毛细管电色谱的方法原理与应用
第五章 高效毛细管电泳和电动色谱
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3Leabharlann 101三、毛细管凝胶电泳
毛细管凝胶电泳 CGE）：按照试样中各个组 分相对分子质量的大小进行分离的方法。 用途：常用于蛋白质、寡聚核苷酸、核糖核 酸、DNA片段的分离和测序及聚合酶链反应产 物的分析。CGE能达到CE中最高的柱效。
• 毛细管等电聚焦是基于不同蛋白质或多肽之 间等电点的差异进行分离的电泳技术。 • 毛细管等电聚焦最具特色的应用是测定蛋白 质的等电点。在异构酶鉴定、单克隆抗体、 多克隆抗体、血红蛋白亚基等研究中，经常 用毛细管等电聚焦。
五、亲和毛细管电泳
亲和毛细管电泳是利用配体与受体之间存在特异性 相互作用，可以形成具有不同荷-质比的配合物而达 到分离目的。
梯度升压方式对毛细管电泳分离的影响 A. 2kV至25kV，0min，一步升压；B.2kV至25kV，5min，线性梯度 升压. 样品：β-乳球蛋白A，溶菌酶，细胞色素C，肌红蛋白，微白蛋白
二、毛细管及其温度控制
毛细管电泳柱作为分离分析的载体，其材料、 形状、内径、柱长、温度对分离度和重现性都 有影响。
缓冲液中加入添加剂，并让缓冲液与毛 细管充分平衡.如加入阳离子表面活性剂 十四烷基三甲基溴化铵(tetradecyl trimethyl ammonium bromide ,TTAB)， 能在内壁形成物理吸附层，使EOF反向. 添加剂还有聚乙烯亚胺、甲基纤维素 (MC)、十六烷基溴化铵(CTAB)等。
说明毛细管电泳特点及应用
说明毛细管电泳特点及应用
毛细管电泳是一种高效液相色谱技术，其基本原理是利用电场将带电粒子在毛细管中的移动速率和荷电量的差异进行分离和富集。
毛细管电泳具有高分离效率、快速分离、小量样品、自动化程度高等特点，已经成为了化学、生物、环境学等领域的一个重要分析工具。
其主要应用领域和特点如下：
1.分离生化分子
毛细管电泳可以用于分离和富集DNA、RNA、蛋白质、糖类和小分子有机物等生物分子。
这些生物分子在酸碱性、水解、氧化还原等条件下有不同的化学性质和电荷性质，可以被毛细管电泳技术精确分离和定量。
例如在DNA分离和定量方面，毛细管电泳已经成为PCR扩增产物检测、基因测序、DNA指纹鉴定等分子生物学技术中的重要手段。
2.分析环境污染物
毛细管电泳可以用于环境监测和食品安全检测等领域，可以对水、空气、土壤和食品中的有机和无机污染物进行快速准确定量分析。
例如利用毛细管电泳技术可以分析环境中的氨、硝酸盐、荧光增白剂、PESTICIDE 等有害物质含量，以及酒类中的苯甲酸、乙酸等有害物质。
3.分析药品和代谢产物
毛细管电泳可以快速、灵敏地分离和鉴定药品和代谢产物，具有药动学和毒理学研究的重要意义。
毛细管电泳技术节省反应时间，减少实验操作时间，可对液-液、液-固、固-液等反应进行分离和分析，得到精确的数据和结果。
如利用毛细管电泳技术，可以分析身体内的有机酸、氨基酸、代谢产物等物质。
总之，毛细管电泳技术在化学分析和生物分析中均有广泛应用，且已成为学术研究和工业生产的一种重要分离分析手段。
毛细管电泳和毛细管电色谱
其他领域
毛细管电泳还应用于食品分析 、冶金、地质等领域，可用于 金属离子、矿物成分等的分离
和检测。
02 毛细管电泳技术
CHAPTER
进样技术
压力进样
通过施加压力使样品进 入毛细管，适用于大体
积样品。
电动进样
利用电场力驱动样品进 入毛细管，适用于低粘
电解质浓度
影响电场强度和离子迁移率。
温度
影响分子热运动和扩散系数。
毛细管材料和内壁处理
影响样品在毛细管内的吸附和分离效 果。
03 毛细管电泳实验
CHAPTER
实验流程
安装毛细管
