醋酸纤维素薄膜电泳

蛋 白 质
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实验目的 实验原理 实验步骤
注意事项
实验目的
掌握电泳的基本原理，了解电泳仪， 电泳槽的基本结构和功能。
熟悉电泳的基本过程与定量方法。 熟悉血清电泳在临床诊断中的作用。
实验原理
1. 醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维素薄膜作为支 持物的电泳方法。 2. 血清中各种蛋白质的等电点在 pH4.88 ～ 7.50 之 间，在pH8.6的缓冲溶液中均带负电荷，在电场 中向正极泳动。血清中各种蛋白质的等电点不 同，所以带电荷量也不同。此外各种蛋白质的 分子大小各有差异，因此在同一电场中泳动的 速度不同。分子小而带电荷多者，泳动较快； 反之，则较慢。
蛋白质的染色方法
1. 2. 3. 氨基黑10B ：蓝色酸性染料，可与蛋白质结合 形成青色结合物。灵敏度为考马斯亮蓝R-250 的20%。 考马斯亮蓝R-250:可通过非共价键与蛋白质结 合，适用于微量SDS-蛋白质染色。 银染 染色机制与摄影过程中Ａg离子的还原 相似，灵敏度比考马斯高100倍。常用于凝胶 低电泳中极微量蛋白质的染色。
５温度
。
热不利于电泳 热蒸发缓冲液，影响缓冲液的离子强度，甚至导致样品
变质。 热会增加样品的扩散 为了减少热对实验的影响，可控制电泳或电流，也可安 装冷却完散热装置。
电渗作用
：
电渗：在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象。
以纸电泳为例:
正极 负极
－－－－－－－－ ＋＋＋＋＋＋＋＋
１样品性质
影 响 电 泳 分 离 效 果 的 因 素
迁移率与电荷量成正比，与相对分子质量成反比。
２电场强度
电压越高，速度越快。但高电压 介质温度升高 样品扩散 和对流速度增加 分辨率降低。低电压会延长电压时间，但 可以减少产热。所以，实验中我们要选择合适的电压，同时要冷 却降温。
３缓冲液的性质
缓冲液的ｐH决定了生物的解离程度。对于蛋白质和氨基酸来说，我们知 道溶液的pH离等电点越远,，所带的净电荷越多，迁移速度越快。因此选 择一个合适的pＨ，使各种蛋白质所带的净电荷数量差异越大，以利于分 离。缓冲液要求性能稳定，不易电解。 同时，缓冲液的离子强度会对自身缓冲能力有影响。过高，缓冲能力差， 过高则会阻碍分子的迁移，使样品速度减慢。
步骤
４、平衡 将膜条无光泽向下置于电泳槽支架上
，点样端靠近负极。薄膜两端要紧贴滤纸，（点 样线不要压在滤纸上）中间平直悬空，加盖密封 ，平衡５min。
５ 、电泳
将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上 （点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上 (见下图 ) 。 要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。连接好电泳 仪。在室温下电泳，打开电源开关，调节电流强度 0.5mA/cm膜宽度，通电50min后，调节旋钮使电流为零，关 闭电泳仪切断电源。
原理

影响电泳迁移率的因素：
1 、 内在因素：蛋白所带净电荷的性质和所带电
荷的多少、蛋白的大小和形状 2、外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的 离 子强度和电渗现象
等电点（pI)
以生物大分子为例
COOH＋
COOH＋
COOH
Pr
OH－
Pr
OH－
Pr
NH3+
NH2
NH3+
pH>pI
pH=pI
pH<pI
短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行 复染。
７、每次电泳时应交换电极，使两侧电泳槽内缓冲液的正负
离子相互交换，使缓冲液的pH维持在一定水平。
电泳失败的原因
①电泳图不整齐（点样不均匀，温度过高等） ②各组分分离效果不佳（点样过多，电流过低 等） ③染色后蛋白区带中间着色浅（染色试剂不足 等）
。
步骤

６、染色 取下薄膜直接浸于氨基黑 10B 染色 液中，染色５～ 10min 。然后在漂洗液中漂去剩余染 料，直至背景无色为止。回收漂洗液。。 仪内，记录仪上自动绘出蛋白质组分曲线图。每一个 峰代表一种蛋白质组分。若使用具有电子计算机附件 的自动扫描光密度仪，可通过相关软件的分析，直接 。 获得每条区带蛋白质的百分含量。
７、定量 将干燥的薄膜电泳图谱入自动扫描光密度
注意事项
1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。 2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去。 3 、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏薄膜
影响分离效果。
4 、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或
过少。
5、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端。 6 、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太
表面带负电荷 带正电荷的水层携带粒子向 负极移动
如果样品原本是移向负极的，则泳动的速度加快；
如果样品原本是移向正极的，则泳动的速度减慢。
电泳技术：指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。 电泳技术的优点：快速，准确，重复性好。 电泳分类： 按装置的差异有：薄膜电泳，垂直板电泳，平板电泳，垂直圆 盘电泳和毛细管电泳 按支持介质有： １ 醋酸纤维素薄膜电泳：分辨率高，成本低，灵敏度高，应用 广泛。 ２ 琼脂糖凝胶电泳：操作简单，分辨率高，重复性好，结果可 定量分析，电泳后易洗脱。 ３ 聚丙烯酰胺凝胶电泳；灵敏度高，对pH和温度变化较温度， 应用广。 ４ SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳具有聚丙烯酰胺凝胶电泳的所有 优点。 ５ 等电聚焦电泳。 ６ 双向电泳：具有极高的灵敏度和分辨率。
缓冲液pH=8.6

