流式细胞仪分选
流式细胞仪细胞分选的操作步骤
细胞分选的简要操作步骤一、上样前的准备FACSCalibu可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。
1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。
3L 70%乙醇（用无菌蒸馏水配制）5L无菌蒸馏水5L无菌PBS2、在干净的鞘液筒中加入3L 70%乙醇。
盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗涤。
安好鞘液筒。
3、将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。
4、用70%乙醇冲洗收集管接口处，并喷洒进样口处的空气。
5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管（若不使用浓缩器）。
6、放上一支装有70 %乙醇的进样管。
7、设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。
9、从Acquire menu选择SortSetup。
在Sort Gate菜单中选择步骤7设定的分选门。
按液流控制键RUN。
10、在Setup 方框中打叉，点击Acquisition Control 菜单中Acquire。
11、跑乙醇直至2支收集管注满（每管注满需要9min ），点击Pause, Abort。
12、再重复上述步骤2次，共需要1h。
13、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入500mL无菌蒸馏水，振摇鞘液筒，倒掉液体，反复操作直至洗净桶内壁残余乙醇。
14、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水，盖紧盖子。
安好鞘液筒。
15、在收集管接口处安装2支新的收集管。
16、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。
17、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。
18、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause Abort。
19、再重复上述步骤2次，共需要1h。
20、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入3L无菌PBS盖紧盖子。
安好鞘液筒。
21、在收集管接口处安装2支新的收集管。
22、放上一支装有无菌PBS的进样管。
23、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。
流式细胞仪分选细胞的原理
流式细胞仪分选细胞的原理一、仪器原理流式细胞仪是一种利用流体动力学原理，结合光学和电子仪器技术，对细胞进行快速检测、分类和分选的仪器。
其主要原理是通过细胞在液体中的流动来实现对细胞的分选和分类。
二、流式细胞仪的组成流式细胞仪主要由液体系统、光学系统和电子系统三部分组成。
1.液体系统：液体系统包括进样系统、流动系统和废液系统。
进样系统负责将待检样品引入流动系统；流动系统则通过液体的流动将细胞送到光学系统进行检测；废液系统则负责将已经检测过的样品排出。
2.光学系统：光学系统由激光器、光学镜头、滤光片和光电倍增管等组成。
激光器产生的激光经过光学镜头聚焦后，照射到流动的细胞上，细胞反射、散射或荧光发射的光信号被光学镜头收集并通过滤光片进行过滤，最后由光电倍增管转化为电信号。
3.电子系统：电子系统主要由数据采集卡、计算机和控制软件组成。
数据采集卡负责将光电倍增管转换的电信号进行放大和数字化处理，然后传输给计算机；计算机通过控制软件对数据进行处理、分析和展示。
三、细胞的分选原理流式细胞仪的分选功能是通过细胞的特征参数来进行判断和分选的。
1.散射光信号分选：散射光信号是细胞受到激光照射后，由于细胞的大小、形状和内部结构的不同，产生的光信号。
通过检测散射光信号的强度和角度，可以判断细胞的大小和形态，从而实现对细胞的初步分选。
2.荧光信号分选：荧光信号是细胞在受到特定荧光染料激发后发射的光信号。
通过检测细胞的荧光强度和荧光颜色，可以判断细胞内特定荧光标记物的存在与否，从而实现对特定细胞类型的分选。
3.双参数联合分选：双参数联合分选是指根据细胞的两个或多个特征参数进行综合分析和判断。
比如可以根据细胞的大小和形状、荧光强度和颜色等参数进行综合判断，实现对多种细胞类型的准确分选。