选择合适的毛细管，将其插入 仪器，确保密封良好。
运行实验
设定合适的实验参数，如电压、 温度、检测波长等，开始实验。
准备毛细管电泳仪
进系统
用于将样品注入到毛细管中。
实验材料
毛细管
具有微米级内径的玻璃或石英管，是电泳的分离通道。
电解质溶液
用于提供电泳所需的离子环境。
样品
待测物质，需进行适当预处理。
清洗液
用于清洗毛细管和仪器，保持实验的准确性。
04 毛细管电色谱简介
CHAPTER
定义与原理
定义
毛细管电色谱（CEC）是一种将高效电泳分离与高效液相色谱的固定相相结合 的分离技术。
亲和电泳
利用特异性亲和作用进行分离 ，如抗体-抗原、酶-抑制剂等
。
检测方法
紫外可见光谱
利用紫外可见光谱检测分离出的组分。
电化学检测
利用电化学方法对分离出的组分进行检测。
荧光检测
利用荧光物质标记待测组分，通过荧光信号 进行检测。
毛细管电色谱应用在哪些方面
毛细管电色谱应用在哪些方面
毛细管电色谱（capillary electro chromatography，CEC）以内含色谱固定相的毛细管为分离柱，兼具毛细管电泳及高效液相色谱的双重分离机理，既可分离带电物质也可分离中性物质。
毛细管电色谱法是用电渗流或电渗流结合压力流来推动流动相的一种液相色谱法。
因此，毛细管电色谱法可以说是HPLC和HPCE 的有机结合，它不仅克服了HPLC 中压力流本身流速不均匀引起的峰扩展，而且柱内无压降，使峰扩展只与溶质扩散系数有关，从而获得了接近于HPCE 水平的高柱效，同时还具备了HPLC 的选择性。
HPLC是用压力驱动流动相。
流速是随填充微粒的大小和柱长而变化的。
流速在管中呈抛物线轮廓，因而造成了色谱峰谱带的展宽，降低了柱效。
而CEC是采用电场推动流动相。
其线速度是与柱的直径和填微粒的大小无关的，因而在毛细管中几乎没有流速梯度。
谱带展宽效应相应的就十分小。
这点是CEC与HPLC的本质差别，也是CEC效率高于HPLC的根本。
（上海通微）。
色谱分析法第九章 毛细管电泳法简介-精品文档
5)CGE中使用改性剂
9.5.4毛细管等电聚焦(CIEF) 1)毛细管等电聚焦原理
毛细管等电聚焦属于毛细管电泳中的一种聚焦技术类型，其溶
质通常是蛋白质，分离基于蛋白质等电点(PI)的差异。毛细管内充 满两性电解质和蛋白质溶液，加上一个电场，在毛细管中产生一个
pH梯度。各种蛋白质因为它们的等电点不同，而在毛细管内聚焦为
图9.6 溶质通过毛细管的顺序
图9.7阳离子、中性分子、阴离子 的电泳谱图
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1)电渗流的作用 2)电渗流的产生
图9.8 电渗流的产生
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图9.9 不同驱动力的流型和相应的谱带峰形 3)电渗流的速度和迁移率 (1)电场强度
(2)缓冲液的pH值
子的尺寸和离子所带电荷的大小和符号。
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图9.1 毛细管电泳示意图 9.1.2区带电泳 9.1.3引起区带扩散的因素 9.1.4管的直径对对流扩散的影响
9.1.5介质中的电泳
9.1.6毛细管电泳
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9.2毛细管电泳体系 9.2.1概述 从概念上来讲，毛细管电泳体系比较简单。如图9.2所示，其 主要组成有样品池、入口池、出口池、毛细管、检测器、高压电 源、数字结果处理设备，如一台分析仪或一台计算机。
许多狭小的区带。毛细管内的溶液在动力作用下通过检测器而产生 电泳图。
