圆二色谱CD原理
简述圆二色谱的原理及应用
简述圆二色谱的原理及应用原理圆二色谱（Circular Dichroism，简称CD）是一种研究物质光学活性的技术。
其基本原理是通过测量样品对左旋光和右旋光的吸收差异，来研究物质结构和手性。
圆二色谱的原理主要涉及到电磁波的旋转和手性分子的相互作用。
电磁波可以被视为电场和磁场的横向振动，而这两个场的振动方向垂直于波传播方向。
在自由空间中，电磁波的电场和磁场是相互垂直、相互平行并且幅度相等的。
然而，在手性分子存在的情况下，电场和磁场的振动可能会被干扰，从而导致电磁波的旋转。
根据圆二色效应，左旋光和右旋光在经过手性分子样品后会发生旋光现象。
当左旋光与手性分子相互作用后，其振动面会发生旋转，而右旋光则会与之相反地发生旋转。
这种旋光现象称为旋光分散（Optical Rotation），而测量这种旋光差异的技术就是圆二色谱。
圆二色谱可以通过测量样品对左旋光和右旋光的吸收程度差异来分析和表征生物大分子、有机化合物和无机配合物的结构、构象和手性特征。
应用圆二色谱在化学、生物化学、生物医学和药物研发领域具有广泛的应用。
下面是一些常见的圆二色谱的应用：1.结构分析和构象研究：圆二色谱可以用来确定分子结构和构象。
根据样品测得的CD谱图，可以通过比对已知的标准谱图或者进行计算模拟，来推断分子的立体结构、构象和手性特征。
2.蛋白质折叠和结构变化：圆二色谱可用于研究蛋白质的二级结构、折叠状态和构象变化。
蛋白质的二级结构（如α-螺旋、β-折叠等）会对圆二色谱谱图产生特定的影响，因此可以通过分析谱图来了解蛋白质的结构信息。
3.酶的活性和结构：通过圆二色谱可以研究酶的结构和活性。
酶的结构与其功能密切相关，圆二色谱可以帮助研究人员揭示酶的结构与功能之间的关系，并优化酶的催化活性。
4.药物研发：圆二色谱在药物研发中发挥着重要作用。
通过对药物分子的圆二色谱谱图的分析，可以了解药物的结构、构象和活性与手性之间的关系，从而指导药物改良和设计。
圆二色谱概述
圆二色谱一、圆二色谱圆二色光谱(简称CD)是应用最为广泛的测定蛋白质二级结构的方法，是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法。
它可以在溶液状态下测定，较接近其生理状态。
而且测定方法快速简便，对构象变化灵敏，所以它是目前研究蛋白质二级结构的主要手段之一，并已广泛应用于蛋白质的构象研究中。
二、圆二色谱的基本原理光是横电磁波，是一种在各个方向上振动的射线。
其电场矢量 E 与磁场矢量H 相互垂直，且与光波传播方向垂直。
由于产生感光作用的主要是电场矢量，一般就将电场矢量作为光波的振动矢量。
光波电场矢量与传播方向所组成的平面称为光波的振动面。
若此振动面不随时间变化，这束光就称为平面偏振光，其振动面即称为偏振面。
平面偏振光可分解为振幅、频率相同，旋转方向相反的两圆偏振光。
其中电矢量以顺时针方向旋转的称为右旋圆偏振光，其中以逆时针方向旋转的称为左旋圆偏振光。
两束振幅、频率相同，旋转方向相反的偏振光也可以合成为一束平面偏振光。
如果两束偏振光的振幅(强度) 不相同,则合成的将是一束椭圆偏振光。
光学活性物质对左、右旋圆偏振光的吸收率不同,其光吸收的差值ΔA ( Al -Ad) 称为该物质的圆二色性(circular dichroism,简写作CD) 。
圆二色性的存在使通过该物质传播的平面偏振光变为椭圆偏振光,且只在发生吸收的波长处才能观察到。
所形成的椭圆的椭圆率θ为:θ= tg-1 短轴/长轴根据Lambert-Beer 定律可证明椭圆率近似地为：θ= 0. 576lc (εl-εd) = 0. 576lcΔε公式中l 为介质厚度, c 为光活性物质的浓度,εl 及εd分别为物质对左旋及右旋圆偏振光的吸收系数。
测量不同波长下的θ(或Δε) 值与波长λ之间的关系曲线,即圆二色光谱曲线。
在此光谱曲线中,如果所测定的物质没有特征吸收,则其Δε值很小,即得不到特征的圆二色光谱。
