流式细胞仪分选课件
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流式细胞仪ppt课件
DNA倍体
2N 2N 2N~4N 4N 4N
.
43
Normal Cell Cycle
M G2
G0
G1
s
C o u n t
DNA Analysis
G0G1
s G2M
0
200
400
600
800
1000
2N
4N
DNA content
.
44
.
45
DNA Analysis
300
225
150
Counts
75
.
18
3-D Histograms
.
19
免疫荧光分析
细胞表面的抗原(或细胞膜受体)与相关的 荧光抗体结合，形成带有荧光的抗原抗体复合 物。通过流式细胞仪测定其荧光量，即可得到 细胞群的不同抗原位点表达情况。
.
20
.
21
免疫荧光分析的意义：
流式细胞术与单克隆抗体结合，可对细 胞表面和细胞内抗原、癌基因蛋白及膜受体 进行定量检测，成为临床检验的一项重要指 标。流式免疫荧光技术不仅能将表达不同抗 原位点的细胞群区分开来，而且还能进一步 区分各细胞亚群。对于造血系统疾病、免疫 功能障碍及恶性肿瘤的诊断、治疗及预后评 估都起了重要作用。
.
3
FCM在生命科学中的应用,标志着细胞生物 学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞和分子水平 的研究。为从微观认识细胞及横向比较特征提 供了精密、准确的方法和仪器.
.
4
流式细胞仪的发展史
1930 年 Caspersson 和Thorell 开始致力于细胞的计数 1934 年 Moldaven 是世界上最早设想使细胞检测自动化的人他试图用光 电仪记录流过一根毛细管的细胞
流式细胞术实验技巧及数据分析ppt课件
FITC+T red
488
568
FITC+PeCy5 488
FITC+ ECD
488
F+P +PeCy5
488
F+ ECD +PeCy5 488
F+P +PeCy5 +APC 488
633
525 、575
绿色、橙色
525
绿色
615
红色
525、 675
绿色、 红色
525、 625
绿色、橙红色
525、575、675
17
流式细胞术操作流程：
培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋
单细胞悬液 制备
荧光抗体标记
上机检测
表型测定 细胞分选
统 计 学 分 析
FISH PCR
继 续 培 养
18
单 分 散 细 胞
19
FSC
FSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关
20
SSC
SSC信号的强弱与细胞内颗粒多少相关
21
细胞散色光信号
22
排除双联体细胞
27
细胞阻滞在G2M期
28
双 克 隆 细 胞 周 期 分 析
29
BrdUrd和DNA双标记染色
溴脱氧尿嘧啶核苷( Bromodeoxyuridine， BrdUrd )是胸苷的一种类似物。它可以替代
胸腺嘧啶掺入到细胞新合成的DNA分子中，成为S 期细胞的一种标记物。流式细胞术采用抗BrdUrd 单克隆抗体免疫荧光和PI双参数检测细胞，不仅 可检测一个细胞群体的动力学参数和DNA含量，同
层流是液体稳定流动的必要条件,管道中层流 的形成要满足雷诺数
流式细胞仪 ppt课件
ppt课件
9
常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途
颜色
FITC
488
525
免疫荧光 绿色
PE(RD1) 488
575
免疫荧光 橙色
ECD
488
620
免疫荧光 橙红
PeCy5 488
675
免疫荧光 红
PI
488
620
DNA染色 橙红
PECy7 488
755
免疫荧光 深红
ppt课件
7
流式细胞检测样本的制备： 细胞样本的处理： 组织样本的处理 流式细胞仪检测的信号： 散射光信号：前向角散射光（Forward scatter， FSC) 与细胞大小有关；侧向角散射(Side scatter ，SSC，又 称90°角散射光）与细胞精细结构和颗粒性质有关，对 胞膜、胞质、核膜变化更敏感。 荧光信号：特异性荧光信号是指将荧光素分子耦联到特 异性抗体或分子上，当其与细胞表面或者胞浆中的抗原 结合后，被特定波长激发光激发而产生的信号； 自发荧光：个别的细胞有着他们各自特异性水平的自发 荧光（荧光信号产生于他们自身）。
流式细胞仪 FLOWபைடு நூலகம்CYTOMETER
基本概念和原理
ppt课件
1
2003年推出世界上第一台单激光五色的流式细 胞仪FC500/MCL，2005年升级为FC500/MPL
Cytomics FC500
ppt课件
2
流式细胞术的基本概念
流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可 以快速、准确、客观，能够同时检测快速直线流 动状态中的单个细胞的多项物理及生物学特性， 加以分析定量的技术，并且可以对特定群体加以 分选。其中用到的流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术 、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆 抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。在国外 又把流式细胞仪称为荧光激活细胞分选器（ Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS），所 以目前大多数流式细胞仪机型都以FACS命名。