四、应用领域流式细胞仪广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域。
1.生物医学研究：流式细胞仪可以对细胞的免疫表型、细胞周期、细胞凋亡等进行快速检测和分析，帮助科研人员深入了解细胞的生理和病理过程。
流式细胞仪细胞分选的操作步骤
流式细胞仪细胞分选的操作步骤细胞分选的简要操作步骤一、上样前的准备FACSCalibur可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。
1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。
●3L 70% 乙醇（用无菌蒸馏水配制）●5L 无菌蒸馏水●5L 无菌PBS2、在干净的鞘液筒中加入3L 70% 乙醇。
盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗涤。
安好鞘液筒。
3、将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。
4、用70%乙醇冲洗收集管接口处，并喷洒进样口处的空气。
5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管（若不使用浓缩器）。
6、放上一支装有70 % 乙醇的进样管。
7、设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。
9、从Acquire menu选择SortSetup 。
在Sort Gate菜单中选择步骤７设定的分选门。
按液流控制键RUN。
10、在Setup方框中打叉，点击Acquisition Control菜单中Acquire。
11、跑乙醇直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause，Abort。
12、再重复上述步骤2次，共需要1h。
13、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入500mL 无菌蒸馏水，振摇鞘液筒，倒掉液体，反复操作直至洗净桶内壁残余乙醇。
14、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水，盖紧盖子。
安好鞘液筒。
15、在收集管接口处安装2支新的收集管。
16、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。
17、点击Acquisition Control菜单中Acquire。
18、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause，Abort。
19、再重复上述步骤2次，共需要1h。
20、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入3L 无菌PBS，盖紧盖子。
安好鞘液筒。
21、在收集管接口处安装2支新的收集管。
22、放上一支装有无菌PBS的进样管。
流式细胞仪分选
1、膜表面抗原和胞浆内蛋白分析 2、DNA含量及细胞周期分析 3、定量分析 4、细胞功能分析 5、凋亡研究 6、细胞间相互左右 7、细胞分选
1.检测淋巴细胞亚群，监测细胞免疫状态 2.白血病/淋巴瘤免疫分型 3.HLA组织配型及HLA与某些疾病的关系 4.干祖细胞的定量及成分分析. 5.其它:粘附分子;TCR多态性检测;肿瘤癌基因及
抑癌基因蛋白产物的检测;细胞内酶;耐药蛋 白的分析等等。
临床应用
疾病诊断:为疾病诊断提供直接的或支持诊断的依据
免疫调节：细胞因子/受体的相互作用 共刺激分子受体/配体的相互作用
发病机理：肿瘤的发病与机体的免疫力低下、以及信号传递 障碍有关
药物/疫苗效果的评价：肿瘤生物治疗的时机选择、以及效果 的监测
导致特异性过敏反应，参 与高IgE综合症和嗜酸性粒 细胞增多症。
相应地，CD8+T细胞也可以分
为Tc1和Tc2
一定要确定T细胞是否T已h1经T活h化2检，细测胞T转ip运s阻滞是否成功，胞膜
打孔是否有效
一定要用胞浆内同型对照（特别是FITC 标记时），以便分别部分弱表达的细胞 因子。
TETRAMER
抗原递呈细胞（APC）携带抗原片段通过与TCR复合物结合，在APC和T细 胞的MHC相容和其它共刺激分子的相互作用下激活T细胞并产生细胞免疫效 应。MHC-四聚体染色技术用于抗原特异性T细胞分析的原理在于体外模仿上 述抗原递呈的过程来实现对特异性T细胞的鉴定，通过流式细胞仪这种高通 量分析仪器对标本中这群细胞进行分析
CD4CD25 Treg
调控性T细胞的主要功能是抑制机体免疫功能，太强则免疫 耐受，太弱会引起自身免疫反应
