甾体生物转化技术研究的现状与进展_许正宏

2 转化菌种选育及改良
生物催化剂的种类不够多、适用的反应类型有 限是当前限制甾体生物催化发展的因素之一，因此 需要大规模从自然界筛选特定功能的催化剂，或对 原有的催化剂进行改造。目前在高产菌株的选育 中，诱变育 种 仍 然 是 普 遍 应 用 并 十 分 有 效 的 方 法， 但由于甾体类微生物的转化菌株大多数为放线菌、 霉菌等，相 对 细 菌 来 讲，这 类 菌 株 细 胞 结 构 的 复 杂 性和特殊性导致采用菌丝体的诱变方法很难达到 预定的诱变效果。因此，在了解菌株细胞结构特征
1 半合成原料
中国是甾体激素要素原料及其制剂的主要生 产国，原料药年产值近 100 亿元，其中 70% 出口，且 皮质激素类原料的生产规模已居世界之首。但我 国并非甾体激素药物产业的强国，目前主要依赖于 单一植源性薯蓣皂素、剑麻皂素及西南山地高原野 生的蕃麻皂素为半合成原料，生产以皮质激素为代 表的低档次初级产品。国际市场一方面大量吸收 我国的低端产品，如氢化可的松、泼尼松等； 一方面 又利用其技术优势将其高端产品倾销给我国。薯 蓣皂素的日渐枯竭造成原料成本价格上升，同时合 成的低端产品又缺乏国际竞争力，这给我国甾体药 物产业带来了严重的危机。因此，需要积极努力开 发新型甾体原料资源，研究收率高、成本低、环境污 染小的绿色 工 艺，迎 头 赶 上 世 界 先 进 水 平，成 为 甾 体激素药物产业的强国。
关键词： 甾体； 生物转化； 药物中间体
中图分类号： TQ46
文献标志码： A
文章编号： 1672 － 3678（ 2013） 02 － 0030 － 07
Current state and progress of biotransformation technology of steroid compounds
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生物加工过程
第 11 卷
图 1 甾醇边链的降解 Fig． 1 Microbial degradation of sterol side-chains
的基础上，采用单孢子或原生质体诱变并结合特定 的筛选方法和适当的压力条件进行多轮多次突变 选择效果较好。此外，随着基因工程技术的日益完 备，采用分子生物学手段对菌种的分子改造也成为 比较有效且常用的方法之一。 2． 1 原生质体抗药性筛选方法
然而，在 甾 体 类 化 合 物 的 生 物 转 化 过 程 中，由 于甾体底物 溶 解 性 差、培 养 基 传 质 效 率 低、底 物 产 物的反馈抑制和全细胞生物催化副产物多等原因， 菌株的转化能力和甾体的转化效率仍然偏低，是甾 体生物转化技术实现工业化的主要瓶颈。笔者精 选了近些年生物转化法在合成甾体药物领域的突 出成果，从半合成原料、菌种选育及改良、生物转化 新工艺及新技术等方面进行综述。
胆固醇是近些年另外一种比较受关注的甾体 药物新资源，主要是从猪、牛、鱼等动物的脂肪和油 中提取所得。关于微生物降解甾醇边链合成重要 的甾体激素药物已总结于图 1 中。胆固醇的边链降 解与植物甾醇类似，在 C17 位断裂氧化形成 17 甾 酮［8］。该化合 物 是 合 成 性 激 素、糖 皮 质 激 素、利 尿 剂等的关 键 中 间 体，年 生 产 量 超 过 1 000 t，其 中 60% 都是由生物转化技术生产。在所有的天然甾醇 中，β 谷甾醇和胆固醇是最适合生产 17 甾酮产品 的，但胆固醇比 β 谷甾醇的生物利用程度低，因此 由胆固醇生产 17 甾酮的成本较高。
Fusarium sp． 等 菌 属 切 除 边 链 后 可 一 步 生 成 AD、 ADD 或 9α OH AD 这 3 类甾体药物中间体［5 7］。 AD 和 ADD 是最具有市场价值的甾体药物中间体， 对其活性部位进行结构改造，可用于合成多种皮质 类固醇，如 盐 皮 质 甾 醇、口 服 避 孕 药 等 其 他 甾 体 药 物。2011 年，全球 AD / ADD 的年销售总额高达 10 亿美元，而且呈逐年递增的趋势。植物甾醇是天然 无毒的活性物质，原料来源广泛，价格低廉，其侧链 用化学手 段 难 以 降 解，长 期 以 来 被 当 做 废 物 处 理， 微生物选择性降解边链技术使得植物甾醇被有效 利用，成为薯蓣皂素的替补资源。
由于化学或物理诱变方法所产生的突变是随 机的，突变无方向性，导致目标菌株筛选工作量大， 直接影响了诱变育种的工作效率。细胞色素 P450 为甾体的微生物羟化反应中起催化作用的酶。而 酮康唑 等 唑 类 化 合 物 可 以 通 过 未 共 享 电 子 对 与 P450 的血红素铁形成 pπ dπ 作用键，或将 P450 保 守的半胱氨酸上的巯基（ SH） 电子密度推向血红素 铁，成为血红素优良的配体，从而与 P450 竞争分子 氧或底物，抑制 P450 活性［10］。因此，可以利用真菌 对唑类药物产生的抗药性机制，对真菌类菌株进行 抗药性筛选。天津科技大学王敏课题组应用酮康 挫抗性筛选法，采用紫外线诱变处理的甾体 11β 羟 基化菌 株———新 月 弯 孢 霉 的 原 生 质 体 （ 有 完 整 核 型） ，获得了氢化可的松转化率为出发菌株 1． 42 倍 的遗传稳定突变株［11］。借助丝状真菌的原生质体， 结合传统的理化诱变 / 抗性筛选，再生具有完成核 型的细胞克隆，分离选育具有甾体 11β 羟基化能力
增加，形成了一条生物 化学法耦联的甾体药物合成 新工艺。最 为 成 功 的 案 例 是 利 用 黑 根 霉 Rhizopus nigricans 在孕甾酮的 C11α 引入羟基，解决了皮质激 素合成中的 关 键 问 题，产 品 收 率 大 幅 度 提 高，专 一 性增强，效 果 远 超 化 学 合 成 法 的 合 成 效 果，开 创 了 微生物转化甾体化合物的先例［3］。
