分子杂交与印迹技术的原理复性课件
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生物化学课件 第四章 核酸杂交
单链DNA的紫外吸收比双链DNA高40%，所以 变性导致DNA的紫外吸收增加，称为增色效 应（hyperchromic effect）。 在热变性过程中，增色效应达一半时即双螺 旋被解开一半时的温度称为解链温度(Tm)。
（三）影响Tm值的因素：
（1）碱基组成：Tm=69.3+0.41(G+C)%
（2）分子大小: （3）离子强度： （3）pH：5～9
主要用于基因组DNA的定性和定量分析(特定序列 定位)，亦可分析重组质粒和噬菌体。
方法：利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制 性内切酶消化的DNA片段，将胶上的 DNA变性并在原位将单链DNA片段转移 至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤 或者紫外线照射固定，再与相对应结构 的标记探针进行杂交，通过显色，检测 特定DNA分子的含量。
迹/Northern印迹的步骤及用途
印迹杂交的过程
探针的种类、常用的几种酶促标记方法
小测验
1. PCR的基本原理和步骤。 2. Southern blotting的基本原理、过 程和用途。
44
(in situ hybridization)
在细胞保持基本形态的情况下将探针 注入细胞内与DNA或RNA杂交，杂交反应在 载物片上的细胞内进行。
DNA 点阵
本章重点:
掌握以下概念: 核酸分子杂交;探针;印迹；
核酸的变性/复性;Tm;增色效应/减色效应
掌握核酸杂交的基本原理
熟悉常用的核酸分子杂交技术及Southern 印
核酸分子杂交
复性
RNA
DNA
第二节
核 酸 探 针
探针的概念 探针的种类和选择
（三）影响Tm值的因素：
（1）碱基组成：Tm=69.3+0.41(G+C)%
（2）分子大小: （3）离子强度： （3）pH：5～9
主要用于基因组DNA的定性和定量分析(特定序列 定位)，亦可分析重组质粒和噬菌体。
方法：利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制 性内切酶消化的DNA片段，将胶上的 DNA变性并在原位将单链DNA片段转移 至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤 或者紫外线照射固定，再与相对应结构 的标记探针进行杂交，通过显色，检测 特定DNA分子的含量。
迹/Northern印迹的步骤及用途
印迹杂交的过程
探针的种类、常用的几种酶促标记方法
小测验
1. PCR的基本原理和步骤。 2. Southern blotting的基本原理、过 程和用途。
44
(in situ hybridization)
在细胞保持基本形态的情况下将探针 注入细胞内与DNA或RNA杂交，杂交反应在 载物片上的细胞内进行。
DNA 点阵
本章重点:
掌握以下概念: 核酸分子杂交;探针;印迹；
核酸的变性/复性;Tm;增色效应/减色效应
掌握核酸杂交的基本原理
熟悉常用的核酸分子杂交技术及Southern 印
核酸分子杂交
复性
RNA
DNA
第二节
核 酸 探 针
探针的概念 探针的种类和选择
核酸分子杂交技术 ppt课件
ppt课件
15
一、常见的核酸探针
（一）基因组DNA探针
基因组DNA探针的制备是将染色体DNA通过超声击断或限制性内 切酶不完全水解，获得许多染色体 DNA的随机片段，选择长度约 15-20kb的DNA片段重组到λ 噬菌体中，经体外包装感染大肠杆菌， 在固体培养基上形成许多噬菌斑。筛选出含目的基因的重组体后， 将目的基因 DNA片段再次亚克隆到大肠杆菌质粒中保存，以便需 要时扩增。 基因组DNA制备还可以通过 PCR扩增基因组DNA的特定片段，然 后将其克隆到大肠杆菌质粒中保存。由于真核基因组含有不编码的 内含子序列，因此，真核基因组 DNA 探针用于检测基因表达时杂 交效率要明显低于cDNA探针。
ppt课件
26
(3) 酶
常用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶对核酸探针进行标记。
ppt课件
27
(4) 荧光素
异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），最大吸收波 长为490nm～495nm，最大发射波长为520nm～530nm，呈黄绿色 荧光， 四乙基罗达明：最大吸收波长为570nm，最大发射波长为595～ 600nm，呈橙红色荧光。
ppt课件 11
二、核酸分子杂交的基本原理
根据核酸变性和复性的原理，不同来 源的 DNA 变性后，若这些异源 DNA 之间存在某些相同序列的区域，在退 火条件下则可形成DNA-DNA异源双 链；或将变性的单链 DNA 与 RNA 经 复性处理可以形成DNA-RNA杂合双 链。这种不同来源的单链核酸分子在 合适的条件下，通过碱基互补形成双 链杂交体的过程称为核酸分子杂交 （molecular hybridization）。
基因组学课件 第8章 分子杂交与印迹技术
➢ 操作步骤：
✓ 蛋白样品的制备 ✓ 蛋白样品的分离-（SDS-PAGE） ✓ 转膜 ✓ 封闭 ✓ 一抗杂交 ✓ 二抗杂交 ✓ 底物显色
50
3、Western 印迹杂交
➢ 酶联显色：
HRP：底物为DAB AP：底物为BCIP/NBT
51
3、Western 印迹杂交
52
3、Western 印迹杂交
转印方法：毛细管虹吸法