pI＜pH
血清蛋白均带负电荷,在电场中向正极移动 在醋酸纤维素薄膜分为五条带。电泳迁移率最大的是白蛋 白，其后为α1球蛋白，α2球蛋白，β球蛋白和γ球蛋白
+
白蛋 白(A)
α 1
α β
2
γ
实验器材
电泳仪，电泳槽，滤纸，醋酸纤维素薄膜 脱色摇床，染缸，点样器
试剂
４ x 电极缓冲液： 1.5mol/L Tris-HCl(pH 8.6)
临床意义: 血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳在临床上 常用于分析血、尿等样品中的蛋白质，供临床上 诊断肝、肾等疾病参考。
意义
肝炎:白蛋白,a1-球蛋白,a2高 肝硬化 : 白蛋白 ,a1- 球蛋白 ,a2- 球蛋白 下降明显, γ-球蛋白极度升高 肾病综合症:白蛋白降低,α2和β球蛋白 升高
血清蛋白电泳结果的临床意义
可能相关疾病 骨髓瘤 白蛋白
α 1 球蛋 α 2 球 蛋 β 球 蛋 γ 球 蛋 白 白 白 白
↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↓
肾病综合症
肾炎 肝硬化
↓ ↓（显著） ↓ ↓
急性肝坏死
传染性肝炎 急性感染初期
慢性炎症 / 感染 后期
低球蛋白血症
２、浸膜
在膜条无光泽面距一端１ .５cm处用铅笔轻划点样线，浸入电
极缓冲液中，至完全浸透为止（≧２０min)。用镊子取出薄膜， 点样线向上平放于干净滤纸上，用滤纸轻轻地按压，吸去薄膜上 多余的液体。
３、点样
取少量待测血清均匀涂布在玻璃片上，用宽１cm的平整的塑
料软片末端取少许样品，垂直轻印到薄膜点样线上，形成一条 细窄而均匀的直线。（注：点样量不宜过多）此步是实验的关 键。以印章法加样时，点样量不宜过多，动作应轻，稳，用力 不能太重。
（Tris三羟甲基氨基甲烷）
染色液：称取0.5g氨基黑，甲醇50ml，冰醋
酸10ml，蒸馏水加至100ml。
漂洗液： 取甲醇 45ml ，冰乙酸 5ml 和蒸馏水
50ml，混匀置塞试剂瓶内贮存。
实验操作
１、准备 将电极缓冲液加入电泳槽的电极室内， 使正，负极室的液面等高，调节电泳支架宽度正好 适合醋酸纤维素薄膜的长度。用４层纱布或滤纸做 盐桥，一端浸入缓冲液中，一端搭在支架上。
４支持介质
理想的介质：具有网状结构，不带电荷，对分离物质无 吸附作用的惰性材料。 网状结构：提高电泳分辨率 电渗：降低分辨率。导致电渗的原因是支持介质表面存 在带电基团。 吸附：降低电泳分辨率。（常用支持介质中，高纯度的 琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶的吸附最小，醋酸纤维素薄膜 次之，滤纸最大
血清中几种主要蛋白组分：
血清蛋白质 白蛋白 α1球蛋白 α2球蛋白 β球蛋白 γ球蛋白 等电点 4.８８ 5.0６ 5.06 5.12 6.85～7. ５０ 分子量 69,000 200,000 300,000 90,000～ 150,000 156,000～ 950,000 占总蛋白的 ％ 57～72 2～ 5 4～ 9 6.5～12 12～2９
血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳
——第三组
陈艳 李秀清 张伟 孙金山
定义：带电粒子在电场中向着与其电性相反的电极移动 的现象。
负 极
正 极
－
那 么 什 么 是 电 泳？
电泳为何能分离混合物？
迁移率（mobility)：表示单位电场强度粒子 的速度。 又叫泳动度，用 μ表示。 μ＝v/E=Q/(6πrη) 可知，在一定pH条件下，不同的蛋白质由于具 有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一 定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同， 即它们的电泳迁移率不同，因此，可对它们进行 分离。 电泳的应用：分离各种有机物；分析某种物质的 纯度及分子量。