细胞周期的同步化ppt
细胞周期同步化PPT课件
2021/3/7
CHENLI
4
（1）.人工选择同步化
• 人工选择同步化：人为的将处于不同细胞 周期的细胞分离开，从而获得不同时期细 胞群体的方法。
• 人工选择同步化的方法：
（1）.有丝分裂选择法密
（2）度梯度离心法
2021/3/7
CHENLI
5
有丝分裂选择法（反复振摇法）
• 利用有丝分裂细胞变圆隆起，与培养皿的 附着性降低的特点。此法的特点是细胞不 受药物等的伤害，同步化程度高，放入 37℃环境中，收集的细胞即可同步分裂。 缺点是分裂细胞一般占1%-2 ％，分离的细 胞数量少。
2
同步化方法
• 1.自然同步化 • 2.人工同步化 • （1）人工选择同步化 • （2）人工诱导同步化
2021/3/7
CHENLI
3
1.自然同步化
• 自然同步化在自然界中，细胞自然同步化 的现象在动、植物及粘菌中都有所发现， 它们不受人为条件的干扰，因而有可能在 接近自然的条件下进行观察。
• 缺点：自然同步化受到很多条件的限制。
11
2.2 DNA分裂中期阻断法
• 某些药物可抑制微管的聚合，将细胞阻断 于有丝分裂中期。非平衡生长问题不十分 明显。但长时阻断释放后许多细胞不能恢 复正常的细胞周期。
• 中期阻断药物最常用者为秋水仙素或其衍 生物秋水仙酰胺。
2021/3/7
CHENLI
12
DNA分裂中期阻断法的优缺点
• 优点：操作简便，效率高 • 缺点：这些药物的毒性相对较大，若长时
2021/3/7
CHENLI
10
DNA合成阻断法优缺点
• 优点：同步化程度高，适用于任何培养体 系，可将几乎所有的细胞同步化。
细胞生物学第四版(13至17章)
一、MPF的发现及其作用
一、MPF的发现及其作用
• M期细胞中可能存在细胞有丝分裂促进因子：
M期细胞可以诱导PCC，暗示在M期细胞中可 能存在一种诱导染色体凝缩的因子，称为细 胞有丝分裂促进因子（MPF）。
M期细胞与G1（A）、S（B）和G2（C）期细胞融合诱 导早熟染色体凝缩（PCC）（图14-1）
CycA/B- CDK1 CycA/B- CDKA
CDC: 细胞分裂周期蛋白
Cyclin的周期性变化
植物细胞周期控制的图示
p21抑制作用的机理
五、细胞周期运转调控
细胞周期调控系统（cell cycle control system） 是指调节细胞周期运行的蛋白质网络系统。 CDK因对 细胞周期运行起着核心调控作用而被称为周期引擎分子。 不同种类的周期蛋白与不同种类的CDK结合，构成不 同的MPF。不同的MPF在细胞周期的不同时期表现活 性，因而对细胞周期的不同时期进行调节。MPF又被称 作细胞周期引擎。 （一）G2/M期转化与CDK1的关键性调控作用 （二）M期周期蛋白与细胞分裂中期向后期转化 （三）G1/S期转化与G1期周期蛋白依赖性CDK
四、CDK和CDK抑制因子
• CDK的活性受磷酸化修饰调节：细胞内存在多 种因子，对CDK分子结构进行磷酸化修饰，从 而调节CDK的活性。 • CDK抑制蛋白（CDK inhibitor, CKI）：指对 CDK起负调控作用的蛋白质，包括Cip/Kip家族 和INK家族。① Cip/Kip家族：包括p21、p27和 p57等，其中p21主要对G1期CDK（CDK2~4和 CDK6）起抑制作用 p21还与DNA聚合酶δ 的辅 助因子增殖细胞核抗原（PCNA）结合，抑制DNA 的复制；② INK家族：包括p16、p15、p18和 p19等，其中p16主要抑制CDK4和CDK6活性。
细胞周期 PPT课件
二、周期蛋白依赖激酶
20世纪70年代初，哈特韦尔 （Leland Harwell）和纳斯（Paul Nurse）博士分别以不同种的酵母为 材料，利用遗传学方法先后分离出 cdc28和cdc2基因。
这类基因所编码的蛋白产物均为P34Kd的蛋白，称为P34cdc2 和P34cdc28, 它们本身不具有激酶活性，但和有关蛋白结合 后，可使多种蛋白底物磷酸化，因而它们统称为周期蛋白 依赖性激酶（cyclin dependent kinase cdk激酶）。
7
限制点,R
限制点（R点）：G1期对一些环境因素的敏感点，可限制正 常细胞通过周期。是控制细胞增殖的关键。
8
