毛细管电色谱
第五章 高效毛细管电泳和电动色谱
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3Leabharlann 101三、毛细管凝胶电泳
毛细管凝胶电泳 CGE）：按照试样中各个组 分相对分子质量的大小进行分离的方法。 用途：常用于蛋白质、寡聚核苷酸、核糖核 酸、DNA片段的分离和测序及聚合酶链反应产 物的分析。CGE能达到CE中最高的柱效。
• 毛细管等电聚焦是基于不同蛋白质或多肽之 间等电点的差异进行分离的电泳技术。 • 毛细管等电聚焦最具特色的应用是测定蛋白 质的等电点。在异构酶鉴定、单克隆抗体、 多克隆抗体、血红蛋白亚基等研究中，经常 用毛细管等电聚焦。
五、亲和毛细管电泳
亲和毛细管电泳是利用配体与受体之间存在特异性 相互作用，可以形成具有不同荷-质比的配合物而达 到分离目的。
梯度升压方式对毛细管电泳分离的影响 A. 2kV至25kV，0min，一步升压；B.2kV至25kV，5min，线性梯度 升压. 样品：β-乳球蛋白A，溶菌酶，细胞色素C，肌红蛋白，微白蛋白
二、毛细管及其温度控制
毛细管电泳柱作为分离分析的载体，其材料、 形状、内径、柱长、温度对分离度和重现性都 有影响。
缓冲液中加入添加剂，并让缓冲液与毛 细管充分平衡.如加入阳离子表面活性剂 十四烷基三甲基溴化铵(tetradecyl trimethyl ammonium bromide ,TTAB)， 能在内壁形成物理吸附层，使EOF反向. 添加剂还有聚乙烯亚胺、甲基纤维素 (MC)、十六烷基溴化铵(CTAB)等。
毛细管电泳和毛细管电色谱
其他领域
毛细管电泳还应用于食品分析 、冶金、地质等领域，可用于 金属离子、矿物成分等的分离
和检测。
02 毛细管电泳技术
CHAPTER
进样技术
压力进样
通过施加压力使样品进 入毛细管，适用于大体
积样品。
电动进样
利用电场力驱动样品进 入毛细管，适用于低粘
电解质浓度
影响电场强度和离子迁移率。
温度
影响分子热运动和扩散系数。
毛细管材料和内壁处理
影响样品在毛细管内的吸附和分离效 果。
03 毛细管电泳实验
CHAPTER
实验流程
安装毛细管
选择合适的毛细管，将其插入 仪器，确保密封良好。
运行实验
设定合适的实验参数，如电压、 温度、检测波长等，开始实验。
准备毛细管电泳仪
进系统
用于将样品注入到毛细管中。
实验材料
毛细管
具有微米级内径的玻璃或石英管，是电泳的分离通道。
电解质溶液
用于提供电泳所需的离子环境。
样品
待测物质，需进行适当预处理。
清洗液
用于清洗毛细管和仪器，保持实验的准确性。
04 毛细管电色谱简介
CHAPTER
定义与原理
定义
毛细管电色谱（CEC）是一种将高效电泳分离与高效液相色谱的固定相相结合 的分离技术。
亲和电泳
利用特异性亲和作用进行分离 ，如抗体-抗原、酶-抑制剂等
。
检测方法
紫外可见光谱
利用紫外可见光谱检测分离出的组分。
电化学检测
利用电化学方法对分离出的组分进行检测。
荧光检测
利用荧光物质标记待测组分，通过荧光信号 进行检测。
毛细管电色谱的方法原理与应用课件
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05
毛细管电色谱的未来发展与挑战
微型化与集成化
将毛细管电色谱技术向微型化、集成化方向发展，实现便携式、低成本、高效率的分析设备。
智能化与自动化
