细胞同步化。
常用的细胞同步化药物包括阿霉素（thymidine）、奎宁（quinine）、羟基尿嘧啶（hydroxyurea）、科莫西定（colcemid）等。
这些药物可以通过不同的机制延长或缩短特定阶段的时间，从而使细胞同时进入同一阶段。
以阿霉素为例，它是一种嘌呤类物质，可抑制DNA合成过程。
将细胞在含有阿霉素的培养基中培养一段时间后，移除阿霉素，细胞会在短时间内同时进入S期。
这是因为细胞会在阿霉素的抑制下停滞在G1/S检查点，一旦移除阿霉素，细胞便立即进入S期完成DNA复制。
2.紫杉醇处理法：紫杉醇是一种微管相关的药物，可以抑制纺锤体的动态稳定，阻碍有丝分裂的进行。
在细胞同步化实验中，可以通过紫杉醇处理使细胞停滞在G2期，待紫杉醇去除后，细胞会几乎同时进入有丝分裂。
紫杉醇的作用机制是结合并稳定微管，抑制微管的动态重组过程，导致纺锤体无法形成或功能异常，从而阻碍有丝分裂过程的进行。
这种方法的优点是同步化效果好，适用范围广，但缺点是对细胞的影响较大，使用时需要谨慎操作。
3.温度敏感细胞株法：温度敏感细胞株是一种特殊的细胞系，其细胞周期的某个阶段对温度敏感。
通过调节培养温度，可以使细胞同时进入或阻碍特定阶段。
例如，一些温度敏感的蛋白质在非限制温度下正常工作，在限制温度下失去功能。
因此，将这些细胞株在限制温度下培养一段时间后，再将温度恢复到非限制温度，细胞便会同时进入同一阶段。
温度敏感细胞株同步化的原理是利用温度对特定蛋白质的影响，调控细胞周期的进程。
温度敏感蛋白质的功能通常与物种的生存和繁殖相关，因此这种方法适用于一些特定类型的细胞。
4.同步化电流冲击法：电流冲击法是一种通过施加短暂的电流刺激，使细胞进入特定阶段的方法。
细胞同步化的方法和原理
细胞同步化的方法和原理
细胞同步化是一种通过控制细胞周期，使大量细胞在相同时间点进入特定细胞周期阶段的方法。
主要应用于细胞生物学研究、细胞遗传学和细胞生理学等领域。
常用的细胞同步化方法包括药物处理法、放射线辐射法和营养限制法。
下面将详细介绍这些方法及其原理：
1. 药物处理法：通过给细胞添加特定的化学物质来控制细胞周期。
例如，使用细胞周期抑制剂（如阿霉素、异烟肼、氟乙酰胺等）可以阻止细胞进入或退出特定的细胞周期阶段，从而实现细胞同步化。
此外，还可以利用细胞周期促进剂（如脱氧胸腺嘧啶、多巴胺等）来促进细胞进入特定的细胞周期阶段。
2. 放射线辐射法：通过短暂暴露细胞于放射线（如X射线或紫外线），可引发DNA损伤和细胞凋亡等反应，从而导致细胞同步化。
在辐射后，生存的细胞会重新开始增殖，并在相同的时间点进入细胞周期特定阶段。
3. 营养限制法：通过控制细胞培养基的营养成分，如氨基酸、葡萄糖等，可以限制细胞的生长和增殖速度，从而实现细胞同步化。
在特定的营养条件下，细胞会在一定时间内停滞于同一个细胞周期阶段。
这些方法的原理是通过干扰细胞周期的正常进行，使大量细胞在特定的细胞周期阶段同时进入或停滞，以便研究某一特定阶段的细胞生理过程或细胞周期调控机制。
不同的方法适用于不同类型的细胞和
研究目标，选择合适的方法需要根据具体实验需求和细胞特性来确定。
细胞周期同步化
1) 有丝分裂选择法：使单层培养的细胞处于对 数增殖期，此时分裂活跃，分裂指数高,MI高。 有丝分裂细胞变圆隆起，与培养皿的附着性低， 此时轻轻振荡，M期细胞脱离器壁，悬浮于培养 液中，收集培养液，再加入新鲜培养液，依法继 续收集，这样每隔1h摇一次并收获一次，倾出 培养液贮存于2~4℃冰箱中保存可连续收集24h， 则可获得一定数量的中期细胞。其优点是，操作 简单，同步化程度高，细胞不受药物伤害，缺点 是获得的细胞数量较少。（分裂细胞约占1%～ 2%） 2）细胞沉降分离法：不同时期的细胞体积不同， 而细胞在给定离心场中沉降的速度与其半径的平 方成正比，因此可用离心的方法分离。其优点是 可用于任何悬浮培养的细胞，缺点是同步化程度 较低。