S期 S期：从DNA合成开始到DNA合成结束的全过程，是细胞增殖周 期的关键阶段。 主要特点： 1.DNA的复制 2.染色质组装 3.中心粒的复制
9
G2期 G2期 :从DNA复制完成到有丝分裂开始前的时期，为有丝分 裂进行物质条件和能量的准备（加速RNA和有丝分裂相关蛋 白的合成） 。 1. 合成微管蛋白等纺锤体的成分； 2. 合成染色质凝集相关蛋白； 3. 合成M期调控蛋白； 4. 中心粒开始向两极移动，体积膨大。
5
代谢抑制法
胸苷是合成DNA的前体，是不可或缺的。其适当的浓度为 10-7～10-5mol/L。如果给与过量的胸苷（10-3mol/L）则引 起脱氧胸苷合成受到抑制，其结果DNA的合成也将终止。 在培养中的细胞给与过量的胸苷后，则S期细胞都会向G2、 M、G1前进，再次给药后，细胞大都被阻滞在G1/S期。 优点是同步化程度高，适用于任何培养体系。可将几乎所 有的细胞同步化。缺点是产生非均衡生长，个别细胞体积 增大。
cyclinA 在S期DNA合成的起始过程中起作用,当cyclinE降解后, 其作用可延续至整个S期。
细胞周期同步化
2.细胞同步化 细胞同步化 在一般培养条件下， 在一般培养条件下，群体中的细胞处 于细胞周期不同的时相之中， 于细胞周期不同的时相之中，不同阶段的 细胞其形态学和生化特性均有所不同， 细胞其形态学和生化特性均有所不同，为 了研究某一时相的细胞， 了研究某一时相的细胞，常需采取一些方 法使细胞处于细胞周期的同一时相， 法使细胞处于细胞周期的同一时相，这就 是细胞同步化技术。 是细胞同步化技术。
（二）人工同步化 概念：人为地将处于不同时期的细胞分离开来， 概念：人为地将处于不同时期的细胞分离开来， 从而获得不同时期的细胞群体。 从而获得不同时期的细胞群体。 方式： 方式： 1.选择同步化： 选择同步化： 选择同步化 选择同步化是根据细胞的体积 是根据细胞的体积、 选择同步化是根据细胞的体积、黏附性等的 时相特征来对不同时相的细胞进行选择和分离， 时相特征来对不同时相的细胞进行选择和分离， 从而实现细胞的同步化。 从而实现细胞的同步化。 2.诱导同步化： 诱导同步化： 诱导同步化 诱导同步化是在培养液中添加或去除某些成 诱导同步化是在培养液中添加或去除某些成 或者改变培养温度， 分，或者改变培养温度，从而对细胞的生长进行 阻滞或回复， 阻滞或回复，将不同步生长的细胞调整为同步生 获得时相较为均一的细胞群。 长，获得时相较为均一的细胞群。
细Hale Waihona Puke 周期同步化细胞周期：• 由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，叫 由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程， 细胞周期。分为 个期 个期： 细胞周期。分为4个期： • G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期 期 ，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙 复制之前的间隙 时间。 时间。 – S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期。 期 复制的时期。 ， 复制的时期 – G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的 期 ， 复制完成到有丝分裂开始之前的 一段时间。 一段时间。 – M期又称 期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结 期又称D期 ， 期又称 束。
细胞周期同步化
细胞周期同步化在细胞培养过程中,细胞多处于不同的细胞周期时相中,其中有少数细胞在进行有丝分裂活动,其余细胞分别处于G1、S与G2各期。
不同时相的细胞对药物干预存在不同反应,会影响实验的重复性,因此,需要获得周期一致性的细胞。
利用细胞同步化技术可使细胞大量的处于同一细胞时期,并可获得该时期大量的物质,如细胞中期时的染色体。