当εl >ε d 时,得到的是一个正的圆二色光谱曲线,即被测物质为右旋,如果εl <ε d ,则得到一个负的圆二色光谱曲线,即被测物质为左旋。
圆二色谱和旋光谱概述
圆二色谱和旋光谱概述圆二色谱（circular dichroism spectroscopy，CD）是一种测量分子对具有不同方向旋转的圆偏振光吸收差异的技术。
它通过测量由物质吸收的左旋和右旋圆偏振光的差异，来研究物质的结构和构象。
圆二色谱的基本原理是Kirchhoff定律的直接应用，即分子的吸收光谱是由对电磁场的响应所导致的。
当吸收的光谱与光的旋转相耦合时，出现左旋和右旋圆二色效应。
圆二色谱实验通常通过使用圆偏振光源、样品和检测器组成。
光源通常是通过一个线性偏振器和一个相位均匀的偏振光源来产生的。
样品通常是通过溶液或薄膜的形式存在。
检测器用于测量透射或反射样品的圆二色信号。
测量得到的数据可以表示为贝尔系数，即偏振光旋转的绝对角度。
根据光谱的形状和幅度，可以分析物质的构象和结构。
旋光谱（optical rotation spectroscopy）是测量物质在其中一种溶剂中的光学旋转角度的技术。
它根据物质对线性偏振光的旋转效应研究物质的手性性质。
旋光谱原理是基于贝尔定律，该定律描述一个物质中的旋转既取决于溶液中物质的浓度，又取决于物质本身的旋转率。
旋光谱实验通常使用旋光仪进行测量。
旋光仪由一个光源、走样器、检测器和读数装置组成。
在实验中，光线通过一系列光学元件（如偏振器和波片）来形成线偏振光，然后通过待测物质样品，最后到达检测器。
读数装置可测量旋转对应的光强度变化，并通过校准数据来计算旋转角度。
圆二色谱和旋光谱在许多领域有着广泛的应用。
在有机化学中，它们被广泛用于研究手性分子、构象分析和反应动力学等。
在生物化学和生物物理学中，它们被用于研究蛋白质和核酸的结构和功能。
此外，圆二色谱和旋光谱还被应用于药物发现、金属络合物分析和环境监测等领域。
总之，圆二色谱和旋光谱是两种常用的分析技术，用于研究物质的光学性质和结构。
它们的基本原理和实验方法都是通过测量物质对光的旋转效应来实现的。
这些技术广泛应用于化学、生物学和医药等领域，为科学家研究和理解物质的性质和行为提供了重要工具。
圆二色谱仪检测原理
圆二色谱仪检测原理
圆二色谱仪是一种用来测量物质的旋光性质的分析仪器。
其检测原理基于物质对偏振光的旋光效应。
圆二色谱仪中，光源发出的可见光经过偏振器后，被分成两束偏振方向相互垂直的线偏振光。
其中一束光经过样品管，与样品发生相互作用后，光的偏振方向发生变化。
另一束没有经过样品管。
两束光再次相遇时，通过光栅分光器将其分离为两束光，分别进入两个相互垂直的光电检测器。
当被测物质的溶液处于外加磁场的作用下时，分子因旋转而在样品管中具有特定的旋光性质。
旋光方向以及旋光强度与物质的结构有关。
这种旋光性质能够影响两束光之间的干涉现象，从而使得通过光电检测器的两束光的光强发生变化。
通过检测两束光的光强差异，圆二色谱仪可以测量样品的旋光性质。
圆二色谱仪的测量结果一般以CD（Circular Dichroism）谱或OR（Optical Rotation）谱的形式呈现。
CD谱描述了样品在不同波长处的旋光强度变化，可以用来研究样品的结构、构象和对称性等；OR谱则描述了样品在某一特定波长处的旋光方向和旋光强度。
圆二色谱仪在生物化学和药物领域具有广泛的应用，可以用来研究蛋白质、核酸、糖类等生物大分子的结构和构象变化，同时也可以用来研究药物的药效和药物-靶标相互作用等。
CD圆二色谱解读：探索生物大分子结构之谜
CD圆二色谱解读：探索生物大分子结构之谜一、圆二色谱的神秘面纱圆二色谱（Circular Dichroism，简称CD）是一种光谱学方法，用于研究生物大分子（如蛋白质和核酸）的结构。
它的原理是基于生物大分子对左旋和右旋偏振光的吸收差异。
这种差异反映了生物大分子的立体结构，因此，CD圆二色谱被广泛应用于生物制药分析领域。
二、CD圆二色谱的工作原理CD圆二色谱的工作原理是基于生物大分子的手性。