引入人工智能、机器学习等技术，实现毛细管电色谱的智能化和自动化分析，提高分析效率和准确性。
新型分离材料的研发
探索和开发新型的分离材料，如纳米材料、多孔材料等，以提高毛细管电色谱的分离效率和选择性。
毛细管电色谱的方法原理与应用课件
目录
contents
毛细管电色谱概述 毛细管电色谱的方法原理 毛细管电色谱的应用 毛细管电色谱的实验技术与操作 毛细管电色谱的未来发展与挑战
01
毛细管电色谱概述
01
02
毛细管电色谱概述
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高效毛细管电泳色谱仪的介绍
高效毛细管电泳色谱仪的介绍前言高效毛细管电泳色谱仪（High Performance Capillary Electrophoresis）简称CE，是一种用于分离、检测和定量小分子有机化合物及生物大分子（如蛋白质、核酸等）的分析仪器。
与传统的色谱技术相比，CE具有分离速度快、分离效果好、耗时少、消耗试剂和样品量少等优点，因此广泛应用于医药、生物、环境等领域的分析和检测。
原理CE是利用毛细管中的电泳作用使样品离子在电场力下向电极运移，通过毛细管壁上的化学修饰、填充剂和区带电荷来实现分离，并通过荧光检测器等检测器来检测和定量分离后的样品成分。
优点分离速度快毛细管内径小，距离相对短，使得样品离子的迁移速率快，从而实现快速分离。
分离效果好毛细管表面可以进行化学修饰和填充剂处理，通过组分间的电荷、氢键、范德华等相互作用，进一步增强样品分离能力。
耗时少样品分离后直接进行检测，无需进一步净化、萃取等操作，减少了样品制备的时间。
消耗试剂和样品量少毛细管内径小，所需样品量和试剂量大大减少，节约了分析成本。
系统组成CE主要由毛细管容器、高压电源、检测器、数据采集系统等四部分组成。
毛细管容器毛细管容器是对样品进行分离的主体，通常是具有内径为5-75μm的管（通过融离池、拉伸等方法得到），通过氧化铟、二氧化硅等材料修饰表面，增加毛细管和分离物之间的作用力和优化分离效果。
毛细管容器通过两端接口一个容纳高压电源的阳光非金属管，并与检测器连接。
高压电源高压电源主要是为毛细管提供足够的驱动力，使样品能够快速通过毛细管，一般的工作电压为2-30kV之间。
检测器检测器通常使用荧光检测器、紫外检测器、折射率检测器和质谱检测器等，常见的是荧光检测器。
荧光探测器最适用于无色或淡黄色的样品，因为它可以通过激发荧光产生亮丽的蓝光来检测和定量测量毛细管中的分离样品。
数据采集系统数据采集系统主要用于记录和处理从检测器输出的信号，并将其转换为可读的图形或数字信号，以便进一步分析和研究。
高效毛细管电泳色谱仪电泳基本概念
高效毛细管电泳色谱仪电泳基本概念一、简介高效毛细管电泳色谱仪（Capillary Electrophoresis, CE）是一种利用电场对带电化合物进行分离的技术。
它可以用来分离带正电荷、负电荷或无电荷的化合物，且在分离过程中不需要添加外部成分，如胶体或分离介质，因此不会改变样品的组成。
CE具有分离速度快、样品消耗少、自动化程度高和分离精度高等特点，在生物、医药和环境等领域得到了广泛应用。
二、电泳原理在CE中，带电荷的样品离子在电场中移动，移动速度与带电离子的电荷数和电场力大小成正比。
由于样品分子的大小、形状和电荷都不相同，它们在电场中的移动速度也各不相同，因此分离出不同成分的样品提供了可能。
CE通过在一根毛细管内施加高电场，使带电离子向着管底方向移动，借此实现所有样品分子的分离。