对数期的单层培细胞——震荡培养瓶—— 悬浮培养液——离心——培养——一定数量的分 裂期细胞
优点是细胞未经任何药物处理，细胞同步化效率高。 优点 缺点是分离的细胞数量少。 缺点
（2）另一个方法是密度梯度离心法。
如裂殖酵母，不同时期的细胞体积和质量 上差别显著。
优点是方法简单省时，效率高，成本低。缺点 缺点是对 优点 缺点 大多数种类的细胞并不适用。
细胞周期同步化
——0912402038陈禄芝
细胞周期同步化
借助某种实验手段(自然地或经人为地), 使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细 胞停留在同一时相的现象。 细胞周期同步化分：自然同步化和人 工同步化。
自然同步化：是自然界存在的现象, 在 自然同步化 动、植物细胞都有发现。 1.多核类；如粘菌只进行核分裂，而 不发生胞质分裂，形成多核体。数量众多 的核处于同一细胞质中，进行同步化分裂， 使细胞核达108，体积达5~6cm。疟原虫也 具有类似的情况。 2.某些水生动物的受精卵； 3.增殖抑制解除后的同步分裂。
细胞周期同步化
细胞周期同步化借助某种实验手段(自然地或经人为地),使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相的现象。
细胞周期同步化分：自然同步化和人工同步化。
自然同步化：是自然界存在的现象, 在动、植物细胞都有发现。
它们不受人为条件的干扰, 因而有可能在接近自然的条件下进行观察, 但自然同步化的细胞群体受到诸多条件的限制, 对结果有很大的影响。
人工同步化：是利用细胞培养的方法, 用各种理化因素处理获得的同步化生长的细胞。
常用的细胞人工同步化的方法分为选择同步化、诱导同步化或者两者的结合。
同步化分类及方法（一）自然同步化1．多核体如粘菌只进行核分裂，而不发生胞质分裂，形成多核体。
数量众多的核处于同一细胞质中，进行同步化分裂，使细胞核达108，体积达5~6cm。
疟原虫也具有类似的情况。
2．某些水生动物的受精卵如海胆卵可以同时授精，最初的3次细胞分裂是同步的，再如大量海参卵受精后，前9次细胞分裂都是同步化进行的。
3．增殖抑制解除后的同步分裂如真菌的休眠孢子移入适宜环境后，它们一起发芽，同步分裂。
（二）人工同步化1．选择同步化1) 有丝分裂选择法：使单层培养的细胞处于对数增殖期，此时分裂活跃，分裂指数高,MI高。
有丝分裂细胞变圆隆起，与培养皿的附着性低，此时轻轻振荡，M期细胞脱离器壁，悬浮于培养液中，收集培养液，再加入新鲜培养液，依法继续收集，这样每隔1h摇一次并收获一次，倾出培养液贮存于2~4℃冰箱中保存可连续收集24h，则可获得一定数量的中期细胞。
其优点是，操作简单，同步化程度高，细胞不受药物伤害，缺点是获得的细胞数量较少。
（分裂细胞约占1%～2%）2）细胞沉降分离法：不同时期的细胞体积不同，而细胞在给定离心场中沉降的速度与其半径的平方成正比，因此可用离心的方法分离。
其优点是可用于任何悬浮培养的细胞，缺点是同步化程度较低。
2．诱导同步化1）DNA合成阴断法：选用DNA合成的抑制剂，可逆地抑制DNA合成，而不影响其他时期细胞的运转，最终可将细胞群阻断在S期或G/S交界处。
细胞周期同步化有哪些方法？
细胞周期同步化有哪些方法？在一般培养条件下，群体中的细胞处于不同的细胞周期时相之中。
为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡，故常需借助某种自然或人工的实验手段，使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相的现象，这就是细胞同步化技术。
由于细胞群体受到多种条件限制，对结果有很大影响，所以一般采用人工同步方法，下面就来介绍几种常用的方法。
M期同步化法01振荡收集法该法利用M期细胞变圆易脱落的特点，将生长旺盛的贴壁细胞按一定的时间间隔振荡，使M期细胞脱落，逐步收集培养基，并补充新的培养基。