➢ 利用毛细管的虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分子转移至滤膜上。 ➢ DNA片段由液体携带而从凝胶转移并聚集于薄膜表面。液体通过毛
细管作用抽吸通过凝胶，借助于一叠干的吸水纸巾产生并维持毛细 管作用。转移的速度取决于DNA片段的大小和凝胶中琼脂糖的浓度， 小片段DNA（<1kb）1h内就能够从0.7%琼脂糖上几乎定量地转移， 而较大片段的DNA转移较慢且效率较低。
3）荧光原位杂交
64
2）组织/细胞原位杂交
➢ 特点:
能在成分复杂的组织中进行单一 细胞的研究
不需从组织或细胞中提取核酸， 对含量极低的靶序列灵敏度高
能准确反映组织细胞的相互关系 及功能状态
65
4、原位杂交（in situ hybridization）
1）菌落原位杂交 2）组织/细胞原位杂交 3）荧光原位杂交
5、斑点杂交(dot blot)
59
4、原位杂交（in situ hybridization）
➢ 核酸原位杂交特点：
（1）不受组织成分的影响； （2）灵敏度高； （3）可完整保持细胞或组织形态，准确反映组织细胞的相互关系
及功能； （4）可检测多个探针。
60
4、原位杂交（in situ hybridization）
7
2、分子印迹（blot、bloting）
✓ 蛋白样品的制备 ✓ 蛋白样品的分离-（SDS-PAGE） ✓ 转膜 ✓ 封闭 ✓ 一抗杂交 ✓ 二抗杂交 ✓ 底物显色
50
3、Western 印迹杂交
➢ 酶联显色：
HRP：底物为DAB AP：底物为BCIP/NBT
51
3、Western 印迹杂交
52
3、Western 印迹杂交
转印方法：毛细管虹吸法
➢ 利用毛细管的虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分子转移至滤膜上。 ➢ DNA片段由液体携带而从凝胶转移并聚集于薄膜表面。液体通过毛
细管作用抽吸通过凝胶，借助于一叠干的吸水纸巾产生并维持毛细 管作用。转移的速度取决于DNA片段的大小和凝胶中琼脂糖的浓度， 小片段DNA（<1kb）1h内就能够从0.7%琼脂糖上几乎定量地转移， 而较大片段的DNA转移较慢且效率较低。
3）荧光原位杂交
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2）组织/细胞原位杂交
➢ 特点:
能在成分复杂的组织中进行单一 细胞的研究
不需从组织或细胞中提取核酸， 对含量极低的靶序列灵敏度高
能准确反映组织细胞的相互关系 及功能状态
65
4、原位杂交（in situ hybridization）
1）菌落原位杂交 2）组织/细胞原位杂交 3）荧光原位杂交
5、斑点杂交(dot blot)
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4、原位杂交（in situ hybridization）
➢ 核酸原位杂交特点：
（1）不受组织成分的影响； （2）灵敏度高； （3）可完整保持细胞或组织形态，准确反映组织细胞的相互关系
及功能； （4）可检测多个探针。
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4、原位杂交（in situ hybridization）
7
2、分子印迹（blot、bloting）
第九章分子杂交技术1ppt课件
不易核酸电转
2) 尼龙膜（nylon membrane）
• 结合单链DNA和RNA的能力比NC膜强（达 350µ g/
cm2 ～ 500µ g/ cm2 ）。
•真空烘干后或紫外线照射可强化结合（短波UV照射后,
部分嘧啶碱基与其氨基交联，更加牢固）。
•微波处理和碱处理也可促结合，从而使细菌裂解、DNA
流程 1.将核酸分子酶切成 为多个片段 2.变性电泳（或者电 泳之后变性）， 使各片段分离 3.将凝胶中的核酸片 段转移到固相支 持物上 4.预杂交 杂交 5.洗膜 6.检测
Northern 印迹杂交
检测RNA（主要是mRNA）的方法 与Southern杂交的不同
靶核酸：RNA RNA电泳 转膜：不需变性
DNA复性或杂交(hybridization)
——DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
核酸分子杂交的原理
第二节 核酸探针
探针指的是能与特定的靶分子（DNA或RNA）发生特异 性结合的核酸分子
DNA/RNA探针
探针的分类 主
要 探针的标记
内
容 标记物
RNA探针的主要优点有
①RNA/RNA和RNA/DNA杂交体的稳定性较DNA/DNA杂交体的稳 定性高，因而杂交的特异性更高。
WESTERN BLOTTING
其基本过程为：
（1）首先做蛋白质的SDS-PAGE电泳。 （2）然后将凝胶中的蛋白质电转印到固相膜上。 （3）在膜上以相应的抗体进行抗原／抗体反应。
（4）显色。
本方法结合了凝胶电泳分辨率高和免疫检测灵敏 特异的特点，能从混杂的蛋白质中检测出特定的 抗原。
转膜
HRP 2Ab
随机引物延伸（random primer)
2) 尼龙膜（nylon membrane）
• 结合单链DNA和RNA的能力比NC膜强（达 350µ g/
cm2 ～ 500µ g/ cm2 ）。
•真空烘干后或紫外线照射可强化结合（短波UV照射后,
部分嘧啶碱基与其氨基交联，更加牢固）。
•微波处理和碱处理也可促结合，从而使细菌裂解、DNA
流程 1.将核酸分子酶切成 为多个片段 2.变性电泳（或者电 泳之后变性）， 使各片段分离 3.将凝胶中的核酸片 段转移到固相支 持物上 4.预杂交 杂交 5.洗膜 6.检测
Northern 印迹杂交
检测RNA（主要是mRNA）的方法 与Southern杂交的不同
