结核分枝杆菌三种复活促进因子的原核表达和初步应用
结核分枝杆菌复活促进因子B的原核表达、鉴定和纯化
【 摘ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
要】 的： 目 构建结核分枝杆菌复活促进 因子 Ｂ Ｒ ｍ） （ ｐ 的原核表达质粒 ， 并在大肠杆菌 中表达和纯化。 方法： 聚合 酶链 反 采用
应 （Ｃ ） Ｐ Ｒ 方法从 结核分枝杆 菌 Ｈ３ Ｒ ７ ｖ基 因组 Ｄ Ａ中扩增 出 Ｒ ｆ 基 因（０ ９ ｐ ， Ｎ ｐＢ １８ ｂ ）然后 用双 内切酶 消化后 ， 与同样 酶消化 的 ｐ Ｔ２（ ） Ｅ ３ ａ ＋ 载体连接 ， 转入 大肠 杆菌 Ｔ ｐ Ｏ 阳性克 隆用酶切 和 Ｄ Ａ 测 序鉴定 。测 序正确后 ， 重组质粒 转化到 的大肠杆 菌 Ｏ Ｉ； Ｎ 将 Ｂ２ Ｌ １中， ＩＴ 经 Ｐ Ｇ诱导 ， ， 由 Ｉ ７启动子调控表达了 Ｒ ｍ 蛋白； ｐ 利用 Ｗｅｔ ｎ ｂ ｔ ｓ ｒ— ｌ 法对表达蛋 白进行鉴定 ， ｅ ｏ 最后对 目的蛋白进行 纯 化。 结果： 双酶切鉴定所切下 的片段大小与理论值相符 ， 测序结果与文献报道一致 。 Ｓ Ｓ Ｐ Ｇ 经 Ｄ — Ａ Ｅ分析和 Ｗｅｔ — ｌ 鉴定均发 ｓ ｒ ｂｏ ｅ ｎ ｔ
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结核分枝杆菌4种抗原的基因克隆、表达、纯化和抗原性初步检测
结核分枝杆菌4种抗原的基因克隆、表达、纯化和抗原性初步检测冯晓燕;Albert W.Tam;陈坤;王国华;宋晓国;朱翠侠;张贺秋【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2006(17)6【摘要】目的:克隆38kD、ESAT-6、CFPl0和MPT64等4种结核分枝杆菌抗原基因,利用大肠杆菌表达系统分别表达重组蛋白,纯化并初步评价其抗原性.方法:通过PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中扩增38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64抗原的基因,连接入pBVIL1表达载体,在大肠杆菌HB101株中进行表达,以间接ELISA方法初步评价其抗原性.结果:获得了结核分枝杆菌抗原38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64的基因,并在大肠杆菌中进行了高效表达,初步验证所纯化获得的抗原具有良好的抗原性.结论:pBVIL1表达载体可以高效表达多种结核分枝杆菌抗原,38kD、ESAT-6和CFP10抗原均可作为结核病血清学诊断的候选抗原.【总页数】3页(P865-867)【作者】冯晓燕;Albert W.Tam;陈坤;王国华;宋晓国;朱翠侠;张贺秋【作者单位】军事医学科学院,基础医学研究所,北京,100850;Fastgen Corporation,Fosterv City,CA 94404,USA;军事医学科学院,基础医学研究所,北京,100850;军事医学科学院,基础医学研究所,北京,100850;军事医学科学院,基础医学研究所,北京,100850;军事医学科学院,基础医学研究所,北京,100850;军事医学科学院,基础医学研究所,北京,100850【正文语种】中文【中图分类】Q786;R392.11【相关文献】1.Tamm-Horsfall蛋白片段的基因克隆、表达、纯化及抗原性鉴定 [J], 朱美财;马红雨;王红;陈涛2.结核分枝杆菌抗原优势肽段融合抗原38 kD-ESAT6-CFP10的构建与抗原性初步检测 [J], 冯晓燕;陈坤;宋晓国;王国华;朱翠侠;李惠文;韦攀健;张贺秋3.结核分枝杆菌14 000抗原基因的克隆、表达纯化及抗原性分析 [J], 杨柳;苏明权;岳乔红;程晓东;马越云;郝晓柯4.人成熟型TGF-β1基因克隆、表达纯化及抗原性的检测 [J], 龚环宇;胡国龄;谭德明;汪玲;侯珏;刘映霞5.结核分枝杆菌融合抗原Rv3914-6His的原核表达、纯化与抗原性检测 [J], 蔡家麟;潘欣;王颖;陈敏;廖万清因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
3种结核分枝杆菌复活促进因子基因的克隆、原核表达与纯化鉴定
Ａ Ｓ Ｒ Ｃ ： ｏ ｅ ｐ ｅ ｓ ｎ ｕ ｉ ｈ ｅ ｅ ｎ ｏ ｉ ｅ ｕ ｃ ａｉｎ ｐ ｏ ｔ ｇ ｆｃｏ （ ｐ Ｂ） Ｄ（ ｐ Ｄ） Ｅ ｒ ｆ Ｂ Ｔ Ａ Ｔ Ｔ ｘ ｒ ｓ ｄ ｐ ｒ ｙｔ ｅｇ ｎ ｓ ｃ ｄｎ ｒｓ ｓ ｉ ｔ － ｒ ｍｏ ｉ ａ ｔｒＢ ｒ ｆ ， ｒ ｆ ， （ ｐ Ｅ）ｏ ａ ｆ ｅ ｇ ｔ ｏ ｎ ｆ
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ｒｆ ｖ 并获 得 了 ３种 高 纯 度 的 重 组 蛋 白 ， 以 后 的 深 入研 究 奠 定 了基 础 。 ｐＥ ， 为
关 键 词 ： 核 分 枝 杆 菌 ；ｐ ； 隆 ； 达 ； 化 结 ｒ， 克 表 纯 中 图 分 类 号 ：３ ８ ９ 文 献标 识 码 ： Ｒ ７ ．１ Ａ