三、电泳参数CE基本的电泳参数包括电场强度、毛细管内液体pH值、毛细管壁面涂层、电容耦合、温度等。
1.电场强度：CE中的电场强度通常在10-100 kV/m之间，由于呈现出非线性的行为，这个参数对电泳速度和分离能力有着重要的影响。
2.pH值：毛细管内液体pH值的选择和调整是CE中的一个重要环节。
通常选择分析物理化性质相似的缓冲液，以使质氢或氢氧离子浓度在毛细管内始终保持一定水平。
3.微粒衬底：在一些情况下，添加微粒衬底可以增加分离能力和电泳效率，但是同样也会使分辨率降低。
4.温度：温度对分离速度、分离度和电泳峰形都有影响，通常情况下，温度越高，电泳速度会越快。
四、毛细管电泳色谱仪毛细管电泳色谱仪（Capillary Electrophoresis Instrument, CEI）包括注射器、毛细管、高压电源、检测器和控制软件等部件。
其中，注射器和毛细管是CE中最关键的部件。
毛细管通常是由非活性材料制成的，如硅胶或石英玻璃。
常用的检测器包括荧光检测器、紫外-可见光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
五、应用CE在分析各种样品中有着广泛的应用，包括各种生物分子、有机和无机化合物、药物、食品、环境和化妆品样品。
毛细管电色谱技术
毛细管电色起来的一种新型分离分析技术。 按流动相驱动力的不同,可分为 电渗流驱动毛细管电色谱和电 渗流与压力联合驱动的毛细管 电色谱。
毛细管色谱法的应用
目前已用于各种复杂混合物分析， 包括大气及环境污染物质、生物 试样、食品、矿物燃料、宇宙物 质和一些无机物及金属有机物等。
毛细管色谱柱组成
毛细管色谱柱由柱管、压帽、 卡套（密封环）、筛板（滤 片）、接头、螺丝等组成
毛细管色谱柱可分为
多微填空 孔填充心 层充毛柱 空柱细、 心 管 柱 柱 、
毛细管电色谱技术的特点
色谱柱温度极限：一根色谱柱通常有两 个温度极限，温度下限和温度上限。如 果在低于温度下限的条件下实验，得到 的色谱峰又圆又宽(柱效降低)。但是色 谱柱并不会受到什么损坏。这样并不能 发挥色谱柱的正常功能。在达到下限温 度或者高于下限温度时，得到的色谱峰 会有明显的好转。
色谱柱容量：色谱柱容量是指色谱 柱对一种溶质可容纳的最大量值， 一旦超过此数值，该溶质的色谱峰 就会发生畸变，也就是说该溶质超 载。
毛细管电色谱基本原理及设计要求
毛细管电色谱基本原理及设计要求毛细管电色谱是80年代末发展起来的一种新型分离分析技术。
按流动相驱动力的不同,可分为电渗流驱动毛细管电色谱和电渗流与压力联合驱动的毛细管电色谱。
前者可在一般的毛细管电泳商品仪器上进行,是目前研究较多的一类。
在这种电色谱中,既引入了高选择性的色谱固定相,提高了电泳的分离能力,又克服了压力驱动的压力流引起的区带展宽,可以实现高效、高选择性分离。
但是因电渗流的限制,难于驱赶出电泳过程中产生的气泡,实验常因气泡而中断。
在电渗流与压力联合驱动的毛细管电色谱中,液相泵产生的压力流可以将操作中产生的气泡冲出毛细管或者使气体在高压下溶解,不仅是流动相的平均线速度比相同条件下HPLC大,缩短分析时间,而且能减少压力流引起的区带展宽,使分离效率比HPLC明显提高。
若利用HPLC的进样和检测装置,可使其重现性和定量性优于毛细管电泳(CE)。
此外,还能像HPLC那样进行梯度洗脱,使分离能力进一步提高。