细胞周期同步化(synchronization)就是指为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡,借助某种自然或人为的实验手段,使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相( 除了G0期的细胞)的现象。
细胞同步化本质上包括用一定的方法获得一定数量的同步化细胞群与使细胞进入同步化生长的两层含义。
DNA 合成抑制法就是通过抑制DNA合成将细胞同步于同一时期的方法。
高浓度TdR(胸腺嘧啶核苷)双阻断法就是目前常用的抑制DNA 合成的同步化方法。
它可逆地抑制DNA 合成,而不影响其她时期细胞的转运,最终可将细胞群阻断在S 期或G1 /S 交界处。
其原理就是: TdＲ就是细胞DNA 合成不可缺少的前体,但向培养基中加入过量TdＲ,可形成过量的三磷酸腺苷,后者能反馈抑制其她核苷酸的磷酸化,从而抑制DNA 合成。
它将细胞同步于G1 /S期交界处,同步化程度高,适用于任何培养体系,可将几乎所有的细胞同步化,但就是容易产生非均衡生长,个别细胞体积增大。
TdＲ双阻断法因为简单易行且可逆,在肿瘤药理方面对细胞周期同步化的实验中得到了广泛的应用。
羟基脲、5-氟脱氧尿嘧啶、阿糖胞苷、氨甲蝶呤与高浓度ADR、GDR也属于DNA合成抑制剂,它们与TdR作用相似,均可通过抑制DNA 合成达到同步化的目的。
中期阻断法就是利用破坏微管的药物将细胞阻断在M期从而得到同一时期细胞的方法,常用的药物有秋水仙素等。
秋水仙素通过抑制微管的聚合,进而抑制有丝分裂装置的形成,将细胞阻断于有丝分裂中期然后再释放使细胞达到同步化。
细胞周期同步化
8
精选课件
细胞周期同步化
将处于不同时相的细 胞分离开来，从而获 得不同时期的细胞群 体。
1
精选课件
自然同步化 细胞周期同步化 人工选择同步化
药物诱导
2
有丝分裂选择法 密度梯度离心法 分裂中期阻断法 DNA合成阻断法
精选课件
自然同步化
自然界中已经存在一些细胞群体处于细 胞周期的同一时相
如有一种黏菌的变形体plasmodia，只进 行核分裂而不进行胞质分裂，结果形成 多核体结构。所有细胞核在同一细胞质 中进行同步分裂。
4 高。缺点是分离的细胞数量少。精选课件
密度梯度离心法：根据不同时期的细胞 在体积和重量上存在差别进行分离。得 到处于不同时期的细胞。
优点是方法简单省时，效率高，成本低。 缺点是对大多数种类的细胞并不适用。
5
精选课件
药物诱导
DNA合成阻断法——G1/S-TdR双阻断法： 1、将过量的TdR加入细胞培养液，所有 S期的细胞立刻被抑制，其他细胞运行到 G1/S交界处被抑制。2、将TdR洗脱，解 除抑制，被抑制的细胞沿细胞周期运行。 3、在解除抑制的细胞到达G1期终点前， 第二次加入TdR并继续培养，所有的细胞 被抑制在G1/S交界处。4、将TdR洗脱， 加入新鲜培养液培养一定时间，可获得S
某些受精卵早期卵裂
3
精选课件
人工选择同步化
有丝分裂选择法：对数期的单层培养细 胞——细胞分裂活跃，处于分裂期的细 胞变圆，贴壁生长——振荡使细胞脱落， 悬浮到培养液中——收集培养液，离 心——获得分裂期细胞，从新培养，获 得不同时相的细胞
优点是细胞未经过任何药物处理，能真 实反映细胞周期状况，细胞同步化效率
细胞周期同步化的方法及原理
细胞周期同步化的方法及原理细胞周期同步化是指将一个细胞群体的细胞周期同步调控，使其达到相同的细胞周期阶段，常用于研究细胞周期相关的生物学问题和药物活性评价。
一种常用的细胞周期同步化方法是断模式同步化法（danual synchronization）。
其原理是通过处理细胞群体，使细胞群体进入细胞周期的同一阶段。
具体步骤如下：1. 处理细胞：例如，可以使用DNA合成抑制剂（例如荧光素核苷）或温度敏感的DNA复制突变体来处理细胞，阻止细胞群体进入S期，从而使细胞群体在G1期同步化。
2. 处理时间控制：根据细胞类型和所需的同步化阶段，确定细胞处理的时间。
例如，如果需要同步化到G1期，处理时间可设置为长时间（通常为数小时）。
3. 细胞分离：通过适当的方法（例如机械或酶消化）将细胞群体分散为单个的细胞，使其可以进一步自由增殖。
4. 细胞培养：将细胞培养在含有适当培养基和生长条件的培养皿中，使其进一步增殖。
5. 细胞收获：在所需的时间点，收获同步化的细胞样品，以进行进一步的分析。
另一种常用的方法是双组分系统同步化法（double thymidine block）。
