克隆简单流程
分子克隆实验流程
分子克隆实验流程一、引物的稀释1、引物干粉冻存于-20℃，用前12000rpm离心1min；2、按引物管上的nmol数稀释，nmol=4.92，加49.2µL ddH2O至100µM；3、稀释至10µM（5µL引物F+5µL引物R+40µL ddH2O）二、目的基因的扩增实验前准备：生物安全柜紫外照射30min，模板DNA、水、引物、buffer，dNTP提前10min拿出解冻，用75%酒精擦拭移液器及台面。
扩增体系：Reagent 25µL 50µL10xbuffer (含Mg2+) 2.5µL 5µLdNTP (10mM) 0.5µL 1µLrT aq酶0.25μL0.5μLprimer (10μM) 1.25μL 2.5μLTemplate DNA 2μL4μLddH2O 18.5µL 37µL反应程序：（延伸时间按目的片段大小进行调整）95℃预变性3min（95℃变性30 s，60℃退火30s，72℃延伸45s）x3572℃后延伸7min4℃保持电泳：120V，加2µLloading buffer，上样5µL，1000bp marker 5µL小胶：2%，0.6g琼脂糖，30ml 1xTAE中胶：2%，1g琼脂糖，50ml 1xTAE大胶：2%，2g琼脂糖，100ml 1xTAE三、目的产物切胶回收（试剂盒）四、连接实验前准备：SolutionI在冰上融化连接体系：Reagent 10µL胶回收DNA(50ng/μL)4µLPDM-18T载体1µLSolution I 5µL反应条件：16℃，4h（PCR仪，热盖105℃）/ 4℃过夜五、转化实验前准备：开启42℃水浴锅实验步骤：样品+阴性对照（无质粒）+阳性对照（感受态带的质粒）1、把感受态细胞TOP10从-80℃冰箱拿出并放置于冰上解冻；2、每管分装30 - 50μL感受态细胞（冰浴）；3、向感受态细胞中加入5μL连接产物，冰浴30min。
实验室克隆技术解析
实验室克隆技术解析实验室克隆技术是一种重要的生物技术手段，被广泛应用于生物学研究、医学领域以及农业生产中。
通过克隆技术，科学家们可以复制出与原始生物基因完全相同的个体，为研究和应用提供了便利。
本文将对实验室克隆技术进行深入解析，包括其原理、方法和应用等方面。
一、克隆技术的原理实验室克隆技术的原理主要是利用细胞核移植技术，将一个个体的细胞核移植到另一个细胞内，使得受体细胞具有与供体细胞相同的遗传信息。
具体而言，克隆技术包括以下几个步骤：1. 选择供体细胞：通常选择成熟的体细胞作为供体细胞，如皮肤细胞、肌肉细胞等。
2. 提取细胞核：通过细胞核抽提技术，将供体细胞的细胞核提取出来。
3. 受体细胞准备：选择另一种细胞作为受体细胞，去除其原有的细胞核，留下空间待细胞核移植。
4. 细胞核移植：将供体细胞的细胞核移植到受体细胞内，形成克隆胚胎。
5. 植入母体：将克隆胚胎植入母体子宫内，发育成新个体。
二、克隆技术的方法实验室克隆技术主要有三种方法，分别是基因克隆、细胞克隆和生物体克隆。
1. 基因克隆：通过重组DNA技术，将感兴趣的基因片段插入到载体DNA中，形成重组DNA，再将其导入宿主细胞内，使宿主细胞表达该基因。
2. 细胞克隆：利用体细胞核移植技术，将供体细胞的细胞核移植到受体细胞内，形成克隆胚胎，再植入母体子宫内发育。
3. 生物体克隆：通过体细胞核移植技术，将供体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞内，再植入母体子宫内发育成新个体。
三、克隆技术的应用实验室克隆技术在各个领域都有重要的应用价值，主要体现在以下几个方面：1. 生物学研究：克隆技术可以帮助科学家研究基因功能、生物发育等重要问题，为生物学研究提供重要手段。
2. 医学应用：克隆技术可以用于治疗一些遗传性疾病，如克隆基因用于治疗疾病、克隆器官用于移植等。
3. 农业生产：克隆技术可以用于改良农作物品种、畜禽繁殖等，提高农业生产效率。
4. 繁殖保护：对于濒危物种的保护和繁殖，克隆技术也发挥着重要作用。
细胞克隆实验步骤及注意事项
细胞克隆实验步骤及注意事项实验步骤一、平板克隆形成实验基本步骤：1.取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。
2.将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、2 00个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。
置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。
3.经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。
弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。
加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。
然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
4.将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。