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2)毛细管内形成pH梯度 3)等电聚焦
图9.13 CIEF分离机理示意图
毛细管电色谱技术
毛细管电色起来的一种新型分离分析技术。 按流动相驱动力的不同,可分为 电渗流驱动毛细管电色谱和电 渗流与压力联合驱动的毛细管 电色谱。
毛细管色谱法的应用
目前已用于各种复杂混合物分析， 包括大气及环境污染物质、生物 试样、食品、矿物燃料、宇宙物 质和一些无机物及金属有机物等。
毛细管色谱柱组成
毛细管色谱柱由柱管、压帽、 卡套（密封环）、筛板（滤 片）、接头、螺丝等组成
毛细管色谱柱可分为
多微填空 孔填充心 层充毛柱 空柱细、 心 管 柱 柱 、
毛细管电色谱技术的特点
色谱柱温度极限：一根色谱柱通常有两 个温度极限，温度下限和温度上限。如 果在低于温度下限的条件下实验，得到 的色谱峰又圆又宽(柱效降低)。但是色 谱柱并不会受到什么损坏。这样并不能 发挥色谱柱的正常功能。在达到下限温 度或者高于下限温度时，得到的色谱峰 会有明显的好转。
色谱柱容量：色谱柱容量是指色谱 柱对一种溶质可容纳的最大量值， 一旦超过此数值，该溶质的色谱峰 就会发生畸变，也就是说该溶质超 载。
毛细管电色谱基本原理及设计要求
毛细管电色谱基本原理及设计要求毛细管电色谱是80年代末发展起来的一种新型分离分析技术。
按流动相驱动力的不同,可分为电渗流驱动毛细管电色谱和电渗流与压力联合驱动的毛细管电色谱。
前者可在一般的毛细管电泳商品仪器上进行,是目前研究较多的一类。
在这种电色谱中,既引入了高选择性的色谱固定相,提高了电泳的分离能力,又克服了压力驱动的压力流引起的区带展宽,可以实现高效、高选择性分离。
但是因电渗流的限制,难于驱赶出电泳过程中产生的气泡,实验常因气泡而中断。
在电渗流与压力联合驱动的毛细管电色谱中,液相泵产生的压力流可以将操作中产生的气泡冲出毛细管或者使气体在高压下溶解,不仅是流动相的平均线速度比相同条件下HPLC大,缩短分析时间,而且能减少压力流引起的区带展宽,使分离效率比HPLC明显提高。
若利用HPLC的进样和检测装置,可使其重现性和定量性优于毛细管电泳(CE)。
此外,还能像HPLC那样进行梯度洗脱,使分离能力进一步提高。
因此,有效的梯度洗脱是所开发仪器应有的重要功能。
在电渗流与压力联合驱动的毛细管电色谱中,被分离组分按照它们的容量因子在固定相和流动相之间进行分配,溶质的流动速度决定于它们的电泳淌度、电渗流和流动相的压力。
电色谱的分离选择性包括两部分的贡献[5],即溶质在两相间的分配对分离选择性的贡献和电场作用溶质的泳动对分离选择性的贡献。
当电场的作用与分配的作用相一致时,CEC将表现更高的选择性。
否则两者作用相互抵消,降低分离的选择性。
在相同的表现线速度下,若电场驱动的流向与压力流方向相同,此时电场的作用有助于提高柱效;反之,电场的作用将降低柱效。
所以,选择能使分配与电场协同作用的分离条件对提高选择性和增加柱效都非常重要,这些条件包括电场方向及强度、洗脱液的流速及组成和固定相的种类等。
(上海通微)。
毛细管电泳的基本原理及应用剖析
毛细管电泳的基本原理及应用剖析毛细管电泳（CE）是一种基于电场作用的色谱分离技术，广泛应用于生物学、医药、环境、食品等领域。
它通过在毛细管中施加电场，利用样品中的带电粒子在电场作用下发生迁移分离，最终在检测器上形成峰。
毛细管电泳具有分离效率高、样品消耗量少、实验时间短等优点，因此被广泛研究和应用。
电动力作用是指在电场作用下，带电粒子会迁移，其迁移速率与电荷大小、电场强度和粒子大小有关。
这个原理形成了毛细管电泳的分离能力。
在毛细管电泳中，带有不同电荷的离子在电场作用下会迁移到不同的位置，实现了分离。