手性是一种物质的基本性质，表现为对左旋和右旋偏振光的吸收差异。
生物大分子（如蛋白质和核酸）都具有手性，因此，通过测量其对左旋和右旋偏振光的吸收差异，可以获取其立体结构信息。
三、CD圆二色谱的应用CD圆二色谱的应用非常广泛，主要用于生物大分子的结构研究。
例如，通过CD圆二色谱，我们可以确定蛋白质的二级结构，包括α-螺旋、β-折叠和随机卷曲等。
此外，CD圆二色谱还可以用于研究蛋白质的热稳定性、酶活性、配体结合等性质。
四、CD圆二色谱的优势CD圆二色谱的优势在于其简单、快速和无损。
首先，CD圆二色谱的操作简单，只需要将样品溶解在适当的溶剂中，然后通过光谱仪进行测量。
其次，CD圆二色谱的测量速度快，一般只需要几分钟就可以完成。
最后，CD圆二色谱是一种无损检测方法，不会对样品造成损害，因此，可以用于研究生物大分子的动态过程。
五、CD圆二色谱的挑战与未来尽管CD圆二色谱具有许多优势，但也面临一些挑战。
例如，CD圆二色谱对样品的浓度和纯度要求较高，对于浓度低或杂质多的样品，可能无法获得准确的结果。
此外，CD圆二色谱只能提供生物大分子的平均结构信息，无法获取其具体的三维结构。
然而，随着科技的进步，我们有理由相信，CD圆二色谱的应用将更加广泛。
例如，通过结合其他技术（如核磁共振和X射线晶体学），我们可以获取生物大分子的更详细的结构信息。
此外，通过改进光谱仪的设计和优化测量方法，我们可以提高CD圆二色谱的灵敏度和准确性。
图1。
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圆二色谱Circular_CD
主要内容
CD原理
蛋白质CD谱
CD实验要点
CD原理
圆二色性(circular dichroism, CD)
当平面偏振光通过具有旋光活性的介质时， 由于介质中同一种旋光活性分子存在手性不同 的两种构型，故它们对平面偏振光所分解成的 右旋和左旋圆偏振光吸收不同，从而产生圆二 色性．
圆二色性的表示
椭圆度，摩尔椭圆度[] =2.303(AL – AR)/4 [] = 3298(L - R)3300 (L - R) 在蛋白质研究中， 常用平均残基摩尔椭圆度
圆二色仪原理
蛋白质的CD谱
蛋白质的光学活性
The peptide bond is inherently asymmetric & is always optically active
构象
确定蛋白质构象最准确的方法是x-射线晶体衍 射，但对结构复杂、柔性的生物大分子蛋白质 来说，得到所需的晶体结构较为困难。二维、 多维核磁共振技术能测出溶液状态下较小蛋白 质的构象，可是对分子量较大的蛋白质的计算 处理非常复杂。 圆二色光谱：研究稀溶液中蛋白质构象，快速、 简单、较准确
CD is very useful for looking at membrane proteins
蛋白的三级结构
1976年，Levitt和Chothia曾在Nature上报道，规则蛋白质 的三级结构模型可分为4类 (1) 全α型，以仅α-螺旋结构为主，其分量大于40％ ，而 β-折叠的分量小于5％ (2) 全β型，以β-折叠这种结构为主，其分量大于40％ ，而 仅一螺旋的分量小于5％ ； (3) α+β型，α螺旋及β-叠折分量都大于15％ ，这两种结构 在空间上是分离的，且超过60％的折叠链是反平行排列； (4) α/β型， α-螺旋和B-折叠含量都大于15％ ，它们在空间 上是相间的，且超过60％的折叠链平行排列。
圆二色谱
0
TM-36 aqueous
-5
TM-36 + TFE
-10
MRE MRE
Effect of 50% TFE on a monomeric peptide
0
peptide in water
peptide in 50% TFE
-5
-10
-15
TFE
-20
-25
-30
-35
200
210
220
230
240
+ band (nm) 192
195
220-230 (weak) 180-190 (strong) 190