最后计算克隆形成率。
克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）×100%二、软琼脂培养克隆形成试验基本步骤：1.取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。
然后根据实验要求作梯度倍数稀释。
2.用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。
3.按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(1 0cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。
4.按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1. 2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。
待上层琼脂凝固后，置入37℃ 5%CO2温箱中培养10～14天。
克隆动物的技术流程
克隆动物的技术流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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基因克隆的基本过程
基因克隆的基本过程
基因克隆是运用分子遗传学技术来搜索和复制一个特定DNA片段的一种技术。
它通常
出现在生物技术领域，用来寻找一些有价值的 ORF （开放读码框）序列或特定的基因，
为生物的治疗和克隆细胞过程提供有益的信息。
克隆基因的基本过程包括以下步骤：
（1）分离目标基因：这步骤的目的是把目标基因的片段从细胞DNA中分离出来。
有
很多不同的方法可以达到这一目的，例如酶切和PCR（聚合酶链反应）。
（2）子宫2524h基因克隆。
把分离出来的DNA片段放入“质粒”当中，它是一种特
殊的DNA，可以被细菌识别。
然后把质粒放入到细菌，细菌会将这些DNA片段当作自己的
基因，并将这些基因嵌入到自己的DNA序列之中。
（3）转入和测序步骤。
把细菌克隆到多种媒介中，让它们繁殖，形成不同的克隆细
胞群。
然后把克隆细胞放入实验室，进行DNA测序，验证是否得到了想要的特定DNA序列。
（4）应用阶段：通过以上步骤得到的特定DNA序列，可以开发可以给人体带来益处
的基因工程制剂，以实现基因治疗的目的。
基因克隆的过程是相对复杂的，但它也成为了生物技术领域提供有效和有用的信息的
重要工具，帮助研究人员更好地了解和处理DNA序列，从而更好地促进生物学研究的进步。
基因克隆的顺序
基因克隆的顺序
基因克隆的顺序通常包括以下步骤：
1. 选择目标基因：确定需要克隆的基因，可以是某个特定的基因，也可以是一段DNA序列。
2. 提取DNA：从源生物体中提取目标基因的DNA，通常使用DNA提取试剂盒来提取。
3. 制备质粒：选择一个适当的质粒，将其准备好作为目标基因的载体。
质粒通常是一段环状的DNA分子，可以自复制并在细胞中稳定存在。
4. 执行DNA切割：使用限制性内切酶将目标基因和质粒切割成相应的DNA片段。
内切酶是能够识别特定DNA序列并在其特定的位置进行切割的酶。
5. 连接DNA片段：将目标基因的DNA片段与质粒的DNA片段连接起来。
这可以通过DNA连接酶来实现，DNA连接酶能够催化两个DNA片段的连接。
6. 转化宿主细胞：将连接好的质粒转化到宿主细胞中，通常使用细菌作为宿主细胞。
转化可以通过电穿孔、化学方法或热激转化等方式进行。
7. 筛选重组细胞：利用筛选性培养基或标记基因等方法筛选出含有重组质粒的
细胞。
8. 纯化重组质粒：从筛选出的重组细胞中提取重组质粒。
9. 分析重组质粒：对提取出的重组质粒进行测序、限制性酶切等分析，确认克隆基因的准确性。
10. 表达目标基因：如果希望表达克隆的基因，可以将重组质粒转化到表达宿主细胞中，例如真核细胞或类似细胞。
需要注意的是，基因克隆的具体步骤可能会因实验目的、实验方法和克隆体的复杂性而有所不同。
克隆技术的原理及过程
克隆技术的原理及过程
克隆技术是指利用生物学手段产生一种与原始个体基因完全一
致的后代。
克隆技术的原理是利用细胞分裂的能力和基因复制的原理，将一个成熟细胞的基因组复制到一个无性生殖的胚胎中，从而产生一个与原个体基因完全一致的后代。
克隆技术的过程可以分为以下几个步骤：
1.采集供体细胞：从一个生物体中采集一个成熟细胞，通常使用皮肤细胞或血细胞作为供体细胞。
2.细胞核移植：将供体细胞的细胞核移植到一个去核的卵细胞中。
这可以通过使用一个微针将细胞核插入卵细胞内来完成。
3.激活卵细胞：使用化学物质或电脉冲激活卵细胞，使其开始分裂。
4.移植胚胎：将发育良好的克隆胚胎移植到一个代孕母体中。
5.孕育后代：如果胚胎发育成功并且嵌入代孕母体，它将组成一个克隆胎儿并最终出生为克隆后代。
克隆技术具有广泛的应用前景，包括用于动物繁殖、药物开发、疾病治疗和农业生产等领域。
但是，由于克隆技术的伦理和道德问题，以及技术上的一些挑战，它仍然是一个备受争议和受限制的领域。
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细胞克隆实验过程及原理