Ｃｌ ｎｉ ｇ ａ ｒ ｋａ ｙ ｔｃ ｅ ｐｒ ｓ ｉ ｎ ｏ ｅ ｓ ｅ ｏ ｎ ｅ ｕ ｃ ｔ ｔｏ － ｏ ｎ ｎｄ ｐ ｏ ｒ ｏ ｉ ｘ ｅ ｓｏ ｆ ｇ ｎｅ ｎｃ ｄｉ ｇ ｒ ｓ ｓ ｉａ ｉ ｎ ｐ ｏ ｏ ｉ ｇ ｆ ｃ ｏ ｓ ｆ ｏ ｙ ｏ ａ ｔ ｒ ｕ ｔ ｂ ｒ ｕｌ ｓ ｓ ａ ｔ ｕ ｉ ｉ ａ ｉ ｎ ｒ ｍ ｔｎ ａ ｔ ｒ ｒ ｍ Ｍ ｃ ｂ ｃ ｅ ｉ ｍ ｕ ｅ ｃ ｏ ｉ ｎｄ ｉｓ ｐ ｒ ｆｃ ｔｏ
结核分枝杆菌RpfA蛋白的原核表达、鉴定和纯化
【 摘
要】 目的 ： 构建结核分枝杆菌 （ ｙｏａ ｅｕ ｂｒ ｌ ｉ Ｍ Ｂ 复活促进 因子 Ａ Ｒ ｓｓｔ ｏ— ｒ ｏｎ ｃ ｒＡ ｐ ） Ｍ ｃｂｃ ｒｍ ｔ ｅ ｕ ｓ ， Ｔ ） ｔ ｉ ｕ ｃ ｏｓ （ ｅ ｃａ ｎｐ ｍｔ ｇｆ ｔ ，Ｒ ｆ 的 ｕ ｉｔ ｉ ｏ ｉ ａｏ Ａ
原核表达质粒 ， 并在大肠杆菌 中表达和纯化 。方法 ： 采用聚合酶链反应（ Ｃ 方法从结核分枝杆菌 Ｈ ７ ｖ基因组 Ｄ Ａ中扩增 Ｐ Ｒ） ３Ｒ Ｎ 出 Ｒ ｆ 基因（ ２ ｂ ）然后用双 内切酶消化后 ， ｐ Ａ １２４ ｐ ， 与同样酶 消化 的 ｐ Ｔ ２ ｄ（ ）载体连接 ， Ｅ ３ａ ＋ 转入大肠杆菌 Ｔｐ Ｏ 阳性 克隆用 ｏｌ； 酶切 和 Ｄ Ａ 测序鉴定。测序正确后 ， Ｎ 将重组质粒转化到的大肠杆菌 Ｂ ２ Ｌ １中 ， ＩＴ 经 Ｐ Ｇ诱导 ， Ｔ 由 ７启动子调控表达 了 Ｒ ｆ ｐＡ蛋 白； 利用 Ｈｓｔ ｎｇｌＳ ｉ对 表达蛋 白进行鉴定 ， ｉ ａ ｉ～ｅ ｔｎ —ｇ ａ 最后对 目的蛋 白进行纯化 。 结果 ： 双酶切鉴定所切下 的片段大小与理论值相 符， 测序结果与文献报道一致 。 Ｓ Ｓ Ｐ Ｇ 经 Ｄ — Ａ Ｅ分析和 Ｈ ｓｔ ｎ ｇｌＳ ｉ 鉴定均发现 ６ ｋ ｉ ａ ｉ— ｅ ｔ ｎ —ｇ ａ ６ ｕ处有特异性蛋 白条带。 结论 ： 成功克 隆并构建 了 Ｒ ｆ ｐＡ基因的重组表达质粒 ｐ Ｔ ２ ＋ 一 ｐＡ， Ｅ ３ ｄ（ ）Ｒ ｆ 并获得了高纯度 的重组蛋 白， 为以后 的深入研究奠定了基础 。
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５０ 一 ６
重 庆 医科 大 学 学 报 ２ ０ ０ ８年 第 ３ ３卷 第 ５期 （ｏ ｒａ ｆ ｏ ｇ ｉｇＭｅ ｉａ Ｕｎ ｅｓｔ Ｏ ８ Ｖ １ ３Ｎｏ５ Ｊ ｕｎ ｌ ｎ ｑｎ ｄｃ ｌ ｉ ｒｉ ２ ０ ． ｏ． ．） ｏ Ｃｈ ｖ ｙ ３
结核杆菌复苏促进因子在分枝杆菌培养中的作用观察
Ｉ ＭＨＧ Ｎ，Ａｕ ｕｔ２ １ ，Ｖｏ．７ Ｎ ．５ ｇｓ ０ １ １ ｏ１ １
・
科 研 课 题
结 核杆 菌 复苏 促进 因子 在分 枝 杆 菌培 养 中 的
作用 观察
郑小凌 蔡杏珊 谢 贝 孟繁 荣 高俊文 尹小毛 周辉林 刘志辉 【 摘要 】 目的 探讨 结核杆菌复 苏因子 （ Ｂ Ｒ Ｆ）在结核患者标本 的分枝杆菌培养 中的作用 。 Ｔ—Ｐ
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【 ｂｔ ｃ】 Ｏｊｃｖ Ｔ ｐ ｒ ｔ ｌｏＴ —ｅ ｓ ｔｉ ｏ ｏｎ ｃ ｒ ｒｅ ｓ（ Ｂ Ｒ Ｆ ） Ａ ｓａｔ ｂｅｔｅ ｏ ｘｌ ｅｈ ｒ ｅ ｆ Ｂ ｒｓ ｃａ ｏ ｐ ｍ ｔｇａｔ ｏ ｉ Ｔ — Ｐ ｓ ｒ ｉ ｅ ｏ ｅｏ ｕ ｉ ｔｎ ｒ ｉ ｆ ｏｐ ｔｎ
方法
收集 疑似结核患者 的痰液 ４ 例 ，支 冲液 ８ ，胸腔积 液 ２ 例 ，经 ４ ａ Ｈ液化处理后用 Ｐ Ｓ ２ 例 ５ ％Ｎ Ｏ Ｂ
洗 涤并悬浮菌体 ，每份标 本分设对照组和 Ｒ Ｆ ， 照两 组各 ０５ｍ１ 液量 接种于 ＭＧ Ｔ培养管 。对 Ｐ组 按 ． 菌 Ｉ 照组培养基采用含 Ｍｉｄｅ ｒｏ ７ 的常规 ＭＧ Ｔ ｄ ｌ ｏｋ Ｈ９ ｂ Ｉ 培养管 ， Ｐ 组则在对 照组基础Ｊ ￣ ） Ｒ ｆ ／／／ ／ ＲＦ ２ ［ ， ｐ Ａ ＢＣＤＥ Ｉ．
结核分枝杆菌复活促进因子E的原核表达及纯化
结核分枝杆菌复活促进因子E的原核表达及纯化徐蕾;何永林;李娜;王瑜伟;朱道银【期刊名称】《中国生物制品学杂志》【年(卷),期】2007(20)4【摘要】目的构建结核分枝杆菌复活促进因子E(RpfE)的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达并纯化。
方法采用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出RpfE基因,双内切酶消化后,与同样酶消化的pET32a(+)载体连接,转化大肠杆菌Top10。
阳性克隆经酶切和DNA测序鉴定正确后,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,由T7启动子调控表达RpfE蛋白,并对表达蛋白进行鉴定和纯化。
结果双酶切鉴定所切下的片段大小与预期相符,测序结果与文献报道一致。
经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,在相对分子质量41000处均可见特异性蛋白条带。
经Ni2+-NTA金属螯合层析后,重组蛋白纯度可达90%以上。