205 210-230 weak
200
212
估算蛋白质α螺旋含量
仅适合α含量较高的蛋白质！
If we measure the CD signal for a protein of unknown structure we can find its proportion of 2ndry structures
圆偏振光(Circular polarized light)
振幅保持不变，而方向周期变化， 电场矢量绕传播方向螺旋前进
圆偏振光
朝光源看， 电场矢量方向按顺时针方向旋转的，称为右圆偏振光； 电场矢量方向按逆时针方向旋转的，称为左圆偏振光。
圆二色性(circular dichroism, CD)
¾ 光学活性分子对左、右圆偏振光的吸收也不 同，使左、右圆偏振光透过后变成椭圆偏振 光，这种现象称为圆二色性。
wavelength in nm
-15
-20
-25
-30
TFE
-35
11圆二色谱Circular Dichroism(CD)
Determination of Protein Concentration
¾ Good Methods: 1. Quantitative amino acid composition 2. Determination of backbone amide groups using the microbiuret method. 3. Determination of moles of tyrosine using difference spectroscopy under denaturing conditions. 4. Determination of total nitrogen. ¾ Not Acceptable: 1. Bradford Method. 2. Lowry Method. 3. Absorbance at 280 and/or 260 nm.
圆二色谱Circular Dichroism (CD)
主要内容
¾ CD原理 ¾ 蛋白质CD谱 ¾ CD实验要点
CD原理
平面偏振光 (Plane polarized light)
E M
平面偏振光
振动方向保持不变 振幅发生周期性变化
E vectors Polarizer
旋光色散(Optical rotatory dispersion)
旋光度
¾ α = [α]lc
[α]是旋光物质的比旋光率，单位是度•厘米2 • 10克-1
¾ 对同一物质，[α]值与波长有关
旋光率与波长的关系称为旋光色散(Optical rotatory dispersion, ORD)
旋光色散
¾ 旋光色散常用摩尔比旋[Φ]表示。 [Φ] = [α]*M/100 M为旋光介质的分子量
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CD signals for GCN4-p1
O'Shea et al. Science (1989) 243:538 figure 3: 34M GCN4-p1 in 0.15M NaCl, 10mM phosphate pH 7.0
β-sheet
β-turn polypro II helix Random coil
216
220-230 (weak) 180-190 (strong) 190 200
195
205 210-230 weak 212
3、估算蛋白质二级结构含量
仅适合含量较高的蛋白质！
未知结构的蛋白的CD信号
• 将测得的CD曲线与标准曲线拟合。
蛋白质的紫外吸收光谱主要有两个峰： 190-250nm：肽键 280-290nm：酪氨酸tyr，色氨酸trp
10、 J-810圆二色光谱仪
LS M1 M4
M0 S1 P1 P2 S2
O-ray E-ray
M2
M3 PM
M5
S3 L F CDM SH
S1-S2:第一级单色器；S2-S3:第二级单色器;