靶核酸：RNA RNA电泳 转膜：不需变性
DNA复性或杂交(hybridization)
——DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
核酸分子杂交的原理
第二节 核酸探针
探针指的是能与特定的靶分子（DNA或RNA）发生特异 性结合的核酸分子
DNA/RNA探针
探针的分类 主
要 探针的标记
内
容 标记物
RNA探针的主要优点有
①RNA/RNA和RNA/DNA杂交体的稳定性较DNA/DNA杂交体的稳 定性高，因而杂交的特异性更高。
WESTERN BLOTTING
其基本过程为：
（1）首先做蛋白质的SDS-PAGE电泳。 （2）然后将凝胶中的蛋白质电转印到固相膜上。 （3）在膜上以相应的抗体进行抗原／抗体反应。
（4）显色。
本方法结合了凝胶电泳分辨率高和免疫检测灵敏 特异的特点，能从混杂的蛋白质中检测出特定的 抗原。
转膜
HRP 2Ab
随机引物延伸（random primer)
DNA印迹与杂交技术PPT课件
23
4.3 Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法
利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的 DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是：容器 中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠， 上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤 纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动 凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA 片段移出凝胶而滞留在膜上。
47
3、离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂
交率增加 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进
行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交 反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度
48
4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交
液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待 测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在 35~42 ℃杂交
的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分
子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts 溶液或脱脂奶粉。
51
五、 其它分子杂交方法
Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交
固相杂交
52
（一）Northern印迹杂交
30
5、Southern杂交
1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点 预杂交液为不含DNA探针的杂交液
2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交 双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交
3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA
31
6. 杂交结果的检测
化学显色或放射自显影
32
4.3 Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法
利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的 DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是：容器 中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠， 上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤 纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动 凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA 片段移出凝胶而滞留在膜上。
47
3、离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂
交率增加 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进
行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交 反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度
48