调控性T细胞调节抗原递呈细胞对抗原的递呈 调控性T细胞的表型是CD4+CD25bright，逐渐发现越来越
流式单细胞分选技术
流式单细胞分选技术流式单细胞分选技术是一种用于研究和分析单个细胞的高效方法。
它可以将细胞从复杂的混合样本中分离出来，并对其进行快速和准确的分类。
这项技术在生物医学研究和临床诊断中具有广泛的应用前景。
在过去的几十年中，随着单细胞研究的兴起，研究人员逐渐意识到细胞之间的差异可能比我们想象的要大得多。
传统的细胞分析方法通常是对大量细胞进行群体研究，而忽略了个体细胞的差异。
然而，每个细胞都是独特的，其功能和表型可能受到多种因素的影响。
因此，单细胞分选技术的出现填补了这一研究空白。
流式单细胞分选技术的基本原理是通过细胞悬浮液在流式细胞仪中以单个细胞的形式通过激光束。
根据细胞的特异性标记，如细胞表面标记物或荧光染料，流式细胞仪可以快速检测并分辨不同细胞类型。
根据检测到的信号，流式细胞仪可以将目标细胞捕获并分离出来，从而实现单细胞的分选。
流式单细胞分选技术的关键在于细胞的特异性标记。
常用的标记方法包括荧光染料标记、抗体标记、基因表达标记等。
通过选择适当的标记方法，研究人员可以根据需要选择特定类型的细胞进行分选。
这种技术不仅可以用于分离不同类型的细胞，还可以分离具有不同表型的同一类型的细胞，如肿瘤细胞中的不同亚群。
流式单细胞分选技术的应用广泛。
在生物医学研究中，它可以用于研究细胞的发育和功能，揭示细胞的多样性和异质性。
在肿瘤学研究中，它可以用于分离和分析肿瘤细胞亚群，帮助了解肿瘤的发生和发展机制。
此外，流式单细胞分选技术还可以应用于临床诊断，如癌症早期诊断和预测治疗效果。
尽管流式单细胞分选技术在细胞研究领域取得了巨大的进展，但仍面临一些挑战。
首先，细胞样本的准备和处理过程可能会影响到分选的结果。
其次，目前的流式细胞仪的分辨率和速度仍有限，无法满足大规模单细胞分选的需求。
此外，单细胞的高通量分选和分析需要更复杂的数据处理和分析方法。
总的来说，流式单细胞分选技术为研究人员提供了一种高效、准确和全面的分析单细胞的方法。
FACS分选在选择高效蛋白质表达细胞中的应用
FACS分选在选择高效蛋白质表达细胞中的应用在生物医学研究中，高效蛋白质表达细胞的选择对于蛋白质生产至关重要。
而流式细胞仪（FACS）分选成为一种有效的工具，通过分选、筛选和扩增细胞群体，能够快速、精确地筛选出高效、高产的蛋白质表达细胞。
本文将重点探讨FACS分选技术在选择高效蛋白质表达细胞中的应用。
1. FACS分选技术简介FACS分选技术是一种通过流式细胞仪进行细胞分选的技术。
它利用流式细胞仪的高速多参数检测能力，结合激光散射和荧光标记技术，对细胞进行高通量、高分辨率的筛选与分选。
通过调整仪器参数，可以根据荧光信号的不同强度，将目标细胞从混合细胞体系中精确地分选出来。
2. FACS分选在选择高效蛋白质表达细胞中的优势2.1 精准的筛选能力FACS分选技术能够根据荧光标记物的表达情况，对细胞进行排序和分选。
通过荧光标记的靶蛋白，可以精确地筛选出表达目标蛋白的细胞，实现高效蛋白质表达细胞的选择。
2.2 高通量操作FACS分选技术具备高通量的特点，可以同时分析和分选大量的细胞样本。
这大大提高了筛选效率和样本处理量，缩短了实验周期。
2.3 高分辨率的细胞分选FACS分选技术在筛选过程中可实时监测荧光信号的强度，通过调整阈值，可以将目标细胞从复杂的细胞混合物中分选出来。
这种高分辨率的细胞分选，保证了选择到的高效蛋白质表达细胞的纯度和准确性。
3. FACS分选在高效蛋白质表达细胞中的应用案例3.1 荧光标记的蛋白质表达载体通过将目标蛋白质与荧光标记融合，可以轻松地将表达目标蛋白的细胞选择出来。
FACS分选技术结合荧光标记物的表达情况，可以直接将高效蛋白质表达细胞选取出来，从而提高了蛋白质表达的效率和纯度。
3.2 利用荧光染料进行筛选除了标记蛋白质本身，还可以利用荧光染料来标记和筛选高效蛋白质表达细胞。
通过将染料与目标细胞特异性结合，可以将表达目标蛋白的细胞准确地筛选出来。
这种方法不仅具备灵活性，还可以适用于一些无法直接标记的蛋白质样本。
流式细胞分选步骤
流式细胞分选步骤
流式细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）是一种通过细胞表面标记物的荧光信号将细胞分离成单个克隆的分析技术。
以下是通常的流式细胞分选的步骤：
1. 细胞准备：将待分选的细胞进行培养和增殖，直到细胞数量足够用于分选。
此外，细胞也可以来源于个体的组织或血液。
细胞样本应该处于单细胞悬浮状态，以确保每个细胞的分选准确性。
2. 细胞标记：利用适当的荧光标记物标记细胞表面的特定分子或细胞内的组分。
常用的标记物包括荧光染料和荧光抗体。
这些标记物可以用来区分不同类型的细胞或细胞的亚群。