• 紫外光区：只有芳香族色氨酸、酪氨酸和苯丙氨 酸有吸收。 • 氨基酸分子内的紫外生色基团：吲哚基、酚羟基、 苯基、二硫键、咪唑基和羧基等。
2、肽的圆二色谱
活性肽构象与其生理功能的关系 肽的构象也是蛋白质构象的一种模型。 肽的圆二色性为研究肽在溶液中的构象提供了重要信息。
Far-UV (250-170nm)
顿效应，cotton effect），因而 分子中不同生色团对于谱的贡献
比在ORD中更容易分辨。
ORD是渐近线，两端不回归
ORD
CD
吸收带附近，旋光度由负到正
吸收带附近，旋光度由正到负
正Cotton效应
负Cotton效应
正CD带 负CD带
CD比ORD容易辨别重叠峰
CD比ORD弱带易检测
CD比ORD更容易拟合
自然光 平面偏振光 圆偏振光 样品 椭圆偏振光
2、光的偏振
双折射现象： 一束光射入各向异性晶体后有两束折射光。
尼科耳棱镜。
在生物样品中，肌肉纤维、骨骼和牙齿等具有各 向异性，淀粉粒、染色体和纺锤体等具有双折射性， 因此被用于组织细胞的化学研究。
名称 寻常光 （o光）
折射定律 遵守 不遵守
折射率 对于晶体一切方向都具 有相同的折射率 折射率随方向而变化
旋光色散：不同波长的偏振光的旋转角度不同。 旋光仪是测量旋光性与波长的函数关系，从而得到一个旋光色散谱。
圆双折射：某个物质对于左、右圆偏光的折射率分别为nL和nR，
nL = nR，则为光学各向同性物质； 若 nL ≠ nR，则为光学各向异性物质；左、右圆偏光的相位改变， 若nL＞nR，透射光的偏振面右旋。 若nL＜nR，透射光的偏振面左旋。
. .. . . .. .
起偏器 检偏器
晶轴夹角为α时， 透射光强度与 cos2α成正比。
晶轴相互垂直时， 透射光强度为零；
3、平面偏振光（Plane polarized light）
也称线（完全）偏振光，简称偏振光。 它的振动面称为其偏振面。 振动方向保持不变
振幅发生周期性变化
E之端点在空间的轨迹为一平面正弦曲线 投影到垂直于光传播方向的平面上为一直线段
CD比ORD提供较多意义明确的信息
表明有三个生色团，其中两个有光学活性
CD能够提供的信息：
(i) primary structure, (ii) secondary structure (iii) tertiary structure
Alpha-helix, beta-sheet 肽链骨架的构象变化
what about 50oC? t = xoo + x7575 fits best with
xo = 50% x75= 50%
fit to GCN4-p1 50 C data
10
O
5
original data O O best fit with mix of 0 C and 电场矢量方向按顺时针方向旋转的，称为右圆偏振光； 电场矢量方向按逆时针方向旋转的，称为左圆偏振光。
6、光的叠加
一束自然光可以看作是两束相互垂直而没 有相位关系的平面偏振光的加和。
透过的左、右圆偏光 旋转方向相反的 左、右圆偏光 透过一光学 活性物质后 振幅 相等 相位 相同 矢量和 平面偏振光
圆二色性光谱及其应用
（Circular Dichroism，CD）
光学活性分子对左、右圆偏光 的吸收率的差值
1、自然光
光具有波、粒二象性，是横电磁波。只有横波才有偏振 现象: 光矢量的振动方向与光的传播方向垂直， 在垂直于光传播方向的平面内, 有不同的振动方向。 电场矢量E和磁场矢量H互相垂直、位相相同。 E
若 旋光现象是圆双折射的一种特殊形式。
旋光物质使左、右圆偏振光的速度不同，即其色散大小的折射率不同，
旋光现象的产生是由于光学各向异性物质的折射率nL≠nR的结果。
旋光，双折射
8、光的吸收和圆二色性（circular dichroism, CD）
化合物在正常情况下，处于低能的基态， 电子占据所有的成键轨道（σ、π、n轨 道）。如果电子吸收了外界的能量，它就 从基态跃迁到激发态能级。 如果所有的跃迁仅在基态的最低振动能级 和第一激发态之间，吸收光谱将是很狭窄 而不连续的谱线。 由于分子的价电子跃迁总伴随着振动和转 动能级的跃迁，所以，紫外分光光度计测 定物质的吸收光谱，虽然有一最大吸收峰 值，但都是具有一定波长宽度并相对平滑 的曲线。