4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交
液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待 测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在 35~42 ℃杂交
的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分
子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts 溶液或脱脂奶粉。
51
五、 其它分子杂交方法
Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交
固相杂交
52
（一）Northern印迹杂交
30
5、Southern杂交
1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点 预杂交液为不含DNA探针的杂交液
2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交 双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交
3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA
31
6. 杂交结果的检测
化学显色或放射自显影
32
第三章-分子杂交与印迹技术
的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分
子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶 液或脱脂奶粉
.
四、应 用 1.检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系； 2.用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝
数及表达丰度。
.
第二节 核酸分子杂交的方法
按待测核酸是否固定在固相支持物上分：
为
1 2
1
1
2 = 1+K2Cot
Cot1/2=
1 K2
（3）
Cot1/2值越大，复性速度越慢
.
二、分子杂交
• 将任何具有互补核苷酸顺序的两条单链核 酸分子放入同一个反应体系，两条互补链 可通过复性重新缔合形成双链，这一过程 成为核酸分子杂交。
.
三、探针
探针：是指带有标记物的、能与被检测
的核酸片段互补的一段已知核酸片段。
.
酶促标记法 1.切口平移法（nick translation)
1、利用DNase I在DNA双链上造成单链切口
2、利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53核酸外 切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除
3、在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以 互补的DNA单链为模板依次将dNTP连接到切 口的3末端-OH上，合成新的DNA链，同时将 标记的核苷酸掺入到新的DNA链中
酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使
双链核酸分子链间的氢键断裂。
.
3、变性后的理化性质变化： 粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加
.
4、DNA变性曲线 AT区先解链 GC区后解链 阶梯式曲线
.
5、GC含量与Tm值之间的关系 （G+C）%=（Tm-69.3) ×2.44 Tm =(G+C)%×0.41+69.3
子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶 液或脱脂奶粉
.
四、应 用 1.检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系； 2.用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝
数及表达丰度。
.
第二节 核酸分子杂交的方法
按待测核酸是否固定在固相支持物上分：
为
1 2
1
1
2 = 1+K2Cot
Cot1/2=
1 K2
（3）
Cot1/2值越大，复性速度越慢
.
二、分子杂交
• 将任何具有互补核苷酸顺序的两条单链核 酸分子放入同一个反应体系，两条互补链 可通过复性重新缔合形成双链，这一过程 成为核酸分子杂交。
.
三、探针
探针：是指带有标记物的、能与被检测
的核酸片段互补的一段已知核酸片段。
.
酶促标记法 1.切口平移法（nick translation)
1、利用DNase I在DNA双链上造成单链切口
2、利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53核酸外 切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除
3、在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以 互补的DNA单链为模板依次将dNTP连接到切 口的3末端-OH上，合成新的DNA链，同时将 标记的核苷酸掺入到新的DNA链中
酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使
双链核酸分子链间的氢键断裂。
.