结论已成功地克隆并构建了RpfE基因的重组表达质粒pET32a(+)-RpfEv,并获得了高纯度的重组蛋白,为以后的深入研究奠定了基础。
【总页数】4页(P252-255)【关键词】结核分枝杆菌;复活促进因子E;原核表达【作者】徐蕾;何永林;李娜;王瑜伟;朱道银【作者单位】重庆医科大学微生物学与免疫学教研室【正文语种】中文【中图分类】Q786;R378.911【相关文献】1.结核分枝杆菌glcB基因原核表达质粒的构建、表达和纯化 [J], 陈曦;张宗德;贾红彦;古淑香;李自慧;刘忠泉;郑晓静;邢爱英;杜博平;张继增2.结核分枝杆菌mpt51基因原核表达载体的构建、表达和纯化 [J], 陈曦;张宗德;古淑香;贾红彦;李自慧;郑小静;刘忠泉;邢爱英;杜博平;张继增3.3种结核分枝杆菌复活促进因子基因的克隆、原核表达与纯化鉴定 [J], 徐蕾;王瑜伟;朱道银4.结核分枝杆菌glcB基因原核表达载体的构建、表达和纯化 [J], 陈曦;贾红彦;古淑香;李自慧;刘忠泉;郑小静;邢爱英;杜博平;张继增;张宗德5.结核分枝杆菌复活促进因子B的原核表达、鉴定和纯化 [J], 徐蕾;何永林;张黎;辛渝;朱道银因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
结核分枝杆菌复苏因子E的真核表达及鉴定
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结核分枝杆菌复苏促进因子基因克隆及其蛋白质的表达
５ ６ ～ ５ ２ ５７５７．
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５个 复 苏 因子基 因 ， 内切 酶 酶 切 、 回 收 ， 片段 亚 克 隆 到 Ｔ载体 中 ， 化 至 Ｄ ５ 经 胶 将 转 Ｈ ａ。 以 Ｐ Ｒ 鉴 定 的 阳性 菌 落转 至 Ｌ Ｃ Ｂ中 培 养 ， 液 进 行 质粒 提 取 、 切 、 回 收 ， 收片 段 再 克 隆 至表 达 载体 ｐ Ｔ ０ 菌 酶 胶 回 Ｅ ３ａ中 ， 化 至 Ｄ ａ 中。Ｐ Ｒ 阳性 菌 落 转 至 Ｌ 转 Ｈ５ Ｃ Ｂ中 培 养 ， 序 确 定插 入 片 段 的 正 确 性 ， 测 菌液 提 取 质 粒 ， 再转 化 至 Ｂ ２ （ Ｅ ） 。经 Ｐ Ｒ 鉴定 阳性 的菌 液 通 过 适 当 的 ＩＴ 并 Ｌ １Ｄ ３ 中 Ｃ Ｐ Ｇ浓 度 诱 导 ， 宜 温 度 和 时 间 下 ， 导 蛋 白表 达 ， Ｓ Ｓ Ｐ Ｅ 电泳 分 析 ， ｓ ｒ ｌ 检 测 目的 蛋 白 ， 适 诱 经 Ｄ — ＡＧ Ｗｅｔ ｂｏ ｅ ｎ ｔ 在最 佳 条 件 下 大量 表 达 目的
三种结核分枝杆菌抗原的抗体联合检测在临床中的应用参考模板
三种结核分枝杆菌抗原的抗体联合检测在临床中的应用作者：崔晓利，姚小红，刘春梅，张增贤【摘要】目的：通过结核菌三种抗原脂阿拉伯甘露糖(LAM)、16KDa、38KDa固相于同一膜片上制作的结核蛋白芯片系统联合检测结核患者血清中的相应抗体，以达到快速诊断结核病的目的。
方法：收集西安市结核病胸部肿瘤医院痰涂片或者结核菌培养阳性患者的血清98例，痰涂片或者结核菌培养阴性患者的血清54例，结核性脑炎、结核性胸膜炎患者血清20例，通过结核蛋白芯片系统检测三种抗体，任意一种抗体阳性即为结核抗体阳性。
结果：活动性肺结核阳性率86.7%(85/98)，痰涂片阴性的肺结核阳性率66.7%(36/54)，结核性脑炎、结核性胸膜炎阳性率45%(9/20)。
结论：三种抗原联合使用具有良好的敏感性与特异性，明显优于任何一种抗原单独使用，联合使用将会对结核病的快速辅助诊断起积极作用。
【关键词】结核分枝杆菌；联合检测；抗原；芯片结核病是长期以来危害人类生命健康的严重疾患，特别是我们国家患者数约450万，每年病死近20万人。
结核病的病原体为结核杆菌，它除了能引起呼吸道感染外，还可引起其他部位的病变，因此，结核病的早期快速诊断对结核病的防治具有极其重要的意义。
我们使用基因工程表达的结核菌蛋白16KDa和38KDa以及脂阿拉伯甘露糖(LAM)三种抗原制作的结核蛋白芯片联合检测结核抗体，在临床上取得较理想的快速诊断效果。
1 材料与方法1.1 血清标本来源结核患者的血清均来源于西安市结核病医院的住院患者，其中痰直涂或者培养阳性患者98例，痰涂片阴性患者54例，结核性脑炎或者结核性胸膜炎的患者20例。
1.2 结核菌多抗原的IgG抗体芯片检测系统由南京大渊生物技术工程有限责任公司提供。
批准文号：国药准字S2*******。
1.3 蛋白芯片阅读仪南京大渊生物技术工程有限公司自主设计生产，型号：PBT-X4。
1.4 芯片系统操作步骤在芯片上标记样品编号；在芯片盒窗口内滴加4滴试剂A，使膜表面完全浸湿；待完全渗入后，加入待检血清100ue；待血清完全渗入后，再滴加6滴试剂B；待试剂B完全渗入后，滴加10滴试剂C；待试剂C完全渗入后，最后滴加6滴试剂D；反应完毕后30 min 内，将芯片放入芯片阅读系统进行分析。
结核分枝杆菌Rv2450c基因的克隆和原核表达