按照此法继续收集，可得到一定数量的M期细胞。
优点：方法简单，同步化程度高且不受药物伤害，能够真实反应细胞周期状况；缺点：由于M期较短，得到的细胞很少，并且只适用于贴壁细胞。
02秋水仙素阻抑法秋水仙素可以抑制微管聚合，因而能有效地抑制细胞纺锤体的形成，将细胞阻断在细胞分裂中期。
此方法也比较简单，将细胞培养至指数生长期，加入秋水仙素，使培养基最终浓度为0.25~0.5μg/mL，作用6~7min，收集细胞800r/min离心5~10min，弃上清，沉于管底的细胞即为M期细胞。
注意：由于秋水仙素对细胞有一定毒性，用量较小或作用时间较短时细胞活性尚可恢复，而用量过大或时间过长则细胞不能存活，因此使用时应严格控制其剂量和作用时间。
03N2阻断法细胞培养至指数生长期后将培养瓶置于N2罐中并通适量CO2 ，约相当于罐中体积的5%。
关闭好N2罐，接上N2管子及压力表，缓缓向罐中充气一直到压力为80~90磅/英寸为止。
将N2装置放在37℃培养箱中10~16h(通常过夜)。
次日从培养箱中取出，然后缓缓将N2放出。
取出细胞在镜下观察同步化效果，用振荡法收集细胞于离心管中。
800r/min离心10min收集细胞。
优点：此方法较秋水仙素阻抑法好。
S期同步化法01胸腺嘧啶核苷（T dR）双阻断法胸腺嘧啶核苷（T dR）是一种DNA合成可逆抑制剂（阻断S期，去除后S期可继续进行）。
细胞同步化的处理方法
细胞同步化的处理方法细胞同步化是一种常用的实验手段，可以使细胞群体在同一时刻处于相同的细胞周期阶段，便于研究细胞周期调控机制、DNA合成等生命过程。
本文将介绍几种常用的细胞同步化方法及其优缺点，并详细讲解操作步骤。
一、药物同步化方法1.1 利用紫杉醇紫杉醇是一种微管蛋白抑制剂，能够阻止分裂中期和间期的细胞进入有丝分裂。
通过给予适量的紫杉醇，可使大部分细胞停滞在G2/M期。
操作步骤：（1）培养待处理的细胞至70%左右的密度。
（2）加入适量的紫杉醇（通常为100nM-500nM），并在37℃下孵育4-24小时。
（3）将药物去除，用PBS洗涤两次。
（4）根据需要进行后续实验。
优点：操作简单，不需要特殊设备；适用于多种类型的细胞。
缺点：药物浓度和处理时间需仔细控制，否则可能会导致细胞死亡或不同步。
1.2 利用阿霉素阿霉素是一种DNA合成抑制剂，可以使G1期和S期的细胞停滞在G1期。
通过给予适量的阿霉素，可使大部分细胞处于G1期。
操作步骤：（1）培养待处理的细胞至70%左右的密度。
（2）加入适量的阿霉素（通常为0.5μg/ml-2μg/ml），并在37℃下孵育16-24小时。
（3）将药物去除，用PBS洗涤两次。
（4）根据需要进行后续实验。
优点：适用于多种类型的细胞；可以较为彻底地将大部分细胞同步到G1期。
缺点：药物浓度和处理时间需仔细控制，否则可能会导致细胞死亡或不同步；对某些类型的细胞可能无效。
二、离心同步化方法离心同步化方法利用离心力将处于不同周期阶段的细胞分离，并使它们在相同条件下重新开始生长。
这种方法适用于较快生长、比较均匀的细胞系，如HEK293、HeLa等。
操作步骤：（1）将待处理的细胞培养至70%左右的密度。
（2）收集细胞，用PBS洗涤一次。
（3）加入离心管中，离心5-10分钟，将上清液去除。
（4）将沉淀的细胞用适量的培养基悬浮后重新培养。
（5）根据需要进行后续实验。
优点：不需要药物处理；对于某些类型的细胞可以得到较好的同步效果。
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细胞周期同步化常用的方法
在一般培养条件下，群体中的细胞处于不同的细胞周期时相之中。
为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡，常需采取一些方法使细胞处于细胞周期的同一时相，这就是细胞同步化技术。
细胞同步化的方法有选择同步化和诱导同步化，其中，选择同步化常用的方法有有丝分裂选择法和细胞沉降分离法。