3、变性后的理化性质变化： 粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加
.
4、DNA变性曲线 AT区先解链 GC区后解链 阶梯式曲线
.
5、GC含量与Tm值之间的关系 （G+C）%=（Tm-69.3) ×2.44 Tm =(G+C)%×0.41+69.3
医学分子生物学第九章印迹杂交技术
cDNA； 分别用cy3(绿色)和cy5红色两种荧光燃料标记两种
cDNA。 将标记后的cDNA与点好的芯片进行杂交。 激光扫描芯片杂交结果，计算机处理。 分析杂交数据。
基因芯片
芯片杂交操作流程：
基因芯片
经大规模PCR扩增获得独立cDNA插入片段
人工制作芯片
商业化芯片
分别用cy3(绿色)和cy5红色两种荧光燃料标记两 种cDNA
23 ICK
4 IL-3
22 MIP-3 alpha
25 MMP-8
原始值
model
normal
30386
12625 14732 14606 11547.5 9262.5 20601 16912 16590.5 22787 28232.5
12482.5
7836.5 8059.5 8564.5 6742.5
辣根过氧化物酶源自底物产物， 并发出光辣根过氧化物酶：HRPO 底片曝光
③ Blotting过程
1）牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜 2）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与
膜上的蛋白结合。 3）洗去未结合的一抗。 4）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。 5）清洗掉未结合的二抗。 6）显影，检测
④结果 单抗blotting 结果
在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测 胶上的蛋白质泳带。
（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）：
是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线 性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。
② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） （Polyacrylamide gel electrophoresis）
（一）核酸的变性与复性
复性
RNA
DNA
cDNA。 将标记后的cDNA与点好的芯片进行杂交。 激光扫描芯片杂交结果，计算机处理。 分析杂交数据。
基因芯片
芯片杂交操作流程：
基因芯片
经大规模PCR扩增获得独立cDNA插入片段
人工制作芯片
商业化芯片
分别用cy3(绿色)和cy5红色两种荧光燃料标记两 种cDNA
23 ICK
4 IL-3
22 MIP-3 alpha
25 MMP-8
原始值
model
normal
30386
12625 14732 14606 11547.5 9262.5 20601 16912 16590.5 22787 28232.5
12482.5
7836.5 8059.5 8564.5 6742.5
辣根过氧化物酶源自底物产物， 并发出光辣根过氧化物酶：HRPO 底片曝光
③ Blotting过程
1）牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜 2）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与
膜上的蛋白结合。 3）洗去未结合的一抗。 4）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。 5）清洗掉未结合的二抗。 6）显影，检测
④结果 单抗blotting 结果
在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测 胶上的蛋白质泳带。
（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）：
是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线 性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。
② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） （Polyacrylamide gel electrophoresis）
（一）核酸的变性与复性
复性
RNA
DNA
【学习课件】第7章_第4节_分子杂交和印迹技术(3_LMJ)'
单链探针
用化学法合成或从克隆在M13噬菌体的特异性 基因片段制备；优点是在杂交反应中可以排除互补 链的干扰。
2020/10/17
ppt课件
10
2．RNA探针
与 DNA 单 链 探 针 相 比 ， RNA 探 针 具 有 标 记 效 率高、易于纯化、成本低和杂交信号强等优点
➢早期采用细胞mRNA和病毒RNA作探针
不影响碱基配对的特异性与稳定性 灵敏度和特异性极高 对各种酶促反应无任何影响
放射性污染
半衰期短, 随用随标
ppt课件
13
r-32P ATP
a-32P dATP
*
*
3’ 2’ H
dATP
32P的放射性较强，放射自显影所需时间较短，
灵敏度高，可广泛应用于各种印迹杂交。
缺点是半衰期短(14.3天)，射线散射严重，放
核 酸 分 子 杂 交 (nucleic acid hybr指id具iz有a一ti定on互)补序列、不同来源的核苷酸单链，