0
H
v
E
传播方向
振动面
由于感光作用都是E 引起的，因而，将E 作为光矢量。 振动面：E 与光传播方向组成的平面。
从统计规律上说，自然光的光振动: 在垂直于光速的平面上遍布所有方向， 沿各方向振动的光矢量呈对称分布, 相应光矢量的振幅（光强度）相等。
超高压短弧氙灯: 在高压纯净氙气中放电发光。
（1）高亮度的点光源； （2）日光色。色温接近6000K； （3）在可见光区连续光谱； （4）高显色性，显色指数＞95； （5）在整个寿命期内维持光色特性； （6）高电弧稳定性； （7）热重启能力； （8）启动后即能达到接近最大光输出； （9）电弧光斑小、易聚光。
传播方向 在入射面内 不一定在入射面内
非常光 （e光）
o光和e光：频率相同、振动方向相互垂直、平面偏振光
自然光入射到某些晶体（电气石、硫酸金鸡钠碱晶体等）时，晶片吸
收振动面与晶轴垂直的光，而只允许振动面平行于晶轴的光通过。
自然光
平面偏振光
. .. .
.
晶轴相互平行时， 透射光强度最大；
. .. .
光的吸收
若溶液中的溶质对某一波长的入射光有吸收，则透射光的 光强度小于入射光。
• 圆二色性的存在将通过该物质传播的左、右圆偏光变成椭 圆偏振光。并且只在发生吸收的波长处才能观察到。
理论计算的圆二色性与该椭圆偏振光的摩尔椭圆率的关系：
[θ] = 100θ/（c · = 3300（ εL-εR） l）
PMT的输出信号由正比于IA的直流分量和正比于S的交流分量所组成。
圆二色光谱仪工作原理
• 用相同强度，相同频率的左、右旋圆偏光交替照射 样品测得透过样品后的强度IR和IL • 由于IR和IL十分接近，令IA=（IL+IR）/2，S= IR – IL
• 只放大相应于S的PMT输出电压Es（交流信号），而不放 大相应IA的输出电压EA。（适当选取放大倍数G值，使ESG 与EA可比）。
ε：介质对圆偏振光的摩尔消光系数， c ：样品摩尔浓度， l ：样品厚度（cm ），
[θ] 单位：℃/（mol · cm）
或℃ · 2/dmol。 cm
圆二色性的表示
吸收（率）差
= L - R
A = AL – AR 椭圆度，摩尔椭圆度[]
= 2.303（AL – AR）/4
[] = 3298（L - R） 3300 （L - R）
M：球面反光镜；P：晶体石英棱镜；L:透镜；F:滤光器；
由CDM交互形成的左、右旋圆偏光通过光学活性物质， 透射光强度随时间的变化
透射光强的变化频率与外加调制电压的频率相同。
交流成分S相 当于圆二色性
直流成分 IA=（IL+IR）/2
当调制电压过其峰值（正和负）时， εR＞εL时，透过的右旋圆偏光的光强对应于最大值，而左旋最小（实线）； εR＜εL时，透过的左旋圆偏光的光强对应于最大值，而右旋最小（虚线）。
80 70 60 0 OC 50 OC 75 OC
GCN4-p1
0oC：100% helix 75oC：0% helix
[ in 1000 deg cm2dmol-1
50 40 30 20 10 0 -10 -20 -30 -40 190 200 210 220
230
240
250
260
wavelength in nm
x+ xb + xc = 1.0 t = x + xbb + xcc • 改变x、xb和xc，使t与样本曲线最佳拟合（最小二乘法，least squares minimization ）
myoglobin
t = x + xbb + xcc fits best with x = 80% xb = 0% xc = 20% agrees well with structure 78% helix, 22% coil For further details:
Near-UV ~ Near-infrared (300-1000nm)：
colored proteins