结核分枝杆菌Rv2450c基因的克隆和原核表达作者：李立青，苏明权，李立文，郝晓柯【关键词】分枝杆菌Cloning and prokaryotic expression of Mycobacterium tuberculosis Rv2450c gene【Abstract】AIM: To explore whether the Mycobacterium tuberculosis Rv2450c gene can promote its own resuscitation and growth. METHODS: Mycobacterium tuberculosis was cultured and genome DNA was extracted. Rv2450c gene was obtained by PCR using specific primers, cloned into BamHⅠand EcoRⅠsite of pGEX4T2 expression vector and confirmed by sequencing. After the recombinant expression vector being transformed into E.coli BL21（DE3）, the recombinant bacteria were induced at 30℃for 5 h and the fusion protein GSTRv2450c was analyzed by SDSPAGE. RESULTS: DNA sequencing results showed that the Rv2450c gene amplified was exactly consistent with the sequence reported in GenBank and the SDSPAGE analysis demonstrated that the Rv2450c was expressed in E.coli BL21（DE3）. The protein band amounted to 22.9% of total bacteria protein．CONCLUSION: Mycobacterium tuberculosisRv2450c gene is successfully cloned and expressed in E.coli BL21（DE3）.【Keywords】Mycobacterium tuberculosis; resuscitationpromoting factor; cloning, molecular; gene expression【摘要】目的：研究结核分枝杆菌Rv2450c基因是否能促进其复活和生长. 方法：培养结核分枝杆菌，提取其基因组，PCR扩增出Rv2450c基因，克隆入pSP73载体，测序分析. 将该目的基因亚克隆入pGEX4T2表达载体，测序证实正确后转化大肠杆菌BL21（DE3），30℃用IPTG诱导5 h然后进行SDSPAGE分析. 结果：测序结果证实获得了Rv2450c基因，其序列与GenBank中报道完全一致. SDSPAGE分析表明，Rv2450c基因在大肠杆菌BL21（DE3）中表达了重组蛋白，表达的蛋白量约占菌体蛋白的22.9%. 结论：成功克隆了结核分枝杆菌Rv2450c基因，并在大肠杆菌中获得了高效表达.【关键词】分枝杆菌，结核；促进复活因子；克隆，分子；基因表达0引言目前世界人口的三分之一被结核分枝杆菌感染，其中大部分为潜伏性感染，当机体抵抗力下降时，休眠的结核分枝杆菌即活化，引发结核病. 在这个过程中结核分枝杆菌分泌的促进复活因子（resuscitationpromoting factor, RPF）起了重要作用，但其具体机制还不清楚［1，2］. 结核分枝杆菌H37Rv基因序列中Rv0867, Rv1009, Rv1884c, Rv2389c和Rv2450c基因均编码RPF样蛋白，它们同源性很高，是Mr约为16 000的分泌蛋白. 我们克隆表达了Rv2450c基因，为进一步研究其活性奠定了基础.1材料和方法1.1材料大肠杆菌TOP10，BL21（DE3）为第四军医大学西京医院检验科保存；原核表达载体pGEX4T2购自Pharmacia公司；质粒提取试剂盒购自Sigma公司；克隆载体pSP73、胶回收试剂盒购自Promega 公司；BamHⅠ, EcoRⅠ等限制性内切酶和Pyrobest DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、IPTG等购自Takara公司.1.2方法1.2.1PCR引物设计根据GenBank中结核分枝杆菌H37Rv基因组核酸序列（登录号：NC_000962），设计引物，上游引物为5′GAA AGG ATC CAC GAT GAA GAA CGC CCG TAC3′，下游引物为5′TTT GAA TTC TTT TGC GTC TTT TCG CGG TGG TCA G3′，在上、下游引物5′端分别引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点和3个保护碱基，以便于酶切和克隆，引物由上海生工生物工程有限公司合成.1.2.2结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA的提取刮取适量H37Rv菌落，TE（pH 8.0）洗涤后重悬，加SDS至终浓度10 g/L，蛋白酶K至终浓度0.1 g/L, 