流式细胞术(免疫学检验课件)
Region设置 Gate设置
第四节 FCM的临床应用
一、淋巴细胞亚群分析
淋巴细胞是机体免疫系统中的一群重要细胞群， 是执行免疫功能和参与免疫调节的免疫活性细胞， 主要分为T细胞、B细胞和NK细胞3大类。
不同淋巴细胞表达的CD抗原都有独自的抗原特性， 在临床疾病发生过程中对各淋巴细胞的CD抗原进 行测定，对于判断机体免疫功能状态、了解免疫 相关疾病的发病机制具有十分重要的意义。
最常用的方法是酶消化法、机械法、化学处理法 和表面活性剂处理法等。
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备
该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应用范围， 有利于进行临床回顾性研究和利用。
常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡法和 甲氧-双氧水处理法。
石蜡切片一般适宜厚度是40μm~50μm，脱蜡须彻底， 获取组织后，用酶进行消化处理，消化时间不宜过 长，以免细胞核被消化溶解，经过滤、漂洗后即可 获得单细胞悬液。
三、三参数直方图
三维坐标均为参数 （散射光或荧光）而 非细胞数
对复杂的细胞亚群观 察更为直观、准确， 但对其数据的统计分 析较难
四、多参数组合分析
FCM常常需要分析三个以上的参数，但软件技术 能够无法显示四维空间结构。
随着FCM多色荧光信号检测的发展，所得到的荧 光信号和散射光信号需根据需要进行组合分析以 获得所需的信息。
SSC信号的强弱与 细胞内颗粒结构的 质量成正比，用于 检测细胞内部结构 属性
前向散射光示意图 细胞大小
结构复杂程度
侧向散射光示意图
血
液
白
细
胞
粒细胞
散
点
单核细胞
图
淋巴细胞
荧光信号：由待检细胞上标记的特异性荧光染料 受激光激发后产生。
流式细胞术PPT课件
电荷式分选
lasers
–超声振动器(15-100kHz)
–液流充电系统
–高压偏转板
–收集装置(流式管、培养板)
断裂点(充电) 高压偏转板
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四路分选原理
电荷式分选装置
30
分选指标
• 分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、 需要收集的细胞数。
需要细胞数
目标细胞所占比例(%)
1
5
50
104
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的 方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞 DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
• AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
• 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素； 各个通道之间的荧光素可以随意搭配。
FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
33
B 根据抗原表达强弱合理选择 抗体
• 不同的荧光素强度有所不同；
CD5
• 高表达的抗原可用不太“亮” 的染料，更“亮”的荧光素分 配给表达低的抗原：
99%以上。 • 分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。 • 分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率
降低，反之亦然。
– 富集模式(enrich mode) – 纯化模式(purify mode) – 单细胞模式(single cell mode)
流式细胞仪分析49页PPT文档
同的散射光。在入射光束与液柱垂直的方
向有荧光检测系统和散射光感受系统，用
于收集荧光信号和侧向散射光信号，前向
散射光感受器在前向小角探测接受前向光
信号。
2020/3/26
检验本科
7
被接收的光电信号被光电倍增管转换成电 压脉冲和积分脉冲，使信号放大，该信号 进入计算机系统进行数据转换、储存、分 析、处理，按不同的检测设计采用相应软 件程序对结果进行综合分析，并以图像和 数据显示于荧光屏上。
流式细胞仪产生分析的电信号主要是 光散射信号和荧光信号，流式细胞仪依据 细胞流经光照射区时电压讯号的强弱来分 析和分选细胞。（图5）（图10）
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检验本科