因此,有效的梯度洗脱是所开发仪器应有的重要功能。
在电渗流与压力联合驱动的毛细管电色谱中,被分离组分按照它们的容量因子在固定相和流动相之间进行分配,溶质的流动速度决定于它们的电泳淌度、电渗流和流动相的压力。
电色谱的分离选择性包括两部分的贡献[5],即溶质在两相间的分配对分离选择性的贡献和电场作用溶质的泳动对分离选择性的贡献。
当电场的作用与分配的作用相一致时,CEC将表现更高的选择性。
否则两者作用相互抵消,降低分离的选择性。
在相同的表现线速度下,若电场驱动的流向与压力流方向相同,此时电场的作用有助于提高柱效;反之,电场的作用将降低柱效。
所以,选择能使分配与电场协同作用的分离条件对提高选择性和增加柱效都非常重要,这些条件包括电场方向及强度、洗脱液的流速及组成和固定相的种类等。
(上海通微)。
毛细管气相色谱分析法
在环保领域的应用
空气质量监测
毛细管气相色谱分析法可用于检测空气中的有害气体和挥发性有机物，帮助评 估空气质量状况。
废水处理
毛细管气相色谱分析法可用于检测废水中的有害物质，如有机溶剂、农药等， 为废水处理提供技术支持。
在食品药品安全领域的应用
食品添加剂检测
毛细管气相色谱分析法可用于检测食品中的添加剂，确保食品添加剂符合安全标 准。
氢火焰离子化检测器通过燃烧反应将 物质转化为带电粒子，并用电场将其 分离和检测，适用于烃类物质的检测。
定性与定量分析方法
定性分析
通过比较已知物质的色谱特征（如保 留时间）来确定未知物质。
定量分析
通过测量已知浓度标准物质的色谱峰 面积或峰高，利用外标法或内标法计 算未知物的浓度。
03 毛细管气相色谱分析法的应用
毛细管气相色谱分析法
目录
CONTENTS
• 毛细管气相色谱分析法简介 • 毛细管气相色谱分析法的基本理论 • 毛细管气相色谱分析法的应用 • 毛细管气相色谱分析法的实验技术 • 毛细管气相色谱分析法的优缺点及未来发展
01 毛细管气相色谱分析法简介
CHAPTER
定义与原理
定义
毛细管气相色谱分析法是一种分离和分析复杂样品中各组分的方法，利用不同组分在固定相和流动相之间的分配 平衡进行分离，并通过检测器进行检测。
萃取
对于不易溶解的样品，需 要进行萃取操作，以提高 样品的提取效率。
净化
去除样品中的杂质，以提 高色谱分析的准确性和可 靠性。
进样技术
直接进样
将溶解或萃取后的样品直 接注入进样口。
分流进样
通过分流装置将样品分成 两路，大部分样品被排入 废液，小部分样品被引入 进样口。
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毛细管电色谱(ＣＥＣ)
近年来发展起来的一种新型微分离分析技术,这种分离模式结合了高效液相色谱(ＨＰＬＣ)和毛细管区带电泳(ＣＺＥ)的特征,溶质可以按多种机制在柱内完成分离。
毛细管电色谱为纳升级技术,适合与质谱(ＭＳ)方法联用。
将ＣＥＣ分离速度快、柱效高和样品、试剂用量少等特点与ＭＳ能提供精确分子量和结构信息、灵敏度高以及专属性强等功能相结合,为复杂生化、环境等样品的定性、定量分析提供了强有力的工具。
（最后的荣耀，丁香园战友）
光色谱：
90年代中期出现的利用辐射力和流体介质分离粒子的新方法,在生物大分子的分离及研究中有广泛应用前景。
光色谱的概念首次由日本福岗九州大学工学院化学工程系的今板藤太郎等人提出,几年来该研究小组在光色谱理论、应用等方面做了许多工作,大大推进了光色谱的发展。