55～60℃水浴过夜，分别用等体积酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）、氯仿：异戊醇（24∶1）各抽提1次，上层水相加2.5倍预冷的无水乙醇和1/10体积3 mol/L乙酸钠后置-20℃冰浴1 h 沉淀DNA，用无水乙醇、700 mL/L乙醇先后洗涤沉淀2次，抽干后溶于适量ddH2O中.1.2.3Rv2450c基因扩增及克隆和鉴定以H37Rv基因组DNA 为模板用Pyrobest DNA聚合酶进行热启动PCR，循环参数为94℃变性60 s，55℃退火60 s，72℃延伸60 s，30个循环后再72℃延伸10 min.12 g/L琼脂糖凝胶电泳观察分析扩增结果，切胶、用胶回收试剂盒纯化DNA，进行BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，用T4连接酶连接，插入pSP73克隆载体，转化感受态大肠杆菌TOP10，挑取生长状态良好的菌落接种含100 mg/L氨苄青霉素的LB培养基，次日提取质粒DNA，用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定，将获得的阳性克隆送上海生工生物工程有限公司进行测序，得到的正确重组质粒命名为pSP73Rv2450c.1.2.4Rv2450c基因原核表达载体的构建和鉴定将质粒pSP73Rv2450c用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，所获得的片断亚克隆到经同样双酶切的载体pGEX4T2中，得到的重组表达质粒转化感受态大肠杆菌BL21（DE3），经氨苄青霉素筛选，阳性克隆送上海生工生物工程有限公司进行测序，正确的重组质粒命名为pGEX4T2Rv2450c.1.2.5GSTRv2450c融合蛋白的诱导表达将含正确重组质粒pGEX4T2Rv2450c的大肠杆菌BL21（DE3）37℃过夜增菌，次日取适量菌液用含100 mg/L氨苄青霉素的LB培养基进行1∶100稀释，37℃, 220 r/min的条件下培养. 以不同的温度，不同的诱导前菌浓度（A600 nm＝0.1, 0.3, 0.6, 0.8, 1.0），不同的IPTG终浓度（0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.8, 1.0 mmol/L）和不同的时间（3, 4, 5, 6 h）诱导重组蛋白表达. 在4℃, 5000 g条件下离心集菌，将上清、沉淀和菌体分别行120 g/L SDSPAGE. 电泳结束后，用考马斯亮蓝R250染液染色，在脱色液中脱色2 h后观察分析结果.2结果2.1Rv2450c基因序列的获得与鉴定经热启动PCR获得一条约为562 bp大小的特异性条带，与预期目标片段大小相等（Fig 1）.2.2pGEX4T2Rv2450c的双酶切鉴定及测序酶切后琼脂糖凝胶电泳显示出现了4960 bp的载体片段和约562 bp的目的基因片段，测序后证实其序列与GenBank中所给序列完全相同（Fig 2）.2.3pGEX4T2Rv2450c的诱导表达将鉴定正确的阳性克隆株在不同条件下进行诱导表达，120 g/L SDSPAGE分析结果发现，经诱导后表达Mr约44 000的外源蛋白，与预期大小一致. 在30℃, A600 nm 值为0.6, IPTG终浓度为0.3 mmol/L、诱导表达5 h后融合蛋白表达量较高，占菌体蛋白的22.9%，同时发现融合蛋白以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在（Fig 3）.3讨论结核分枝杆菌的5个RPF基因分散在整个基因组中，对刺激静息期细菌生长起重要作用，因此推测对宿主体内潜伏的结核分枝杆菌的复活起促进作用. 分别敲除结核分枝杆菌基因组中的某一个RPF 基因时，其生长并没受到明显影响，说明这一蛋白家族的功能有一定重叠，不是结核分枝杆菌生长所必需的，但从对数生长期到停滞期它们的表达模式不同，在特定的感染期每个RPF基因的功能也不相同［1，3］. Rv2450c是唯一可被15 min酸冲击（acid shock）诱导的RPF 基因，在它编码序列的氨基端有一个富含脯氨酸的区，使它成为免疫学上重要的分泌型抗原，可强烈刺激机体产生抗体及发生迟发型超敏反应［4，5］，研究意义重大，而国内RPF样蛋白的研究报道极少.我们的研究扩增了结核分枝杆菌Rv2450c基因全长序列，并将其克隆入原核表达载体pGEX4T2. 表达载体pGEX4T2是GST融合表达载体，它含有强启动子tac及lac操纵基因、SD序列及lac阻遏蛋白基因等，是一种较为高效的蛋白表达载体. 而且在表达载体pGEX4T2 GST的下游有编码凝血酶识别位点的序列，高效表达的外源蛋白可用GSTrap FF亲和层析纯化，用凝血酶水解回收外源蛋白. 我们用IPTG诱导，在大肠杆菌BL21（DE3）中表达融合基因GSTRv2450c，SDSPAGE电泳显示，在装有外源基因表达载体的大肠杆菌中，出现了特异的Mr约44 000的融合蛋白，而GST处的蛋白质条带消失，仅含空载体的大肠杆菌在Mr 26 000处有GST蛋白的表达，证明了GSTRv2450c融合基因的表达.原核表达中，重组蛋白常常以包涵体的形式表达，对包涵体进行变性、复性处理不仅操作繁琐，而且重组蛋白的活性也往往受到影响. 