3. 流式细胞仪设置和样品加载：将细胞样品放置在流式细胞仪中。
根据所使用的流式细胞仪和实验条件，可以设置不同的参数，如激光功率、荧光信号检测通道和仪器的灵敏度。
4. 细胞分选：根据细胞表面标记物的荧光信号，通过流式细胞仪中的高压和细胞流速控制，将目标细胞从样品中逐个分选出来。
常见的分选方法包括电子静电排序（electrostatic-charge sorting），压控破裂排序（pressure-based sorting）和电压脉冲排序（voltage-pulse sorting）。
5. 细胞收获：被分选的细胞可以在培养皿中进行培养和进一步分析，或者可以直接用于其他实验或应用中。
6. 数据分析：将流式细胞仪生成的数据进行分析和解释，以获得有关每个分选细胞的详细信息，例如荧光信号的强度和细胞亚群的比例。
需要注意的是，流式细胞分选是一个高度专业化和技术性要求较高的实验技术，操作时需要严格控制污染和合理运用对比试剂以获得理想的结果。
流式分选 细胞 离心
流式分选细胞离心
流式分选是一种常用的细胞分离和分析技术。
它通过对细胞进行
物理性的离心处理，使细胞在受到离心力的作用下沉降或分散成不同
的亚群。
然后，使用流式细胞仪对这些亚群进行快速准确的检测和分选。
在流式分选过程中，首先需要将待分选的细胞样品进行离心处理，以获得单细胞的悬浮液。
然后，将悬浮液通过流式细胞仪的流动系统，使细胞以单个细胞的形式依次通过光源激发。
激发后，细胞会发射出
特定的荧光信号或散射光信号，这些信号会被流式细胞仪的光电探测
器捕捉并转化为电信号。
根据细胞的特定荧光信号或散射光信号的区别，可以将细胞分为
不同的亚群。
分选时，可以设置仪器中的分选装置，在细胞通过时根
据预先设定的参数进行分选。
分选后的细胞可以单独收集，用于进一
步的研究或应用。
总的来说，流式分选是一种高效、快速、准确的细胞分离和分析
技术，广泛应用于生命科学研究和临床诊断中。
通过这种技术，人们
能够对复杂的细胞群体进行深入研究，从而加深对细胞功能和生理过
程的理解。
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Normal Cell Cycle
G2 M
G1 G0
DNA Analysis
s
C o u n t
G0G1
s
0 200 400 600
G2 M
800 1000
4N 2N DNA content
1. 2. 3. 4.
肿瘤的早期诊断。 肿瘤的良恶性判断。 观察细胞的增殖状态及周期分布。 疗效监测
细胞功能分析
免疫状态评价： 移植、放化疗等.
DNA含量及细胞周期分析
细胞周期分析:在细胞周期(G0，G1，S， G2 ，M)的各个时期，DNA的含量随各时相呈现 出周期性的变化。通过核酸染料标记DNA，并 由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时 期的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M%。 了解细胞的周期分布及细胞的增殖活性。也可 利用细胞周期蛋白（CYCLIN）、Ki67、核增殖 抗原（PCNA）等，对细胞周期进行精确的分期： G0、G1、S、G2、M.
降低
降低
降低
CD4细胞绝对计数
对AIDS病人的诊断、疗效和预后有重要的指导意 义，一般认为CUTOFF值为200/ul. 绝对计数是加入浓度已知的标准微球与标本一起 测定，流式细胞仪控制软件在设置后能自动计算 出浓度 对任何细胞群体都可以进行绝对计数
Th1Th2细胞因子分泌细胞测定
T细胞分析
相对计数－淋巴细胞亚群数量检查项目和意义
疾病 自身免疫病 AIDS SARS 慢性活动性肝炎、 肝硬化 肿瘤 降低 降低 降低 CD3 CD4 降低 严重 降低 降低 降低 CD8 增高 增高 降低 正常 或 增高 增高 CD4/CD8 降低 降低 降低 降低 降低 降低 NK 降低
根据产生的细胞因子的类 型和生物学功能,人的ＣＤ4+Ｔ 细胞可以分为Ｔｈ1、Ｔｈ2 Ｔｈ1细胞产生ＩＬ 2、ＩＬ 12、ＩＦＮ γ、ＴＮＦ β等细 胞因子,主要参与细胞介导的免 疫反应、迟发性过敏反应,并在 清除病毒等细胞内致病因子方 面起着重要作用 Ｔｈ2细胞分泌ＩＬ 4、ＩＬ 5 、ＩＬ 6、ＩＬ 10、ＩＬ 13 等细胞因子,主要促进体液免疫 反应,中和胞外病原体 相应地，CD8+T细胞也可以分 为Tc1和Tc2
应用分类
1、膜表面抗原和胞浆内蛋白分析 2、DNA含量及细胞周期分析 3、定量分析 4、细胞功能分析 5、凋亡研究 6、细胞间相互左右 7、细胞分选
1.检测淋巴细胞亚群，监测细胞免疫状态
2.白血病/淋巴瘤免疫分型 3.HLA组织配型及HLA与某些疾病的关系
4.干祖细胞的定量及成分分析.
