第四章 核酸操作基本技术
4 核酸操作的技术
离心分离法：超速离心、凝胶电泳
超速离心：
（a）速度区带离心：蔗糖。
沉降速度与样品质量、密度、离 心力大小、介质密度及样品与介 质的摩擦力有关。
（b）密度梯度离心:CsCl。
沉降速度与密度有关。 分辨率：0.02g/mL 蛋白质：1.3g/mL DNA： 1.6-1.7g/mL RNA： 1.75-1.85g/mL
4.1.2 微生物DNA的提取
质粒DNA提取
细菌DNA提取 病毒DNA提取
质粒DNA提取
细菌培养 碱裂解法、 煮沸法、 去污剂裂解法。
菌体收集 裂解
离心去除沉淀 酚氯仿抽提
异丙醇沉淀
细菌DNA的提取
细菌细胞
悬浮细菌 碱裂解或煮沸或去污剂 酚氯仿抽提 12000rpm离心
上层水相 乙醇沉淀
染色：EB
缓冲液：TAE、TBE
聚丙烯酰胺凝胶电泳
分辨率高：可分离相同长度碱 基组成不同的DNA片段；
需要样品量少：银染，可检测 少量样品；
回收DNA纯度高；
脉冲场凝胶电泳
分离超大DNA分子： 1-10Mb用于基因组构建。4.4 核酸的分子杂交
原理：A-T(U),G-C互补配对。 可形成DNA:DNA，DNA:RNA双链分子。 主要步骤： （1）核酸转移；
4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5 4.1.6
基本原理 微生物DNA的提取 动物细胞DNA的提取 植物细胞的提取 核外DNA的提取 RNA的提取
4.1.1 基本原理
步骤：
组织细胞破碎
去除杂质（蛋白、糖类）
去除其他杂质核酸
脱盐、获得纯品
化学试剂提取法：碱裂解法、煮沸法、有 机溶剂抽提法、去污剂法等
核酸技术的知识点总结
核酸技术的知识点总结一、核酸的结构和功能1. 核酸的结构核酸是生物体内储存遗传信息的重要化学物质，它主要分为DNA（脱氧核糖核酸）和RNA（核糖核酸）两种类型。
DNA是双螺旋结构，由磷酸、脱氧核糖和四种碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘌呤和胸腺嘧啶）组成；RNA是单链结构，由磷酸、核糖和四种碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘌呤和尿嘧啶）组成。
2. 核酸的功能(1) 存储遗传信息：DNA是细胞内存储遗传信息的主要分子，它携带了生物体遗传信息的全部内容。
(2) 遗传信息的复制：DNA在细胞分裂过程中能够通过复制和分裂，使得每个细胞都包含完整的遗传信息。
(3) 蛋白质的合成：RNA在蛋白质合成中起着重要作用，mRNA用来携带遗传信息，tRNA和rRNA参与蛋白质的合成过程。
二、核酸提取与纯化技术核酸提取是核酸技术的第一步，它是将细胞内的核酸从其他生物大分子（如蛋白质、多糖等）中分离出来的过程。
核酸提取技术的选择直接影响了后续核酸扩增和检测的结果。
常见的核酸提取与纯化技术包括酚氯仿法、硅胶柱纯化法、磁珠分离法等。
1. 酚氯仿法酚氯仿法是一种常见的核酸提取方法，它主要利用酚和氯仿的不同溶解度，将细胞内的核酸分离出来。
具体操作步骤包括：①细胞破碎：细胞颗粒蛋白破碎后，核酸被释放出来；②核酸的分离：将酚和氯仿混合液与细胞溶液混合，形成两相体系，核酸会在两相的交界面上沉淀下来。
2. 硅胶柱纯化法硅胶柱纯化法主要是利用硅胶柱上的硅氧基团与DNA分子之间的亲和性，将DNA固定在硅胶柱上，其他杂质则通过洗涤剂等去除。
操作步骤包括：①向硅胶柱中加入样品，DNA 被吸附在硅胶上；②洗涤过程：用洗涤液去除杂质；③最后用高温的TE缓冲液或水溶解DNA，使其从硅胶上释放出来。
3. 磁珠分离法磁珠分离法是近年来发展起来的一种核酸提取技术，它通过特制的磁珠与核酸上的亲和结合，来对核酸进行分离和纯化。
操作步骤包括：①向样本中加入磁珠，使其与核酸结合；②利用磁场将磁珠与核酸一起沉淀，然后去除上清液；③通过洗涤等步骤对核酸进行纯化。