在一定条件下按照碱基互补配对的原则，形成核苷 酸双链的过程。
Marmum和Doty1961年发现的DNA变性复性现象 是核酸杂交技术的理论基础。
2020/10/17
ppt课件
3
(heteroduplex)
2020/10/17
ppt课件
17
DNA随机引物标记法示意图
随机引物：含有各种 可能排列顺序的寡核 苷酸片段的混合物。 46=4096
DNA 聚 合 酶 ⅠKlenow片段：保留 5’→3’ DNA聚合酶活 性 , 弱 3’→5’ 外 切 酶 活性，无5’→3’外切 酶活性。
2020/10/17
ppt课件
与待测特定核苷酸的某一段序列相互补； 有明确的标志用于后续的检测。
用化学法合成或从克隆在M13噬菌体的特异性 基因片段制备；优点是在杂交反应中可以排除互补 链的干扰。
2020/10/17
ppt课件
10
2．RNA探针
与 DNA 单 链 探 针 相 比 ， RNA 探 针 具 有 标 记 效 率高、易于纯化、成本低和杂交信号强等优点
➢早期采用细胞mRNA和病毒RNA作探针
不影响碱基配对的特异性与稳定性 灵敏度和特异性极高 对各种酶促反应无任何影响
放射性污染
半衰期短, 随用随标
ppt课件
13
r-32P ATP
a-32P dATP
*
*
3’ 2’ H
dATP
32P的放射性较强，放射自显影所需时间较短，
灵敏度高，可广泛应用于各种印迹杂交。
缺点是半衰期短(14.3天)，射线散射严重，放
核 酸 分 子 杂 交 (nucleic acid hybr指id具iz有a一ti定on互)补序列、不同来源的核苷酸单链，
在一定条件下按照碱基互补配对的原则，形成核苷 酸双链的过程。
Marmum和Doty1961年发现的DNA变性复性现象 是核酸杂交技术的理论基础。
2020/10/17
ppt课件
3
(heteroduplex)
2020/10/17
ppt课件
17
DNA随机引物标记法示意图
随机引物：含有各种 可能排列顺序的寡核 苷酸片段的混合物。 46=4096
DNA 聚 合 酶 ⅠKlenow片段：保留 5’→3’ DNA聚合酶活 性 , 弱 3’→5’ 外 切 酶 活性，无5’→3’外切 酶活性。
2020/10/17
ppt课件
与待测特定核苷酸的某一段序列相互补； 有明确的标志用于后续的检测。
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分子杂交与印迹技术的原理复性
一、分子杂交与印迹技术的原理
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链
分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一 起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定 的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形 成杂化双链(heteroduplex) 。
▪ 应用：用于检测样品中特异性蛋白质 的存在、细胞中特异蛋白质的半定量 分析以及蛋白质分子的相互作用研究 等。
分子杂交与印迹技术的原理复性
三 种 印 迹 技 术 的 比 较
分子杂交与印迹技术的原理复性
（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的 分析。
分子杂交与印迹技术的原理复性
原位杂交 in situ hy或细胞 涂片直接用于杂交分析。先经适当处 理，使细胞通透性增加，让探针进入 细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位 杂交可以确定探针的互补序列在胞内 的空间位置，这一点具有重要的生物 学和病理学意义。
分子杂交与印迹技术的原理复性
第二节 聚合酶链反应
Polymerase Chain Reaction
分子杂交与印迹技术的原理复性
PCR技术 polymerase chain reaction
▪ PCR即聚合酶链反应技术，是指利用耐热 DNA聚合酶的反复作用，通过变性-延伸复性的循环操作，在体外迅速将DNA模板 扩增数百万倍的一种操作技术。
分子杂交与印迹技术的原理复性
探针技术 probe
▪ 将一小段已知序列的核酸片段用放射性 同位素、生物素或荧光染料对它的末端 或全链进行进行标记，称为“探针”然后 用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、 荧光检测或显色技术，使杂交区带显现 出来
分子杂交与印迹技术的原理复性
二、印渍技术的类别及应用
▪ DNA印迹技术 Southern blotting
分子杂交与印迹技术的原理复性
Southern Blotting
无水乙醇
酚/氯仿
蛋白酶K
SDS
离心
tissue
Paper Towels
分子杂交与印迹技术的原理复性
（二）RNA印渍技术 Northern blotting
▪ 又称为Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析。 是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维 素膜上的方法。
（二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。
（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
分子杂交与印迹技术的原理复性
斑点印迹 Dot blotting