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二、散射光的测定
细胞对光的散射是细胞在未遭 受任何破坏情况下固有的特性。
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检验本科
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㈠ 前向散射光（FS）
由激光束前方的FS检测器收集，FS信 号的强弱与细胞的体积大小成正比，用于 检测细胞或其他粒子物质的表面属性。 （图11） （图6）
选择不同的单克隆抗体及荧 光染料就可以利用流式细胞仪同 时测定一个细胞上的多个不同特 征。
流式细胞仪的检测原理中最 重要的一点就是检测荧光的特定 发射波长。
2020/3/26
检验本科
13
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
㈠ 光信号测量
线性放大器用于测量信号强度变化范围 较少或代表生物学线性过程的信号。
对数放大器用于测量信号强度变化范围 大且光谱信号较复杂的信号。
（图13）
流式细胞仪中最常用于单抗标记的荧光 染料是FITC、PE、ECD或PeCy5。
2020/3/26
检验本科
14
㈡ 荧光补偿 （图8）
流式细胞术精品PPT课件
4
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选 的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧 光标记的。其特点是测量速度快，每秒 钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进 行多参数测量，另一特点是在分析的同 时可把具有指定特征的细胞分离出来， 这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选 的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧 光标记的。其特点是测量速度快，每秒 钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进 行多参数测量，另一特点是在分析的同 时可把具有指定特征的细胞分离出来， 这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可
流式细胞术原理及应用ppt课件
•横坐标：道数 •纵坐标：细胞数
•横坐标：某细胞参数 相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
整理版课件
15
细胞分选系统
• 电荷式分选 ✓超声振动器(15-100kHz) ✓液流充电系统 ✓高压偏转板 ✓收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
流式细胞术原理及应用
整理版课件
1
一、什么是流式细胞术？ 流式细胞仪的构造
二、怎样设计流式实验？ 三、流式实验中涉及到的关键步骤 四、常见流式细胞术应用
整理版课件
2
一、流式细胞术基本概念
• 流式细胞术（Flow Cytometry）是对于处在快速直 线流动中的细胞和生物颗粒进行多参数、快速的定量 分析和分选技术.
整理版课件
42
科研应用
在免疫学研究中的应用: • 鉴定免疫细胞类型 • 抗原特异性T细胞研究 • 细胞因子分泌细胞研究 • 全血细胞研究 • 凋亡检测 • 细胞增殖检测 • 干细胞向免疫细胞分化的研究 • 转染荧光蛋白细胞系研究 • 稀有细胞检测 • 。。。
在神经生物学研究中的应用： • 神经干细胞和神经祖细胞的特性
整理版课件
10
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
整理版课件
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
11
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
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抗原递呈细胞（APC）携带抗原片段通过与TCR复合物结合，在APC和T细胞的 MHC相容和其它共刺激分子的相互作用下激活T细胞并产生细胞免疫效应。 MHC-四聚体染色技术用于抗原特异性T细胞分析的原理在于体外模仿上述抗 原递呈的过程来实现对特异性T细胞的鉴定，通过流式细胞仪这种高通量分 析仪器对标本中这群细胞进行分析
相应地，CD8+T细胞也可以分 为Tc1和Tc2
Th1细胞：介导细胞免疫、细 胞毒性T细胞的生长和活化 、巨噬细胞的活化、介导 迟发型过敏反应。其功能 亢进将导致炎症慢性迁延 ，器官特异性自身免疫病 ，急性排异反应和接触性 皮炎等的发病和免疫病理 损伤。
Th2细胞 ：介导体液免疫，促 进B细胞的生长、活化和分 化，是IgG1和IgE类抗体的 转换因子，其功能亢进将 导致特异性过敏反应，参 与高IgE综合症和嗜酸性粒 细胞增多症。
对AIDS病人的诊断、疗效和预后有重要的指导意 义，一般认为CUTOFF值为200/ul.