电渗流作用是指在电场作用下，电解质溶液中的离子在毛细管内部形成一个电化学双层，从而形成了定向的流动，这种流动称为电渗流。
电渗流的作用是维持溶液流动的速度和方向，使得样品能够快速地通过毛细管。
1.生物学：毛细管电泳在DNA分析、蛋白质分析和细胞生物学中有重要应用。
例如，DNA测序、突变分析和基因检测等都可以通过毛细管电泳实现。
此外，毛细管电泳还可以用于血清蛋白质分析，从而帮助研究疾病的诊断和治疗。
2.医药：毛细管电泳在药物分析中有广泛的应用。
例如，在药物代谢研究中，毛细管电泳可以用于分析药物及其代谢产物。
此外，毛细管电泳还可以用于药物纯度和含量的测定，以及药物的质量控制和研发。
3.环境：毛细管电泳在环境监测中有重要的应用。
例如，通过毛细管电泳可以分析水、土壤和大气样品中的有机物、金属和其他污染物。
此外，毛细管电泳还可以用于监测和分析环境中的微量物质，如重金属、农药残留、有机污染物等。
4.食品：毛细管电泳在食品检测和质量控制中有广泛应用。
例如，可以利用毛细管电泳对食品中的营养成分、添加剂和农药进行分析和检测。
此外，也可以通过毛细管电泳对食品中的毒素和致病菌进行检测，确保食品的安全性。
综上所述，毛细管电泳是一种重要的色谱分离技术，其基本原理是利用电场作用使带电粒子在毛细管中迁移分离，并且具有分离效率高、样品消耗量少等优点。
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研毛
芳香化合物后，逐渐引起人们的重视，关于CEC的文章陆续得到了报道。
细 1987年特别是在Knox[6,7]从理论上阐述了CEC高效性的特点以后，毛细管
究
管 电
电色谱才真正的得到了飞速发展并成为一个新的研究方向。
现
色 谱
[2] Mould,D,L, Synge,R.L.M. Analyst. 1952, 77:963-968 [3] Pretorius.V, et al. J. Chromatogr., 1974, 99:23-30
CEC基本原理
1微型分离技术 2micro-HPLC 和 CE的结合 3电渗流 (EOF) 为流动向的推动力 4二维分离机理：液相色谱和电泳之和 （分配和电泳淌度）
历 史 回 顾
一、毛细管电色谱发展进程 1952年Mould 和Synge[2]首次在色谱分析上使用了电渗流，他们在薄层色
谱上利用电场分离了胶棉中的多糖化合物。 1974年Pretorius[3]才首次成功地实现了在填充毛细管液相色谱中用电渗流
状
研 究
进
展
[4] Otsuka.S ,et al. Anal.Biochem., 1980,102:419-422 [5] Jorgenson, J,W, et al. J. Chromatogr., 1981,218:209-216 [6] Knox.J,H, et al. Chromatographia, 1987,24:135-143 [7] Knox.J,H. Chromatographia, 1988,26:329-337
展
CEC 的保留机制：
CEC= µHPLC+CE
依靠电渗流(EOF)或电渗流结合压力 流推动流动相，使中性和带电荷的样 品分子根据它们在色谱固定相和流动 相间吸附、分配平衡常数的不同和电 泳速率不同而达到分离分析；
CEC的理论塔板数远远高于HPLC；
既能分离带电物质，也能分离中性 物质；
Fig.3. CEC combines the strengths of two powerful analytical techniques —— CE and µHPLC
取代泵，并获得了比传统液相色谱高的柱效能，但是由于Pretorius当时所 用的柱子管径较大 ，因此CEC的优越性没有得到充分展示，所以在70年代 后期 ，此法没有得到充分重视。
和