5.其它:粘附分子;TCR多态性检测;肿瘤癌基因及
抑癌基因蛋白产物的检测;细胞内酶;耐药蛋
白的分析等等。
临床应用
疾病诊断:为疾病诊断提供直接的或支持诊断的依据 免疫调节：细胞因子/受体的相互作用 共刺激分子受体/配体的相互作用 发病机理：肿瘤的发病与机体的免疫力低下、以及信号传递 障碍有关 药物/疫苗效果的评价：肿瘤生物治疗的时机选择、以及效果 的监测
Th1细胞：介导细胞免疫、细 胞毒性T细胞的生长和活化 、巨噬细胞的活化、介导 迟发型过敏反应。其功能 亢进将导致炎症慢性迁延 ，器官特异性自身免疫病 ，急性排异反应和接触性 皮炎等的发病和免疫病理 损伤。 Th2细胞 ：介导体液免疫，促 进B细胞的生长、活化和分 化，是IgG1和IgE类抗体的 转换因子，其功能亢进将 导致特异性过敏反应，参 与高IgE综合症和嗜酸性粒 细胞增多症。
Th1Th2检测Tips
一定要确定T细胞是否已经活化，细胞转运阻滞是否成功，胞 膜打孔是否有效
一定要用胞浆内同型对照（特别是FITC标记时） ，以便分别部分弱表达的细胞因子。
TETRAMER
抗原递呈细胞（APC）携带抗原片段通过与TCR复合物结合，在APC和T细 胞的MHC相容和其它共刺激分子的相互作用下激活T细胞并产生细胞免疫效 应。MHC-四聚体染色技术用于抗原特异性T细胞分析的原理在于体外模仿上 述抗原递呈的过程来实现对特异性T细胞的鉴定，通过流式细胞仪这种高通 量分析仪器对标本中这群细胞进行分析 四聚体技术的优势是：可以对特异性免疫细胞进行定量；用流式细胞仪检测 可以快速测定大量细胞，可以同时进行其它表面染色，可以直接用外周血测 定而不需要培养；四聚体染色不会杀伤细胞，因此染色后的细胞可以进行分 选或其它功能分析；四聚体对所有的特异性T细胞都能够结合，而不仅仅是 对有功能的细胞进行检测。
不同厂家的MHC四聚体产品不太一样：贝克曼库尔特公司创造性地 构建和表达了MHC分子α3链的区域突变的蛋白（iTAg），能降低其 与非特异性T细胞结合，大大提高了特异性。并且将MHC四聚体直接 标记荧光，和常用的抗原多肽负载后整体商品化，也有单独的MHC 分子（iTAg）单独出售，极大方便了研究者
CD4CD25 Treg
Байду номын сангаас
调控性T细胞的主要功能是抑制机体免疫功能，太强则免 疫耐受，太弱会引起自身免疫反应 调控性T细胞调节抗原递呈细胞对抗原的递呈 调控性T细胞的表型是CD4+CD25bright，逐渐发现越来 越多的其它分子可能能够更精确限定（eg.FOX-1?) CD25也是免疫细胞晚期活化的标记，但表达的平均荧光 强度不足够强
1.吞噬功能试验 2.氧爆发试验 3.根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同将CD4+或 CD8+分为介导细胞免疫的I型细胞和介导体液 免疫的II型细胞. 4.药物泵的功能检测 5.NK细胞的肿瘤杀伤活性检测 6.血小板的粘附,聚集功能检测
树突状细胞分析（Dendritic Cells,DC)
DC是主要的抗原递呈细胞，同时又是重要的先 天免疫细胞，还是具有免疫调控功能的一个细胞 群，没有发现特异性的抗原标记 DC研究的主要内容包括直接分析计数、体外诱 导检测,一般分为两群－PDC,MDC 当前DC检测的方法： 1）Lin-,CD11c,CD123,同时可能表达 CD80,CD86,CD83,DR等 2）利用BDCA1,2,3,4对外周血或其它组织DC进行 分析 3）CD14+16/CD85/CD33,CD14+16/CD85/CD123