绝对计数是加入浓度已知的标准微球与标本一起 测定，流式细胞仪控制软件在设置后能自动计算 出浓度
对任何细胞群体都可以进行绝对计数
Th1Th2细胞因子分泌细胞测定 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
1. 肿瘤的早期诊断。 2. 肿瘤的良恶性判断。 3. 观察细胞的增殖状态及周期分布。 4. 疗效监测
细胞功能分析 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
1.吞噬功能试验 2.氧爆发试验 3.根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同将CD4+或 CD8+分为介导细胞免疫的I型细胞和介导体液 免疫的II型细胞. 4.药物泵的功能检测 5.NK细胞的肿瘤杀伤活性检测 6.血小板的粘附,聚集功能检测
Th1Th2检测Tips 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
一定要确定T细胞是否已经活化，细胞转运阻滞是否成功，胞 膜打孔是否有效
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一定要用胞浆内同型对照（特别是FITC标记时） ，以便分别部分弱表达的细胞因子。
树突状细胞分析（Dendritic Cells,DC) 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
DC是主要的抗原递呈细胞，同时又是重要的先天 免疫细胞，还是具有免疫调控功能的一个细胞群 ，没有发现特异性的抗原标记
DC研究的主要内容包括直接分析计数、体外诱导 检测,一般分为两群－PDC,MDC
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Normal Cell Cycle
M G2
G0
G1
s
C o u n t
DNA Analysis
G0G1
s G2M
0
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2N
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DNA content
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相对计数－淋巴细胞亚群数量检查项目和意义
疾病
CD3 CD4 CD8 CD4/CD8
自身免疫病
降低 增高 降低
AIDS SARS
降低 降低
严重 降低
降低
增高 降低 降低 降低
慢性活动性肝炎、 肝硬化
肿瘤
降低
降低 降低
正常 降低 或 增高
增高 降低
NK 降低
降低 降低
降低Βιβλιοθήκη CD4细胞绝对计数 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
四聚体技术的优势是：可以对特异性免疫细胞进行定量；用流式细胞仪检测 可以快速测定大量细胞，可以同时进行其它表面染色，可以直接用外周血测 定而不需要培养；四聚体染色不会杀伤细胞，因此染色后的细胞可以进行分 选或其它功能分析；四聚体对所有的特异性T细胞都能够结合，而不仅仅是
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1.检测淋巴细胞亚群，监测细胞免疫状态 2.白血病/淋巴瘤免疫分型 3.HLA组织配型及HLA与某些疾病的关系 4.干祖细胞的定量及成分分析. 5.其它:粘附分子;TCR多态性检测;肿瘤癌基因及
抑癌基因蛋白产物的检测;细胞内酶;耐药蛋 白的分析等等。
根据产生的细胞因子的类
型和生物学功能,人的ＣＤ4+Ｔ
细胞可以分为Ｔｈ1、Ｔｈ2
Ｔｈ1细胞产生ＩＬ 2、ＩＬ 12 、ＩＦＮ γ、ＴＮＦ β等细胞因 子,主要参与细胞介导的免疫反 应、迟发性过敏反应,并在清除
病毒等细胞内致病因子方面起 着重要作用
Ｔｈ2细胞分泌ＩＬ 4、ＩＬ 5 、ＩＬ 6、ＩＬ 10、ＩＬ 13等 细胞因子,主要促进体液免疫反 应,中和胞外病原体
当前DC检测的方法： 1）Lin-,CD11c,CD123,同时可能表达
CD80,CD86,CD83,DR等 2）利用BDCA1,2,3,4对外周血或其它组织DC进行分
析 3）CD14+16/CD85/CD33,CD14+16/CD85/CD123
T细胞分析 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
免疫状态评价： 移植、放化疗等.
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DNA含量及细胞周期分析
细胞周期分析:在细胞周期(G0，G1，S， G2 ，M)的各个时期，DNA的含量随各时相 呈现出周期性的变化。通过核酸染料标记 DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到 细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%， S%及G2/M%。了解细胞的周期分布及细胞 的增殖活性。也可利用细胞周期蛋白 （CYCLIN）、Ki67、核增殖抗原（PCNA） 等，对细胞周期进行精确的分期：G0、G1、 S、G2、M.
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临床应用
疾病诊断:为疾病诊断提供直接的或支持诊断的依据
免疫调节：细胞因子/受体的相互作用 共刺激分子受体/配体的相互作用
发病机理：肿瘤的发病与机体的免疫力低下、以及信号传递 障碍有关
药物/疫苗效果的评价：肿瘤生物治疗的时机选择、以及效果 的监测