第四章 核酸操作的基本原理
第一节 核酸的提取与纯化
制取核酸样品的根本要求是保持核酸 的完整性
防止核酸酶对核酸的降解、变性或破坏
一、DNA提取的基本原理与方法
（一）DNA提取的基本原理 DNA是极性化合物，溶于水不溶于乙醇、
氯仿等有机溶剂 DNA多以脱氧核蛋白（DNP)形式存在 提取DNA时用先将DNP抽提出来，在将DNA
在低电压(5v/cm)时, 迁移速率与电压成正比
5、嵌入染料
溴化乙啶使线状DNA迁移率降低15％。
6、 离子强度影响
pH 影响DNA分子所带的电荷 (TAE TBE)
二、琼脂糖变性胶电泳
未变性的RNA，电泳时与电泳迁移率没有严格的相 关性
在变性条件下电泳，才能使RNA移动距离与其相对 分子量对数成正比。
2. 琼脂糖凝胶电泳法
核酸分子是多聚阴离子, 在电场中向正电极 的方向迁移
在一的电场强度下，DNA分子的电泳迁移 率，取决于核酸分子本身的大小和构型。
原理： DNA与溴化乙锭（EB）形成
的络合物 在紫外光照射下能发 射荧光，荧光的强度与DNA的含 量成正比。
因此可十分敏感而方便地检 测出凝胶介质中 DNA 。
5.水抽提法
• 利用核酸溶解于水的性质, 用低盐溶液 除去RNA
• 此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一 般不用.
（三）核外 DNA 的提取
核外DNA包括： 质粒DNA
碱裂解法 煮沸法 去污剂裂解法
线粒体DNA 叶绿体DNA
先分离完整的 细胞器
提取纯化原理 与质粒DNA相同。
二、 RNA提取的基本原理与方法
紫外分光光度法 琼脂糖凝胶电泳法
1.紫外光度法原理： DNA或RNA分子在260 nm处有特异
核酸试剂操作方法
核酸试剂操作方法核酸试剂是用于提取、纯化和测定核酸分子的化学试剂。
核酸试剂的操作方法可以大致分为以下几个步骤：样品处理、溶解、纯化、测定等。
下面我将详细介绍每个步骤的操作方法。
1. 样品处理：在进行核酸提取前，首先需要对样品进行处理。
根据实验的目的和样品的性质，可以选择不同的样品处理方法。
比较常见的样品处理方法包括：细胞裂解、血浆或血清的凝固、骨髓抽提等。
在样品处理过程中要注意采用无菌操作，避免污染。
2. 溶解：将处理后的样品或沉淀加入适当的溶解液中，使核酸完全溶解。
常用的核酸溶解液包括：TE缓冲液、含EDTA的去离子水等。
在样品溶解时，需轻轻摇晃或轻轻慢搅拌，避免生成气泡。
3. 核酸纯化：核酸溶解后，需要进行纯化以去除与核酸有关的杂质，如蛋白质、盐类和酶等。
常用的核酸纯化方法有酚-氯仿法、硅胶柱法、离心柱法等。
不同的纯化方法适用于不同的样品类型和实验需求。
在纯化过程中，需要根据试剂的使用说明进行操作，以保证纯化效果。
4. 核酸测定：核酸纯化后，可以通过一系列测定手段来确定核酸的浓度和纯度。
测定核酸浓度和纯度的方法有：比色法、荧光法、紫外吸收法等。
在进行核酸测定时，需要根据试剂的使用说明和仪器的操作步骤进行操作，确保结果的准确性。
除了上述操作步骤外，核酸试剂的操作还需要注意以下几点：1. 实验室条件：进行核酸实验需要在洁净、无菌的实验环境下进行，避免外源性DNA和RNA的污染。
2. 消毒处理：实验前需要将操作台面、试剂瓶盖、离心管等实验器材进行消毒处理，以避免细菌、病毒的污染。
3. 无菌操作：在进行核酸提取和纯化操作时，需采用无菌技术，包括用纯化的试剂和器皿、带手套、使用滤芯枪头等。
4. 试剂保存：核酸试剂的保存条件需根据试剂的要求进行，常见的存储条件包括-20保存、避光保存等。
5. 操作技巧：在进行核酸试剂操作时，需熟悉试剂的用途和使用方法，并掌握相关实验技巧，以保证试剂的有效使用。
总之，核酸试剂的操作方法涉及样品处理、溶解、纯化和测定等步骤。
核酸检验基本技术
第六章第一节分子生物学基本知识一、DNA和RNADNA是脱氧核糖核酸的英文缩写。