光色谱是指以激光的辐射压力为色谱分离的驱动力,在毛细管中将待分离组分(或粒子)按几何尺寸的大小予以分离的技术。
今板藤太郎等人的研究表明,与其它色谱分离技术相比光色谱具有许多独特之处，以下列举一些：(1)进样简单；(2)改变分离操作条件简单；(3)不需要标准物质对照定性；(4)通过适当地延长测定时间可以比较准确地测定粒子的位置，提高分离度；(5)色谱柱的尺寸可以减小至微米级，可以为微米区域内的化学或分子生物研究提供场所。
（最后的荣耀，丁香园战友）
离子色谱（IC）：
作为高效液相色谱（HP LC）的一种，是分析离子的一种新的液相色谱方法。
由于操作简便，对常见阴阳离子分析的高灵敏度，特别是对阴离子和价态形态分析的突出优点，已广泛应用于环境、电厂、半导体、食品卫生、石油化工和生命科学等领域。
世纪著名色谱学家G.Guiochon认为，近30年来气相色谱（GC）和高压液相色谱（HP LC）取得了辉煌成就。
在GC 和HP LC中；HP LC是应用最广泛，发表文献最多的一个领域。
1977年后，以6%-8%的速度递增，其中离子色谱是最活跃的领域之一。
离子色谱作为实验室中常规分析手段，近几年发展的趋势主要集中在以下几方面：高性能的分离柱和抑制器的研究；减少人为误差，提高自动化程度；离子色谱分析方法成为国家、各行业中某些项目特别是阴离子“标准分析方法”的数量不断增加；增加数据容量和数据集中管理使用。
本文着重讨论第一方面的进展。
分离柱和抑制器是IC的关键部件，一直是IC研究的热点，随着新型离子交换柱填料的发展，IC技术已成功地扩展到复杂基体中有机和无机离子的分析。
新型的高聚物离子交换材料除了离效之外，在pH0-14以及在与水互溶的有机溶剂中稳定。
可用强酸和强碱作流动相，也可在流动相中加入有机溶剂调节和改善分离的选择性以及色谱峰的对称性，缩短疏水性化合物的保留时间，用有机溶剂清洗色谱柱的有机污染物以延长柱子的使用寿命。
IC固定相发展的另一个方向是高容量柱，其离子交换容量较常用柱高10-20倍，可改善弱保留离子的分离和峰形，而且高浓度基体的样品和相邻两峰浓度比高1000：1的样品可直接进样，简化样品的前处理过程。
对羟基（OH-）选择性的新型分离柱，用氢氧化钠或氢氧化钾作流动相，因其抑制反应产物为水，背景电导低，可提高检测灵敏度和减小梯度淋洗时的基线漂移，改善弱保留离子的分离。
这些新型柱填料的问世，改善了分离的选择性，简化了样品前处理步骤，提高了分析结果的准确度。
简单而有效地解决了化学方式或样品前处理方法难以解决的很多问题。
IC对分析化学的突出贡献是阴离子分析，IC已成为分析阴离子的首选方法。
IC的硬件和应用发展很快，最近在硬件上的一项突破是“只用水”，淋洗液因线发生器与自动再生抑制器结合，不用化学试剂，只需高纯水就可完成阴、阳离子的分析。
使用化学试剂，手工配制所需要的浓度的淋洗液一直是液相色谱分析中不可缺少的步骤。
“只用水”仅需点击计算机鼠标即可得到所需浓度的淋洗液。
“只用水”，不仅免用化学试剂、消除化学试剂杂质和大气中二氧化碳溶入碱性溶液的干扰，而且可排队由于配制溶液操作和人为因素等所引起的误差，使分析结果的精密度和准确度明显提高。
“只用水”装置简单，但包含了综合性的高科技。
其基本原理是在氢氧化钾电解池中置入的微形铂金电极（正极）电解水产生的氢离子（H+），推动电解池中的钾离子（K+）通过阳离子交换膜，进入置入铂金阴极的淋洗液发生舱，与阴极电解水产生的羟基（OH-）结合生成IC的淋洗液氢氧化钾（KOH）。