我们将诱导表达后的大肠杆菌超声裂解后，分别取上清、沉淀和菌体做SDSPAGE电泳，发现表达的蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在，凝胶扫描分析确定表达的目的蛋白量占菌体蛋白的22.9%，因此我们获得了GSTRv2450c融合蛋白的高效表达，这与我们选用了最佳的表达载体和宿主菌及反复优化表达条件是分不开的，其可溶性蛋白为我们下一步大量纯化表达产物，分析其活性，进而深入研究Rv2450c蛋白的结构和功能奠定了基础.【参考文献】［1］Tufariello JM, Jacobs WR Jr, Chan J. Individual Mycobacterium tuberculosis resuscitationpromoting factor homologues are dispensable for growth in vitro and in vivo ［J］. Infect Immun, 2004;72（1）:515-526.［2］苏明权，李立文，张彩莲，等. 结核分枝杆菌Rv1009的生物信息学分析及克隆、表达［J］. 生物技术通讯，2003；14（6）：557-559.Su MQ, Li LW, Zhang CL, et al. Bioinformatic analysis，clonging and expression of Rv1009 of Mycobacterium tuberculosis ［J］. Lett in Biotechnol, 2003;14（6）:557-559.［3］Mukamolova GV, Kaprelyants AS, Young DI, et al. A bacterial cytokine ［J］. Proc Natl Acad Sci, 1998;95:8916-8921.［4］Manca C, Lyashchenko K, Colangeli R, et al. MTC28, a novel 28kilodalton prolinerich secreted antigen specific for the Mycobacterium tuberculosis complex ［J］. Infect Immun, 1997;65（12）:4951-4957.［5］Martin CG, Philippe B, Claire B, et al. The structure of a resuscitationpromoting factor domain from Mycobacterium tuberculosis shows homology to lysozymes ［J］. Nature Structure & Molecular Biology, 2005;12（3）:270-273.。
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重庆医科大学
硕士学位论文
结核分枝杆菌三种复活促进因子的原核表达和初步应用
姓名：徐蕾
申请学位级别：硕士
专业：病原生物学
指导教师：朱道银
20070401
重庆医科大学硕士研究生学位论文
ｐＥＴ３２ａ（＋）空载大小相符），如图１－３。
图１－２ＰＣＲ扩增的Ｓｐｍ，ＲｐｆＤ，ＲｐｆＥ基因
Ｆｉｇ．１－２ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＲｐｆＢ，ＲｐｆＤ，ＲｐＩＥｇｅｎｅ
ｌ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）
２－３：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＲｐｆＥ
４－５：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＲｐｆｌ）
６－７：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｓｔｓｏｆＲｐｆＢ
８：ｕｅｇｔｔｖｅｃｏｎｔｒｏｌ
图１．３三种重组质粒的酶切鉴定
Ｆｉｇ．１－３Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｂｙｅｎｄｏｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
Ｉ
ｌ：ｐＥＴ３２ａ（＋）－ＲｐｆＢｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＢａｍＨ
２：ｐＥＴ３２ａ（＋）－ＲｐｆＤｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＢａｍＨＩ
３：ｐＥＴ３２ａ（＋）－ＲｐｆＥｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＢａｍＨＩ
４／９：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ巾Ｌ２０００）
５／１０：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＤＬｌ５０００）