DNA以核苷酸排列顺序形式储存遗传信息。
DNA分子由4种核苷酸组成，由碱基互补维持DNA双螺旋结构。
在动植物、细菌和真菌中都含有DNA，但在病毒中不一定含DNA。
DNA为长丝状分子相互纠缠，其溶液十分黏稠。
它对紫外线有最强的吸收，通常用260nm波长测DNA溶液浓度，它在近中性环境中带负电荷，DNA变性后OD值会升高。
因DNA不溶于乙醇，常用二倍量乙醇沉淀DNA。
在变性温度时，它的黏性突然降低。
淬火是为了保持DNA单恋状态。
DNA变性后溶液慢慢冷却，DNA会自动回复双螺旋结构。
RNA是核糖核酸的英文缩写，在大多数生物类型中，RNA起遗传信息传递作用并指导合成蛋白质，但在一部分病毒中，RNA也是遗传信息的保存者。
RNA分子中除了含有核糖而不是脱氧核糖外，凡DNA中出现胸腺嘧啶的地方都代之以尿嘧啶。
二、DNA的复制和修复细胞分裂一次，染色体DNA就合成一次。
DNA分子拆开成两条链，每一条单链按照碱基配对的原则合成另一条新的单链，成为半保留复制。
在合成DNA时限制性核酸内切酶不是合成DNA的必要条件。
DNA多聚酶只能结合在一长段DNA单链的一小段局部双链结构上，才能顺利开始DNA合成。
在DNA合成中单核苷酸分子必须顺序以共价链连接在已形成核酸链3?末端的羟基上。
在合成大声错误时，DNA多聚酶会切除错误核苷酸，在那个位置上重新加一个正确核苷酸。
在人工合成DNA时，至加一种或两种三磷酸单核苷酸，那么和成就会停止在缺失的核苷酸位置上。
在大肠菌DNA损伤修复时填补缺口最重要的酶是DNA聚合酶Ⅰ，而复制最主要的DNA聚合酶是DNA聚合酶Ⅱ。
该酶的核心聚合酶中，具有3?-5?外切酶活性。
DNA修复过程中尿嘧啶糖基酶系统不包括SⅠ核酸酶。
逆转录酶的RNAaseH活性是一般DNA聚合酶所不具备的。
三、转录在生物体内，DNA知道的RNA合成过程称为转录。
核酸检测的原理操作及应用
核酸检测的原理操作及应用1. 前言核酸检测是一种常见的生物学技术，用于检测和分析生物体中的核酸序列。
在医学领域中，核酸检测被广泛应用于疾病的诊断、基因突变分析和病毒检测等方面。
本文将介绍核酸检测的原理、操作步骤和一些常见的应用。
2. 原理核酸检测的原理主要基于DNA或RNA的特定序列的亲和性配对。
一般情况下，核酸检测的步骤包括样品处理、核酸提取、PCR扩增、电泳分析和数据解读等。
下面将详细介绍这些步骤。
2.1 样品处理在进行核酸检测之前，需要对样品进行处理。
这可以包括样品的采集、保存和预处理等步骤。
不同类型的样品可能需要不同的处理方法，例如血液、组织或体液等。
2.2 核酸提取核酸提取是核酸检测的关键步骤，它的目的是从样品中纯化出核酸。
常用的核酸提取方法包括酚-氯仿法、磁珠法和基质固相分离法等。
这些方法可以有效地去除样品中的蛋白质、RNA酶和其他杂质，得到纯净的核酸。
2.3 PCR扩增PCR扩增是核酸检测的核心步骤之一，它可以将目标核酸序列扩增成大量可检测的片段。
PCR扩增使用引物（primer）与目标序列互补结合，经过一系列的循环反应，产生大量的目标序列。
PCR扩增可以在短时间内实现目标序列的富集，从而提高检测的灵敏度。
2.4 电泳分析电泳分析是常用的核酸检测方法之一，它利用核酸在电场中的迁移速率差异来分离和测量核酸片段。
电泳分析可以根据核酸片段的大小和电荷量差异，将其分离成不同的带状图案。
这些图案可以通过染色或者标记物的荧光来可视化和定量分析。
2.5 数据解读数据解读是核酸检测的最后一步，它包括对电泳图像或荧光信号的分析和解释。
根据特定的核酸序列和信号强度，可以确定是否存在目标序列，并进一步分析核酸的数量和变异情况。
3. 应用核酸检测在医学和生物学领域具有广泛的应用。
以下列举了核酸检测的一些常见应用：•疾病诊断：核酸检测可以用于疾病的早期诊断，例如新型冠状病毒检测、艾滋病毒检测和乳腺癌基因突变检测等。
第四章核酸操作基本技术
1.