离子交换膜的功能除了允许阳离子（或阴离子）通过之外，还隔离常压区（电解池）与高达210大气压的高压区（泵→分离柱→检测器）。
淋洗液的浓度与外加电流成正比，与泵的流速（泵入的高纯水）成反比。
所需要浓度的淋洗液不再经过泵前的管道和阀门以及泵头。
直接进入分离柱，不仅操作简便，无污染，而且带来另一个突出的优点，使液相色谱中梯度（浓度梯度）淋洗非常简单。
常规梯度淋洗的完成需要用两个或多个高压泵，或者用四通比例阀泵前低压混合。
“只用水”作梯度淋洗也只需点击鼠标。
IC硬件发展的另一个
趋势是用2mm小孔径柱，常用的标准孔柱的内径为4mm。
因为用于小孔径柱的流动相用量较标准孔径柱的用量减少3 -6倍，而且对相同的进样体积，用小孔径柱时的质量灵敏度增加4倍。
但小孔径柱对填料粒度的均匀性、柱管、填充技术以及泵在低流量时的准确度要求更高。
IC的应用发展很快，近年来与有关监管部门合作，在环境、食品卫生等领域提出并公布了一系列标准分析方法。
现在医学已证明馀用水消毒中所产生的副产品，如卤素含氧酸、溴酸、次氯酸和氯酸盐等，对人体有毒害性，一些国家已作为法规必须检测，如美国要求所有自来水公司必须将其作为每天的常规检测项目严格控制其含量。
但方法难度很大，因为在饮用水中氯与卤素含氧酸的浓度差大到5个数量级以上，用特殊选择性的高容量柱不作复杂的化学前处理，就很好的解决了这个问题。
今年9月在法国尼斯召开的国际离子色谱学术报告会上，离子色谱在饮用水分析中的应用是会议三个主要议题之一。
IC应用的一个新的突破是氨基酸分析，对氨基酸的分析一直沿用的方法是用特殊的化学试剂与氨基酸进行柱前或柱后衍生反应，用紫外或萤光检测。
不仅仪器结构复杂，操作费时，而且影响因素多，难以掌握。
新的氨基酸IC直接分析方法不需要柱前或柱后衍生。
基于氨基酸的羧基（-COOH）在强碱性介质中以阴离子形态存在；氨基酸的氨基（-NH2）在电场中可被氧化。
因而直接在高pH稳定的有机高聚物阴离子交换树脂填充的柱上，用氢氧化钾作流动相，阴离子交换分离，脉冲安培检测。
方法操作非常简便，选择性好，灵敏度高。
现代IC仪是涉及多学科的综合性高科技。
与国际水平相比，我们目前的IC仪在硬件和软件方面确实存在不小的差距，特别是消耗性部件分离柱和抑制器的性能差距，使进口仪器占据了国内主要市场。
生物膜色谱技术以生物膜或模拟生物膜为固定相，当混合药物随流动相通过的时候，由于不同物质与膜的作用强度的差别而表现出在膜上的不同保留性能，根据这种差别就可以对它们进行分离分析。
药物在生物膜色谱上的保留体积取决于药物与膜的相互作用、柱上固定化磷脂（或其他脂类尤其是胆固醇、蛋白与磷脂的比例）的量，以及药物与凝胶基质的相互作用等诸多因素。
为了表示药物在生物膜色谱上的保留性能，定义了一个与磷脂的量及药物与基质的相互作用均无关的容量因子，并可由下面的方程式得到：VR－V0＝Ks×A＋C
式中VR为药物在有脂质体或脂微球的色谱柱上的保留体积；V0为药物在无脂质体或脂微球的色谱柱上的保留体积；K s为斜率，容量因子；A为固定化磷脂的量；C为由药物与基质的相互作用所决定（理论上为零）。
用于色谱研究的生物膜主要有三种：固定化膜（IAM）、细胞膜微球以及脂质体。
可用于研究药物与生物膜的相互作用，进行药物的体外筛选和活性评价。
这种技术在国内大连化学物理所的邹汉法研究较多。
最近好像南药的李萍又申请了一项国家自然科学基金。
（bigwatch，丁香园准中级站友）。