直到1980年Otsuka[4]才又发表了一篇有关CEC的文章。 1981年Jorgenson等[5]用CEC分离了两种毛细管区带电泳难以分离的电中性
Fig.7. Electrochromatogram showing the CEC separation of 16 PAHs within 2.5 minutes
存在的问题：
在传统的CEC模式中，由于焦耳热效应，常常会遇到气泡和“柱内干涸”等问 题；
气泡的出现会导致基线不稳、重现性不好、电渗流的中断等现象；
目前，pCEC研究的热点：
(1)CEC理论的研究； (2)仪器联用技术的发展； (3)梯度洗脱技术； (4)毛细管柱的制备（填充柱或整体柱）； (5)芯片技术； (6)应用领域拓展（环境分析，食品分析，生化分析
K＝K’＋k’(μep/μeof)+(μep/μeof)－－－－（1）
K—是CEC的容量因子 K’—是在CEC中单纯色谱因素引起的容量因子 μep－为溶质的电泳淌度 μeof －为流动相的电渗淌度
和
讨论：
研 毛 （1）对于中性化合物，μep 为零，K’等于K－－反应纯粹的色谱过 细程
究管 电
（2）对于不保留的带电化合物，K’为零－－反应纯粹的电泳过程
在传统的CEC系统中加入一个u-HPLC泵，依靠电渗流结合压力流的模式来驱 动流动相的一种新技术，就是熟悉的加压毛细管电色谱（pressurized capillary electrochromatography ，简称pCEC)
pCEC
(1)改变泵压可有效地调节样品中各组分的保留，提高分离度； (2)有效地缩短样品的分析时间； (3)减少流动相和毛细管中气泡生成的可能性； (4)易于实现梯度洗脱；
色 （3）对于有保留的带电化合物，色谱和电泳机理同时起作用，因此
现
谱 研
CEC既能分离电中性物质，又能分离带电物质。
状
Байду номын сангаас究 进
[9] Colon,L,A, Guo Y, Fermier,A. Anal Chem, 1997,69(15):461 [10] Rathore,A,S, Horvath,C. J Chromatogr, 1996,743:231
[8]Momika M.Dittmann Gerard P.Rozing. Journal of Chromatography A, 744(1996)63-74.
历 史
二、毛细管电色谱基本原理 CEC的保留机理[8,9]
如同HPLC：基于溶质在固定相和流动相间相互作用的不同。
回 顾
如同CZE：基于溶质电泳淌度的不同。
历
史
回
顾
和
研
毛 细
究
管 电
色
现
谱 研
状
究 进
展
二、毛细管电色谱基本原理 CEC与HPLC原理的比较 CEC：是采用具有塞状流型的
电渗流推动流动相，其线 速度是与柱的直径和填料 颗粒大小无关的。因而在 毛细管中几乎没有流速梯 度，谱带展宽效应很小。
HPLC：是采用压力驱动流动 相，流速随填料颗粒大小 和柱长而变化，流速在管 中呈抛物线状轮廓，因而 造成谱带展宽和柱效的降 低。
图5. 不同分离模式下的谱带展宽
CEC的优势：
柱效
理论塔板数
CEC： 104－105 plates/m
HPLC： 103－104 plates/m
Fig.6. the rapid and high- efficiency separation of PAHs with CEC-LIF
CEC的优势： 快速
历
史
回
顾
和
研
毛 细
究
管 电
色
现
谱 研
状
究 进
展
三、毛细管电色谱的操作模式 用电渗流驱动的电色谱
由于仪器结构简单，应用面比较广。 用电渗流和泵双重驱动的电色谱
优点：避免在分离过程中气泡的产生，同时可以用 泵来控制 流速，缩短分离时间。
CEC的优势： 减小谱带展宽
图4.电驱动和压力驱动下的流形比较