６：ｐＥＴ３２ａ（＋）－ＲｐｆＢｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＢａｍＨＩａｎｄＨｉｎｄＨＩ
７：ｐＥＴ３２ａ（＋）－ＲｐｆＥｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＢａｍＨＩａｎｄＨｉｎｄⅢ
８：ｐＥＴ３２ａ（＋Ｈｔｐｆｌ）ｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＢａｍＨＩａｎｄＨｉｎｄⅢ
Ｃ＾ＴＧ“Ｔ∞
ｔｔｇａａｇａａｃｇｃｃｃｇｔａｃｇａｃｇｃｔｃａｔｃｇｃｃｇｃｃｇｃｇａｔｔｇｃｃｇｇｇａｃｇｔｔｇｇｔｇａｃｃａｃｇ
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ａｃｔｃｃｇｃｃｇｇｃｔｃｏｇｇａｇｇａｃｇｃｇｇｇｃｔｔｔｇａｔｏｏｏａａｃｃｔｃｃｃｃｃｃｇｃｃｇｃｔｇｇｃｃｃｃｇ
ｇａｏｔｔｏｏｔｇｔｃｏｃｃｇｃｃｔｇｃｇｇａｇｇａａｇｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｃｃｇｔｇｇｃｏｔａｃａｇｃｇｔｇａａｃ
ｔｇｇｇａｅｇｃｇａｔｃｇｃｇｃａｇｔｇｃｇａｇｔｃｃｇｇｔｇｇａａａｃｔｇｇｔｃｇａｔｃａａｃａｃｃｇｇｔａａｃｇｇｔ
ｔａｃｔａｃｇｇｃｇｇｃｃｔｇｃｇｇｔｔｃａｃｃｇｃｃｇｇｃａｃｃｔｇｇｏｇｔｇｃｏａａｃｇｇｔｇｇｏｔｃｇｇｇｇｔｃｃ
ｇｏｇｇｃｏａａｃｇｃｇａｇｃｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇａｔｃｃｇｇｇｔｇｇｃｔｇａｐａｃｇｔｇｃｔｇｃｇｔｔｃｇｃａｇ
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２．４三种重组质粒在Ｅ．ｃｏｌｉ中的表达
图ｌ－４ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定诱导表达的三种重组蛋白
Ｆ喀１－４ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓ缸ｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓ
１－２：ＢＬ２１ｗｉｔｈｐＥＴ３２ａ（＋）－ＲｐｆＤ
３－４：ＢＬ２１ｗｉｔｈｐＥＴ３２ａ件Ｒｐ皿
５：ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ（ｆｒｏｍｕｐｔｏｄｏｗｎ）：９７．２ｋＤａ，６６．４ｋＤａ，４４．３ｋＤａ，
２９．０ｋＤａ，２０．１ｋＤａ，１４３ｋＤａ．
６／１０：ＢＬ２１
７：ＢＬ２１ｗｉｔｈｐＥＴ３２８（＋）
８－９：ＢＬ２１ｗｉｔｈｐＥＴ３２ａ（＋）－ＲｐｆＢ
ｐＥＴ３２ａ（＋）／ＲｐｆＢ、ｐＥＴ３２ａ（＋）／ＲｐｆＤ、ｐＥＴ３２ａ（＋）／ＲｐｆＥ在Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１中经ＩＰＴＧ诱导后，经ＳＤＳ．ＰＡＧＥ可见表达的新蛋白带，分别为６１．４ＫＤａ、４１．０ＫＤａ、３９．０ＫＤａ
（空载ｐＥＴ３２ａ（＋）的Ｔｒｘ约２２．０ＫＤａ），与预计分子量相符（见图１．４）。
其中以ＩＰＴＧ浓度为２ｍＭ，诱导４ｈ时的表达产物最多。
ＳＤＳ．ＰＡＧＥ胶经凝胶薄层扫描，测得重组ＲｐｆＢ、ＲｐｆＤ、Ｒｐｍ表达带的蛋白分别占菌体总蛋白量的３１％、２９％、２９－３％。
２．５重组蛋白表达形式分析
将诱导菌超声破碎后的上清液和沉淀同时进行ＳＤＳ．ＰＡＧＥ分析，可见三种重组蛋白在上清和沉淀中均有存在，都以沉淀中明显较多（如图１．５、１．６）。
说明这３种重组蛋白在Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１中同时以可溶形式和不可溶的包涵体形式表达，但都以不可溶的包涵体形式为主。
图１－５重组蛋白ＲｐｆＥ表达形式的分析
，毡・１－５ＡｎａｌｙｓｉｓｆｏｒｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎＲｐｆｌｇ
ｌ：ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ
２－３：ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｏｆｐＥＴ３２ａ…ｌｐ肥
４：ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｏｆｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｒｐｆｌｇ
２．６三种重组蛋白的免疫印迹分析
将３种重组蛋白分别与抗组氨酸的特异性单克隆抗体做免疫印迹，发现在６１．４ＫＤａ、４１．０ＫＤａ、３９．０ＫＤａ处各有一条特异性条带（图１．７）。
３０
图１石重组蛋白ＲｐｆＢ蛋白表达形式的分析
Ｆｉｇ．１－６ＡｎａｌｙｓｉｓｆｏｒｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎＲｐｆＢ
ｌ－４：ＢＬ２１ｗｉｔｈ
ｐＥＴ３２