▪ 斑点杂交法是不经过电泳，而将被检标 本直接点到膜上，烘烤固定，用于杂交。 这种方法耗时短，可做半定量分析，一 张膜上可同时检测多个样品。
分子杂交与印迹技术的原理复性
复性
RNA
DNA
分子杂交与印迹技术的原理复性
（一）印渍技术 Blotting
▪ 首先由Edwen Southern在1975年提出。 ▪ Blotting即“印渍”，指将存在于凝胶中的生物大
分子转移（印渍）到固定化介质是病加以检测 分析的技术，目前广泛应用于DNA、RNA、和 蛋白质的检测
▪ 又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交 分析。是研究DNA图谱的基本技术，主 要用于基因组DNA的分析，如在基因组 中特异基因的定位及检测等，亦可用于 分析重组质粒和噬菌体。 在遗传诊断 DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有 重要价值。
分子杂交与印迹技术的原理复性
基本方法
• 将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶 解片段；
▪ RNA印迹技术 Northern blotting
▪ 蛋白质印迹技术 Western blotting
▪ 斑点印迹 Dot blotting
▪ 原位杂交 in situ hybridization
▪ DNA点阵
DNA array
▪ DNA芯片技术 DNA chip
分子杂交与印迹技术的原理复性
（一）DNA印迹技术 Southern blotting
变性
95˚C
5 5
5 5
5 5
Cycle 3
5
5
5
5
5
5
5
5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
分子杂交与印迹技术的原理复性
二、PCR体系基本组成成分
模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+
分子杂交与印迹技术的原理复性
三、PCR的基本反应步骤
▪ 主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异 mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的 同一基因的表达情况。
分子杂交与印迹技术的原理复性
（三）蛋白质印渍技术 Western blotting
▪ 又称为Western杂交，或免疫印渍技术， 即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝 酸纤维素膜上的特异性蛋白质。
• 经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中 转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定，凝胶中DNA片段的相对位 置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。
• 附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确 定探针互补的每条DNA带的位置，确定在众多酶解产物中含某一 特定序列的DNA片段的位置和大小。
▪ 理论上可在2小时内将一个DNA分子扩增 到106-109倍，从而大大提高对其进行分析 研究的速度。
分子杂交与印迹技术的原理复性
一、基本工作原理
Template 5 DNA
5
5
Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
5 5
5 5
Cycle 2
5 5
5
5
5
5
分子杂交与印迹技术的原理复性
第二十二章
常用分子生物学技术的 原理及应用
The Popular Technology in Molecular Biology:Principle and Application
分子杂交与印迹技术的原理复性
第一节 分子杂交与印迹技术
Molecular Hybridization & Blotting Technology
一、分子杂交与印迹技术的原理
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链
分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一 起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定 的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形 成杂化双链(heteroduplex) 。
▪ 应用：用于检测样品中特异性蛋白质 的存在、细胞中特异蛋白质的半定量 分析以及蛋白质分子的相互作用研究 等。
分子杂交与印迹技术的原理复性
三 种 印 迹 技 术 的 比 较
分子杂交与印迹技术的原理复性
（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的 分析。
分子杂交与印迹技术的原理复性
原位杂交 in situ hy或细胞 涂片直接用于杂交分析。先经适当处 理，使细胞通透性增加，让探针进入 细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位 杂交可以确定探针的互补序列在胞内 的空间位置，这一点具有重要的生物 学和病理学意义。
分子杂交与印迹技术的原理复性
第二节 聚合酶链反应
Polymerase Chain Reaction
分子杂交与印迹技术的原理复性
PCR技术 polymerase chain reaction