2.
重新纯化DNA，去除蛋 白、多糖、多酚等杂质 （具体方法见前）
重新沉淀DNA，让酒精 充分挥发 增加70％乙醇洗涤的次 数（2-3次）
对 策
2.
3.
3.
问题二：DNA降解。
原 因
1.
1.
2.
3.
4. 5.
材料不新鲜或反复冻 融 未很好抑制内源核酸 酶的活性 提取过程操作过于剧 烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融
CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三
甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核 酸形成复合物。
该复合物在高盐溶液中（> 0.7 mol/L NaCl）是可溶的，通过有
机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即 可使核酸分离出来。
• •
TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase
pH值为8.0，可防止DNA发生酸解
DNA提取常见问题
问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。
原 因
1.
DNA中含有蛋白、 多糖、多酚类杂质
DNA在溶解前，有 酒精残留，酒精抑 制后续酶解反应 DNA中残留有金属 离子
基因组DNA－其它方法
根据细胞裂解方式的不同有：
物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 生物方式：酶法
根据核酸分离纯化方式的不同有：
吸附材料结合法：
硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 特点：快捷高效。 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。
《基因工程B》复习提纲2020
第一章基因工程概述一、名词解释基因、基因操作、基因工程、重组DNA技术二、思考题1、简述基因工程操作的基本步骤。
2、简述基因工程操作的理论依据。
3、简述基因工程诞生理论上的三大发现和技术上的三大发明。
第二章基因工程的工具酶一、名词解释限制性内切酶、同裂酶、同尾酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶二、思考题1、简述限制性内切酶命名的基本原则。
2、影响限制性内切酶活性的因素主要有哪些？3、影响连接反应效率的因素主要有哪些？4、大肠杆菌DNA聚合酶有哪些活性？分别简要说明其主要用途。
5、简述切口平移法标记DNA的原理。
答：首先，在Mg2+存在下利用低限量的DNase I处理双链DNA，随机产生少量切口；然后，利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5'→3'外切酶活性在切口处向3'端平移去除核苷酸，同时，其5'→3'聚合酶活性则将切口作为引物沿5'→3'方向催化DNA合成；随着反应的进行，5'端核苷酸不断去除，3'端核苷酸不断掺入，导致切口沿着DNA合成方向移动，即切口平移。
如果在反应体系中加入标记dNTP，则这些标记dNTP将取代原有的核苷酸残基，产生带标记的DNA分子。
6、简述交换（置换）法标记DNA的原理。
答：反应体系中只有一种标记的dNTP存在时，可利用大肠杆菌DNA聚合酶I或T4/T7 DNA 聚合酶的3’→5’外切酶活性从3’端降解DNA，当露出与该标记dNTP互补的碱基时，上述酶的5'→3'聚合酶活性则催化该位置发生合成反应，用标记的dNTP置换原来的核苷酸残基，产生3’端标记的DNA。
第三章基因工程的载体一、名词解释载体、质粒、噬菌体、噬菌体溶菌周期、噬菌体溶原周期、克隆载体、表达载体、穿梭载体、整合载体、表达标签二、思考题1、简述克隆载体具备的基本条件。
2、以大肠杆菌为例，解释利用α互补筛选重组质粒的原理。
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❖ 4.1 凝胶电泳技术 ❖ 4.2 核酸的提取和纯化 ❖ 4.3 DNA测序技术 ❖ 4.4 PCR技术 ❖ 4.5 核酸分子杂交
4.1 凝胶电泳技术
4.1.1 凝胶电泳概述
1.定义：凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段、检测
扩增效果的常用技术方法。 ❖ 电泳：带电的胶体粒子或分子在电场作用下的定向
3.电泳的种类：
按有无固体支持物来分：没有固体支持物的称 为自由电泳（如：细胞电泳、柱电泳等）;常 用的有支持物的电泳有淀粉凝胶电泳、聚丙烯 酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳等。
4.1.2 琼脂糖凝胶电泳
应用： ① 测定DNA的分子量 ② 分离大小不同的DNA片段 ③ 进一步纯化DNA ④ 分离鉴定RNA
❖ 用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。
❖ 将DNA重新溶解于1ml TE, -20贮存。
纯化方法：
❖ 如果DNA中所含杂质多, 不能完全酶切, 或小分子 ❖DNA多, 会影响后续的分析和操作,Байду номын сангаас以用下列方法
纯化： （1）选用幼嫩组织，可减少淀粉类的含量。 （2）酚:氯仿抽提, 去除蛋白质和多糖。 （3）Sepharose柱过滤, 去除酚类、多糖和小分子DNA。 （4）CsCl梯度离心, 去除杂质, 分离大片段DNA(可用
与琼脂糖凝胶电泳比较？
4.2 核酸的提取和纯化
❖ 基本要求： ①保持核酸分子一级结构的完整性 ②去除杂质
4.2.1 基因组DNA的提取和纯化
及PCR分离基因等。 利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞 器或质粒等小分子DNA分离。
❖ 将DNA溶液3000rpm离心5分钟, 上清液倒入干净的5ml离心管。