细胞克隆实验过程及原理细胞克隆实验，听起来是不是有点高大上的样子？别担心，今天我就给大家扒一扒这个看似复杂的实验到底是个什么玩意儿！细胞克隆实验其实就是在实验室里把细胞像复制粘贴一样，生生造出一大堆一模一样的细胞。
说到这儿，你可能会问，为什么要这么做呢？哎，细胞克隆可不是为了让我们在朋友圈里发“我有一模一样的姐妹”那种图啊，而是为了科学研究、医疗应用和一些生物技术的开发。
现在，咱们就一步一步地来看这个过程和原理。
1. 实验准备1.1 材料准备在做细胞克隆实验之前，得准备好一堆材料。
首先，咱们需要细胞源。
可能是小鼠的细胞，也可能是人类的细胞，当然，如果你能找到外星细胞，那也是可以的，哈哈！然后呢，还得准备培养基，简单来说就是细胞的“饭”。
没有好吃的，细胞可不乐意生长啊。
再来就是培养器皿，比如培养皿、试管啥的。
这些都是细胞的“家”，细胞在里头就像人在家里待着一样，舒服得很。
还有一些必要的工具，比如移液管、显微镜，这些就像是科学家的“武器”，帮助我们观察和操作。
1.2 实验环境别忘了实验环境也很重要哦！细胞对环境要求可高了，温度、湿度、pH值都得调得刚刚好，简直比我对房间的温度要求还要严格。
实验室要保持无菌，这就像是在大厨做菜时要保持厨房的干净，细胞才不会被细菌“袭击”。
2. 克隆过程2.1 细胞分离接下来，咱们就进入核心环节——细胞分离。
首先，用一些酶把细胞从组织里分离出来，想象一下就像是把苹果从果皮里挖出来。
分离好的细胞会被放到培养基里，像是在自家的小厨房里吃饭。
经过一段时间，它们就开始在这片“美食”中慢慢繁殖。
2.2 细胞传代等细胞长得差不多了，我们就得进行传代了。
这个过程简单来说就是把一部分细胞移到新的培养皿里，就像是把一些小草莓移植到新的土壤里继续生长。
这样一来，细胞就能在新的地方继续繁殖，越来越多。
随着时间的推移，细胞会不断分裂、复制，最终形成一个细胞克隆群体。
3. 观察与分析3.1 显微镜观察当克隆细胞繁殖到一定数量时，我们就可以用显微镜来观察这些细胞。
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8000用户密码apps/vg10thn
环境IP 数据库用户应用用户基础目录
8001 192.168.1.218oratest appltest /erp/test
8003 192.168.1.218 oravis applvis /erp0/vis
8007 192.168.1.218 oracrp3 applcrp3 /erp/crp3
8005 192.168.1.216 oratest appltest /hr/test
克隆流程
正式环境全备数据库
/erpdb/rman/script/bk.sh full
user:root
检查克隆环境原进程是否全部停止
ps –fu appltest
ps –fu oratest
根据克隆环境创建PROD链接恢复数据(以下以8001为例)
cd /erpdb
ln -s /erp/test prod
修改测试环境Oracle目录属主
cd prod
chown -R oraprod:dba db
user:oraprod
打开数据库
sqlplus / as sysdba
startup nomout pfile=?/dbs/initPROD.ora
恢复数据
rman target /
restore controlfile from '/erpdb/rman/EBS_ctl_c-110618086-20110127-01';
alter database mount;
restore database;
recover database;
alter database open resetlogs;
以上在recover database会报错可不予理会，若想不报错可使用until指定时间或SCN
克隆数据库
user:root
cd /erpdb/prod
chown -R oratest:dba db
user:oratest
cd $ORACLE_HOME/appsutil/clone/bin/
perl adcfgclone.pl dbTier
完成后修改密码及环境描述：
cd /erp/clone/script/
sqlplus / as sysdba @1
关闭数据库，修改Oracle参数(测试环境改以下几个就行，不改太容易出错)：cd $ORACLE_HOME/dbs
vi inittest.ora
sga_target = 3G
pga_aggregate_target=2G
processes = 300
sqlplus / as sysdba
startup pfile=?/dbs/inittest.ora
create spfile from pfile;
应用克隆
user:appltest
cd $COMMON_TOP/clone/bin
perl adcfgclone.pl appsTier
克隆完成后，关闭应用，修改密码，定义客户化内容等。
adstpall.sh apps/vgy10thn
ps –fu appltest
cd /erp/clone/script
cpw.sh
ftp.sh
启动并做简单测试完成克隆
用户密码：apps/apps123sysadmin/1SYS2ADMIN adstrtal.sh apps/apps123。