▪ PCR即聚合酶链反应技术，是指利用耐热 DNA聚合酶的反复作用，通过变性-延伸复性的循环操作，在体外迅速将DNA模板 扩增数百万倍的一种操作技术。
分子杂交与印迹技术的原理复性
探针技术 probe
▪ 将一小段已知序列的核酸片段用放射性 同位素、生物素或荧光染料对它的末端 或全链进行进行标记，称为“探针”然后 用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、 荧光检测或显色技术，使杂交区带显现 出来
分子杂交与印迹技术的原理复性
二、印渍技术的类别及应用
▪ DNA印迹技术 Southern blotting
分子杂交与印迹技术的原理复性
Southern Blotting
无水乙醇
酚/氯仿
蛋白酶K
SDS
离心
tissue
Paper Towels
分子杂交与印迹技术的原理复性
（二）RNA印渍技术 Northern blotting
▪ 又称为Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析。 是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维 素膜上的方法。
（二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。
（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
分子杂交与印迹技术的原理复性
斑点印迹 Dot blotting
▪ 斑点杂交法是不经过电泳，而将被检标 本直接点到膜上，烘烤固定，用于杂交。 这种方法耗时短，可做半定量分析，一 张膜上可同时检测多个样品。
分子杂交与印迹技术的原理复性
复性
RNA
DNA
分子杂交与印迹技术的原理复性
（一）印渍技术 Blotting
▪ 首先由Edwen Southern在1975年提出。 ▪ Blotting即“印渍”，指将存在于凝胶中的生物大
分子转移（印渍）到固定化介质是病加以检测 分析的技术，目前广泛应用于DNA、RNA、和 蛋白质的检测
▪ 又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交 分析。是研究DNA图谱的基本技术，主 要用于基因组DNA的分析，如在基因组 中特异基因的定位及检测等，亦可用于 分析重组质粒和噬菌体。 在遗传诊断 DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有 重要价值。
分子杂交与印迹技术的原理复性
基本方法
• 将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶 解片段；
▪ RNA印迹技术 Northern blotting
▪ 蛋白质印迹技术 Western blotting
▪ 斑点印迹 Dot blotting
▪ 原位杂交 in situ hybridization
▪ DNA点阵
DNA array
▪ DNA芯片技术 DNA chip
分子杂交与印迹技术的原理复性
（一）DNA印迹技术 Southern blotting
变性
95˚C
5 5
5 5
5 5
Cycle 3
5
5
5
5
5
5
5
5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
分子杂交与印迹技术的原理复性
二、PCR体系基本组成成分
模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+
分子杂交与印迹技术的原理复性
三、PCR的基本反应步骤
▪ 主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异 mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的 同一基因的表达情况。
分子杂交与印迹技术的原理复性
（三）蛋白质印渍技术 Western blotting
▪ 又称为Western杂交，或免疫印渍技术， 即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝 酸纤维素膜上的特异性蛋白质。
• 经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中 转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定，凝胶中DNA片段的相对位 置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。
• 附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确 定探针互补的每条DNA带的位置，确定在众多酶解产物中含某一 特定序列的DNA片段的位置和大小。
▪ 理论上可在2小时内将一个DNA分子扩增 到106-109倍，从而大大提高对其进行分析 研究的速度。
分子杂交与印迹技术的原理复性
一、基本工作原理
Template 5 DNA
5
5
Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
5 5
5 5
Cycle 2
5 5
5
5
5
5
分子杂交与印迹技术的原理复性
第二十二章
常用分子生物学技术的 原理及应用
The Popular Technology in Molecular Biology:Principle and Application
分子杂交与印迹技术的原理复性
第一节 分子杂交与印迹技术
Molecular Hybridization & Blotting Technology