其原理是在细胞群体中使用连续两次胸腺嘧啶（thymidine）处理，以抑制DNA合成并导致细胞暂时停滞在S期。
具体步骤如下：1. 第一次胸腺嘧啶处理：将细胞培养在含有胸腺嘧啶的培养基中，阻止DNA合成，并使细胞停滞在S期。
2. 处理时间：根据细胞类型和所需的同步化阶段，确定第一次胸腺嘧啶处理的时间。
通常，处理时间为数小时。
3. 洗脱胸腺嘧啶：洗去胸腺嘧啶，使细胞可以进入下一个细胞周期阶段。
4. 第二次胸腺嘧啶处理：再次使用胸腺嘧啶处理细胞，使细胞再次停滞在S期。
5. 处理时间：根据细胞类型和所需的同步化阶段，确定第二次胸腺嘧啶处理的时间。
通常，处理时间为数小时。
6. 洗脱胸腺嘧啶：洗去胸腺嘧啶，使细胞可以进入下一个细胞周期阶段。
7. 细胞培养：将细胞培养在含有适当培养基和生长条件的培养皿中，使其进一步增殖。
细胞周期同步化概念
细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关， 如：小鼠十二指肠上皮细胞的周期为10小时， 人类胃上皮细胞24小时，骨髓细胞18小时， 培养的人成纤维细胞18小时，CHO细胞14小时， HeLa细胞21小时。不同类型细胞的G1长短不 同，是造成细胞周期差异的主要原因。
缺点：操作技术有一定的难度；具有一定的危险性；同位素 的放射性逐渐衰减，误差较大。
测定原理： ① 待测细胞经3H-TdR标记后，所有S期细胞均被标记。 ② S期细胞经G2期才进入M期，所以一段时间内PLM=0。 ③开始出现标记M期细胞时，表示处于S期最后阶段的细胞，已渡
过G2期，所以从PLM=0到出现PLM的时间间隔为TG2。 ④ S期细胞逐渐进入M期，PLM上升，到达到最高点的时候说明原
细胞周期各阶段的时间与PLM的关系
Ts
二、细胞周期同步化
概念：细胞同步化是指在自然过程中发生的，或经人为处理 造成的细胞周期的同步化。
类型：自然同步化
人工同步化：选择同步化：有丝分裂选择法 细胞沉降分离法
诱导同步化：DNA合成阻断法 中期阻断法
(一）自然同步化
概念：自然界存在的细胞周期同步过程，称为自然同步化。 类型： 1．多核体 如粘菌只进行核分裂，而不发生胞质分裂，形成多核体。数量众 多的核处于同一细胞质中，进行同步化分裂，使细胞核达108， 体积达5~6cm。疟原虫也具有类似的情况。 2．某些水生动物的受精卵 如海胆卵可以同时授精，最初的3次细胞分裂是同步的，再如大 量海参卵受精后，前9次细胞分裂都是同步化进行的。 3．增殖抑制解除后的同步分裂 如真菌的休眠孢子移入适宜环境后，它们一起发芽，同步分裂。
细胞周期长短的测定
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
可能为5%，Ａ错；第一次加入的抑制剂处理时间应不小 于14h，B错；第一次加入的抑制剂处理应使细胞处于S期 和G1/S交界处，C错；第一次加入的抑制剂洗脱后，细胞 培养时间应使S期细胞全部出S期，至少6 h、最前S期细 胞到达下一周期G1/S交界处要14 h，D正确。
-
_________1点即可）．
• 在某高等动物细胞Z的细胞周期中，各时期经历时间依次为G1期 （DNA合成前期）8 h，S期（DNA合成期）6 h，G2期（DNA 合成后期）5 h，M期（分裂期）1 h。某DNA合成抑制剂能特异 地抑制DNA的合成，对S期以外的细胞无影响，但可以阻止这些 细胞进入S期而停留在G1/S交界处，抑制剂解除后所有细胞能继 续进行细胞周期运转。将一定数量的Z细胞和一定剂量的抑制剂 加入细胞培养液中培养一段时间，然后洗脱抑制剂，并更换培养 液培养一段时间，第二次加入抑制剂培养一定时间后，可使所有 的细胞抑制在G1/S交界处，从而实现细胞周期的同步化。下列 叙述正确的是
• 〔考点〕细胞周期 及细胞周期的同步化
-
• A. 实验开始时，培养液中的处于M期细胞占的比例可能为 10%
• B. 第一次加入的抑制剂处理时间应不小于13 h • C. 第一次加入的抑制剂处理应使细胞处于G1/S交界处 • D. 第一次加入的抑制剂洗脱后，细胞培养时间应大于6 h、
小于14 h时第二次加入抑制剂 • 〔答案〕D • 〔解析〕实验开始时，培养液中的处于M期细胞占的比例