其他甾醇原料，如存在于酵母及真菌中的麦角 甾醇，又称麦角固醇，是一种重要的医药化工原料， 可用于氢化可的松、黄体酮等药物的生产［9］。羊毛 固醇 及 其 衍 生 物 经 分 枝 杆 菌 Mycobacterium sp． NRRL B 3805 降解边链、脱氢作用后均能形成甾 体药物的前体化合物。甾体药物原料虽然来源广 泛，但是基本上都在 C17 位上有一个侧链，需要复 杂的边链降解反应才能形成药物中间体，因此寻找 新型、有效的甾体药物前体原料仍是未来甾体生物 转化方向的热点之一。
的稳定型菌株可行且有效，该菌种选育方法可对选 育其他细胞色素 P450 催化的羟基化菌株提供借鉴。 2． 2 多代压力组合突变法
Donova 等［12］报 道 了 由 谷 甾 醇 产 生 9α OH AD 分枝杆菌突变菌株筛选的研究。应用谷甾醇的 选择压力，结 合 传 统 诱 变 作 用，获 得 能 够 转 化 谷 甾 醇为 9α OH AD 的菌株，而野生分枝杆菌只能将 谷甾醇转化为 AD。采用多代压力组合突变法的具 体流程： ①菌种的驯化诱变，在选择性底物谷甾醇 培养基上继代培养 10 次，获取得到能轻微产生 9α OH AD 的菌株，采用紫外（ UV） 辐射方法筛选突变 菌株，得到既能够切除谷甾醇边链、又能向 9α 位引 入羟基的菌 株。 继 而 与 底 物 谷 甾 醇 保 温 培 养。 经 多批驯化，转化效率由首批的 2． 7% 提高到 59． 6% 的产物积累浓度； ②继续采用谷甾醇选择压力，并 结合传统的化学诱变剂 甲基磺酸乙酯（ EMS） 和丝 裂霉素 C 进行 UV 辐照处理。经由多代的谷甾醇压 力组合突变选择，是获得 9α OH AD 菌株的一种 有效方法。 2． 3 菌株的分子改造
植物甾醇，包括 β 谷甾醇、豆甾醇、油菜甾醇 等，主要来 自 于 豆 类 植 物 或 炼 油 下 脚 料，具 有 甾 体 化合物的母核结构，将其“变废为宝”能有效解决水 解黄姜所带来的环境污染问题。其中，β 谷甾醇、 油菜甾醇或其 19 羟化的衍生物是目前比较常用的 植物甾醇，经 Mycobacterium sp． 、Rhodococcus sp． 和
目前，甾体药物的合成主要集中在以具有甾体 母核结构的天然产物为原料、采用化学法和微生物 转化法相结合的方式来合成甾体类药物。综合国 内外研究，生物转化技术在甾体药物生产中的应用 主要分为两大类： ①将天然原料转化为生产甾体化
收稿日期： 2013 － 01 － 04 基金项目： 国家 高 技 术 研 究 发 展 计 划 （ 863 计 划 ） 重 大 项 目 （ 2011AA02A211 ） ； 国 家 自 然 科 学 基 金 （ 21206055 ） ； 江 苏 省 自 然 科 学 基 金
第 11 卷第 2 期 2013 年 3 月
生物加工过程 Chinese Journal of Bioprocess Engineering
doi： 10． 3969 / j． issn． 1672 － 3678． 2013． 02． 005
Vol． 11 No． 2 Mar． 2013
甾体生物转化技术研究的现状与进展
甾体药物是仅次于抗生素的第二大类药物，具 有很强的抗过敏、抗感染、抗病毒等药理活性，已被 广泛应用于治疗内分泌失调、心血管、胶原性病症、 淋巴白血 病、人 体 器 官 移 植、抗 肿 瘤、细 菌 性 脑 炎、 皮肤病、风湿病、老年性疾病等［1 － 2］。甾体生物转化 即利用微生物酶对甾体底物的某一部位进行特定 的化学反应来获得一定的产物。与传统的化学合 成法相比，甾 体 生 物 转 化 具 有 反 应 条 件 温 和、环 境 友好、高效 性 和 高 选 择 性 等 优 势，还 能 合 成 化 学 合 成法所不能合成的一些甾体中间体。近些年来，微 生物转化工艺在甾体药物合成路线中的比例迅速
XU Zhenghong，WU Yan，LI Hui，LI Heng，SHI Jingsong
（ School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）
Abstract： Progress of biotransformation technology of steroid compounds was reviewed． The selection of steroid raw materials，selection and improvement of microbial strain and new technologies of biotransformation were discussed， including physical / chemical solubilizing of substrates， new transformation system and improvement of cell permeability． It is forecasted that the proportion of biotransformation technologies increased in the industrial production process of steroid hormone drugs． Key words： steroids； biotransformation； pharmaceutical intermediates