❖ 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分钟, 除去RNA(RNA 对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。
❖ 加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃ 放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。
❖ 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮 团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解 于TE。
❖ 如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟, 再将沉淀 移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水 浴放置15分钟以上，以帮助溶解。
琼脂糖凝胶电泳中影响DNA迁移速度的因素：
（1） DNA的分子大小
（2）琼脂糖浓度 （3）DNA分子构象 （4）电源电压 （5）嵌入染料的存在 （6）离子强度影响
大，慢；小，快 高，慢；低，快 超螺旋≻环状≻线性 低？高？
4.1.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳
应用：①蛋白质的分纯化
㈠ 关键因素：抑制RNA酶的活性 ㈡ 两条途径： ①提取多聚核糖体，利用抗原抗体反应，得到mRNA ②提取总RNA ----> Oligo(dT)-纤维柱层析----> 将mRNA与,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行 RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上,可 保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所 扩增的片段(一般2kb以下)。
❖ （3）不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提 取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞 结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。
立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温 30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。 ❖ 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止 损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必 要时可重新混匀)。 ❖ 室温下5000rpm离心5分钟。 ❖ 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混 匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。
移动。 ❖ 迁移率：带电颗粒在一定电场中，单位时间内在一
定介质中的迁移距离。
2.原理：
❖ 通过电泳分离提纯生物大分子的基本原理：由于不 同生物大分子的带电性质不同，分子量大小也不一 样，在同一电场条件下，其移动方向和迁移率是不 同的，因而通过电泳就可把不同类型的生物大分子 分开。
❖ 核酸分子中由于含有离子态的磷酸基团而带负电荷， 当核酸分子放置在电场中时，它们会向正电极的方 向迁移。
提取方法：
❖ 核酸从cell中释放出来的方式：①研磨 ②超声波 ③ 匀浆 ④冻溶 ⑤溶菌酶
❖ 加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA 即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取 出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及 底部, 从而达到提取的目的。
注意事项：
❖ （1）在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的 片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如 尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的 DNA。
❖ 琼脂糖由红色海藻产物琼脂提取，将琼脂糖粉末加入TBE熔解 后冷却凝固即成凝胶
❖ 其分辨能力和浓度有关：浓度低，能够分辨大片段DNA；浓度 高，能够分辨小片段（几百bp）DNA。
❖ 通过EB染料染色DNA来检测凝胶中DNA谱带部位。 EB（溴化乙 锭）是一种扁平分子的嵌入性染料，能插入到DNA分子的相邻 碱基之间，并在300nm紫外线照射下发出荧光。
❖ （4）在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建 立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织 中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑 制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考 虑除去多糖和酚类物质。
提取步骤（以植物为例）
❖ 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。 ❖ 植物幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后