选用DNA合成抑制剂可逆地抑制S期细胞DNA合成而不影响其他细胞周期运转，最终可将细胞群体阻断在G1/S期交界处；一些抑制微管聚合的药物，因抑制有丝分裂装置的形成和功能行使，可将细胞阻断在有丝分裂中期，即使细胞同步于M期。
一、M期同步化方法
1．振荡收集法
该法利用M期细胞变圆易脱落的特点，将生长旺盛的贴壁细胞按一定的时间间隔振荡，使M期细胞脱落，逐步收集培养基，并补充新的培养基。
收集的细胞放4℃冰箱中保存，离心沉淀后即获得M期细胞。
2．秋水仙素阻抑法
（1）将细胞传代培养至指数生长期。
（2）加入秋水仙胺，使最终浓度为0.05－0.1μg/mL培养基，作用6－7 h。
如使用秋水仙素，使用浓度应加大5～10倍。
（3）振荡收集细胞，800 r/min离心5－10 min，弃上清，收集的沉淀细胞即为M期细胞。
加入一定量培养基将细胞接种到培养瓶中或直接进行离体实验。
由于秋水仙素或秋水仙胺对细胞有一定毒性，用量较小或作用时间较短细胞活性尚可恢复，而用量过大或时间过长则细胞不能存活，因此使用时应严格控制其剂量和作用时间。
3．N2阻断法此方法较秋水仙素阻抑法好
（1）将细胞传代培养至指数生长期。
（2）将培养瓶置于N2罐中通入适量CO2（约相当于罐中体积的5％）。
（3）关闭好N2罐，接上N2管子及压力表，缓缓向罐中充气一直到压力为80-90磅/英寸2为止。
（4）将N2装置放在37℃培养箱中10－16 h（通常过夜）。
次日从培养箱中取出，然后缓缓将N2放出（最好放出窗外）。
（5）取出细胞在镜下观察同步化效果，用振荡法收集细胞于离心管中。
（6）800 r/min离心10 min收集细胞。
二、S期同步化方法
胸腺嘧啶核苷（TdR）双阻断法：该法利用过量TdR能阻碍DNA合成的原理而设计，为了加强细胞同步化效果，常采用两次TdR阻断法，即双阻断法。
第1次阻断时间相当于G2、M 和G1期时间的总和或稍长，释放时间不短于S期时间，而小于G2+M+G1期时间，这样才能使所有位于G1/S期的细胞通过S期，而又不使沿周期前进最快的细胞进入下一个S期。
第2次阻断时间同第1次，再释放。
现以HeLa细胞为例加以说明（HeLa细胞周期时间为21 h，其中G1期为10 h，S期为7 h，G2期为3 h，M期为1 h）。
1．将细胞培养至指数生长期的早期。
2．加入含2 mmol/L TdR的培养基（2－2.5 mmol/L用于肿瘤细胞的同步化培养），作用16 h。
3．弃掉TdR培养基，用Hanks液洗2－3次，再换上新鲜培养基继续温浴9 h。
4．重新加入TdR培养基（浓度同上）进行第2次阻断，作用16 h。
5．再弃掉TdR培养基，Hanks液洗2－3次后换上普通培养基。
第2次TdR释放0 h时取样
则细胞处于G1/S期交界处；如2－7 h取样则为不同阶段的S期细胞。
注意：具体TdR作用和释放的时间应参考每一种待同步化细胞的细胞周期各时相测定的参考值，也可根据经验确定。
三、G1期和G2期细胞的获得
1．G2期细胞的获得
根据细胞周期测定的数值，采用TdR双阻断法使细胞同步在G1/S期交界处后，洗去TdR使细胞释放后继续培养。
其培养时间应大于S期时间而小于S+G2期时间。
然后先用振荡法使已进入M期的细胞脱落，弃去上清培养基；再用胰酶消化，加入新鲜培养基制成细胞悬液，离心收集细胞，即为G2期细胞。
2．G1期细胞的获得
（1）将用M期阻断法获得的细胞加入一定量的培养基，继续培养1－10 h即可获得各阶段的G1期细胞。
（2）用缺乏异亮氨酸的培养基培养细胞，培养时间超过一个细胞周期，即可获得中G1期细胞。
四、G0期细胞的获得
可采用血清饥饿法得到G0期细胞。
1．取处于对数生长期的细胞。
2．用含0.5％－1％小牛血清的培养基培养细胞48－72 h。
或用无血清的培养基培养24 h。
3．用0.1％－0.25％胰蛋白酶消化细胞可收获G0期细胞，可用3H-TdR掺入进行测量鉴定。