ａ（＋）－ＲｐｍａｆｔｅｒＩＰＴＧｉｎｄｕｃｅｄ
５：ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ（ｆｒｏｍｕｐｔｏｄｏｗｎ）：９７．２ｋＤａ，６６．４ｋＤａ，４４．３ｋＤａ，２９．ＯｋＤａ．２０．１ｋＤａ．
６－８：ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｏｆｐＥＴ３２ａ（＋）－ＲｐｆＥ
９－１０：ｓｕｐｅｒｎｅｔａｎｔｏｆｐＥＴ３２ａ（＋）－ＲｐｆＥ
图１－７三种重组蛋白的Ｗｅｓｔｏｎ－ｂｌｏｔ鉴定
Ｆｉｇ．１．７Ｗｅｓｔｏｎ—ｂｌｏｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｔｈｒｅｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｌ：ＢＬ２１ｗｉｔｈｐＥＴ３２ａ（＋）－ＲｐｆＥ
２：ｐｒｏｔｅｉｎ
ｍａｒｋｅｒ
３：ＢＬ２１ｗｉｔｈｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｒｐｍ
４：Ｂ１２１ｗｉｔｈｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｒｐｍ２．７重组蛋白的纯化
从重组菌中制备的包涵体经洗涤溶解后，上到Ｎｉ－ＮＴＡ金属鳌合亲和层析柱中，洗脱下目的蛋白经１２％ＳＤＳ．ＰＡＧＥ证明了这种纯化方法的有效性（图１．８，１．９，１．１０），薄层扫描分析重组蛋白纯度均可达９０％以上。
将分步收集液中含目的蛋白的各管合并，缓慢逐步降低透析液中尿素的浓度，使变性的蛋白在此过程中自然复性，复性后的目的蛋白经冻干保存，备用。
图１－８ＲｐｆＢ蛋白纯化后的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
■豫．１－８ＳＤＳ－ＰＡＧＥｏｆｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄＲｐｍ
ｌ：ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ
２：ｗａｓｈｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎ
３－６：ｅｌｕｔｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅ１－Ｅ４１
图１－９ＲｐｆＤ蛋白纯化后的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
Ｆｉ蛋ｌ－９ＳＤＳ－ＰＡＧＥｏｆｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄＲｐｆｌ）
１－４：ｅｌｕｔｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅｌ－Ｅ４ｌ
ｍｒｋｅｒ
５：ｐｒｏｔｅｉｎ
６－７：ｓｏｌｕｔｉｏｎｗｉｔｈｏｕｔｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
图１－１０ＲｐｆＥ蛋白纯化后的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
Ｆｉｇ．１—１０ＳＤＳ－ＰＡＧＥｏｆｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄＲｐｆＥ
ｌ：ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ
２．４：ｅｌｕｔｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅ１一Ｅ３）
２．８重组蛋白的浓度测定
根据不同浓度梯度的标准品读取的籼９０值绘出标准曲线，再按照各蛋白的Ａ５９０值从标准曲线上获得相应浓度值，分别是：Ｒｐｍ０．６２ｍｇ／ｍｌ、Ｒｐ仍Ｏ．８１ｍｇ／ｍｌ、ＲｐｆＥＯ．９８ｍｇ／ｍｌ。
将３种重组蛋白均稀释至０．Ｓｍｇ／ｍｌ，－２０℃保存。
３讨论
Ｇｖｌｉｎａ等口２，２３１发现生长繁殖期的藤黄微球菌分泌的一种蛋白质能使处于休眠期的同类菌复苏并在培养基上形成菌落，它对正常生长的细菌也有效，由于它的功能类似于真核生物的生长因子，故称该蛋白质为“复苏促进因子”。
Ｍｔｂ有５个基因与藤黄微球菌Ｒｐｆ基因同源，推测这些基因编码的蛋白可能也具有促进细菌生长的作用，故将这些基因称为“ＭｔｂＲｐｆ家族”。
该家族的５个成员分别是：ＲｐｆＡ由１２２４个ｂｐ组成，基因座标记是Ｒｖ０８６７ｃ：ＲｐｆＢ由１０８９个ｂｐ组成，基因座标记是Ｒｖｌ００９；ＲｐｆＣ由５３１个ｂｐ组成，基因座标记是Ｒｖｌ８８４ｃ：ＲｐｆＤ由４６５个ｂｐ组成，基因座标记是Ｒｖ２３８９ｃ：ＲｐｆＥ由５１９个ｂｐ组成，基因座标记是Ｒｖ２４５０ｃ。
这５个基因分散在染色体上【柏】，虽然它们都有各自的特性，但保守序列有７０９６的同源性，提示保守序列编码的蛋白很可能与Ｒｐｆ的促复苏活性密切相关。
上述５个Ｒｐｆ基因成员分别编码的５个同源蛋白质是：ＲｐｆＡ蛋白、ＲｐｆＢ蛋白、ＲｐｆＣ蛋白、ＲｐｆＤ蛋白和ＲｐｆＥ蛋白，它们都由三个不同的区域
３３。