溶菌酶作用机理研究
溶菌酶
内容1：溶菌酶简介1.1 溶菌酶溶菌酶（N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，EC3.2.1.17）又称为胞壁质酶，是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶。
溶菌酶是由129个氨基酸构成的单纯碱性球蛋白，化学性质非常稳定。
溶菌酶存在在自然界中，溶菌酶普遍存在于鸟类、家禽的蛋清和哺乳动物的眼泪、唾液、血液、鼻涕、尿液、乳汁和组织细胞中(如肝、肾、淋巴组织、肠道等)。
从木瓜、芜青、大麦、无花果和卷心菜、萝卜等植物中也能分离出溶菌酶，其中以蛋清含量最高。
溶菌酶生理作用在生物体内溶菌酶具有抗菌消炎，抗病毒，增强机体免疫力的生理功能，还可激活血小板，改善组织局部血液循环障碍，分泌脓液，增强局部防卫功能，具有止血、消肿等作用。
它还可以作为一种宿主抵抗因子，对组织局部起保护作用2：溶菌酶的种类溶菌酶的研究最早是从尼科尔(Nicoile)1907年发表枯草杆菌溶解因子的报告开始的。
两年后，Laschtschenko指出：鸡卵白强烈抑菌作用是酶作用的结果。
1922年英国细菌学家弗莱明(Fleming)发现人的唾液、眼泪中存在这种能溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶。
1937年由Abraham与Robinson从卵蛋白中最先分离出晶体溶菌酶，此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在。
根据来源不同，将溶菌酶分为三类（1）动物源溶菌酶⏹动物源溶菌酶包括鸡蛋清溶菌酶及人和哺乳动物溶菌酶。
⏹鸡蛋清溶菌酶是目前研究和应用最多的，在鸡蛋清中约含有3.5%左右的酶，分子量为14000，其等电点在pH10.8左右，最适效应温度在50℃，化学性质稳定，pH在1.2～11.3之间改变时对酶结构影响很小，pH在4～7范围内100℃处理1min仍有近100%的活力，在210℃条件下加热1.5h仍具有活性。
鸡蛋清溶菌酶在碱性环境条件下稳定性较差，分解G+细菌，但对G-细菌不起作用。
研究表明其它鸟类蛋清溶菌酶也是由129个氨基酸残基组成，但其排列顺序和鸡蛋清溶菌酶不同，并且活性部位也不相同。
溶菌酶作用机理
溶菌酶，又称胞壁质酶，微生物细胞壁的 水解酶，是一种碱性蛋白质
分 子 量 为14338Da，由129个氨基酸残基组 成 单 一 肽 链 ，整个分子大小约为.5*3*3nm.
等电点为 10.7-11 分子内含 4对二硫键
常见分类
• 目前大多根据来源进 行分类，其中研究最多、最具代表 性的是c-型溶菌 酶，鸡蛋清中天然c一型溶菌酶含量最丰 富，c一型溶菌酶也存在于多种动 物的组织和分泌物中 。 g一型溶菌酶，无脊椎动物中有i一型溶菌酶，此外，还
构象的改变而改 变，与酶活性关系不大。
• 溶菌酶杀灭革兰氏阳性 菌，除水解肽聚糖 外，还对微生物相关结构进行识 别，其中 的特定结构诱导细菌产生自溶酶，以非酶
机制激发微生物产生自溶酶而杀菌，但此 机理有待 于进一步研究。
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其细胞壁几乎全部由 肽聚糖组成。
• 革兰氏阴性菌G-也有 一定程度溶解作用，
• 革兰氏阴性菌(G-)，如 其最有效浓度为0.05%。
大肠杆菌、变形杆菌、
痢肽聚糖。
• 因此，溶菌酶对于破 坏G+细菌的细胞壁较
G-细菌强。
• 催化过程的要点：（The Critical Elements of
外膜作用机制
• 人工合成的HLH多肽和C一端螺旋区 域能通过自身促进吸 收穿透外膜并用形成通道的 方式破坏内膜。
• HLH结构中的a一螺旋发夹抗菌多肽以自身促进吸收途径 穿透大肠杆菌外膜 。
• 作用机制是：抗菌肽分子中的多价阳离子与结合在脂多糖 表面的二价阳离 子发生交互作用，由于这些多肽与脂多 糖的亲和力 比原来结合在脂多糖上的Ca 和Mg 的亲和力
• 肽“尾”则是通过D-乳酰羧基连在NAM的 第3位碳原子上，肽尾之间通过肽“桥”(肽 键或少数几个氨基酸)连接，NAM、NAG、 肽“尾”与肽“桥”共同组成了肽聚糖的 多层网状结构，作为细胞壁的骨架。
溶菌酶作用机理
溶菌酶作用机理溶菌酶是一类能够溶解细菌细胞壁的酶，具有很强的杀菌作用。
它主要通过与细菌细胞壁的主要组成成分—大分子糖肽复合物的水解作用来发挥其作用。
溶菌酶作用机理主要包括结构选择性和酶活选择性两个方面。
首先，溶菌酶的作用是有结构选择性的。
细菌细胞壁是由大分子糖肽复合物组成的，其中主要包括聚肌醇糖、N-乙醯葡萄糖胺及葡萄糖醛酸等多种成分。
溶菌酶通过对细菌细胞壁的特定部位进行水解作用，导致细菌细胞壁的结构破坏而达到溶解的效果。
溶菌酶结合在细菌细胞壁的特定结构上，如肽聚糖链、肽交联环和醛酸共轭链等，形成溶菌酶-底物复合体。
然后，溶菌酶在底物分子的固定位点进一步降解底物链，从而破坏细菌细胞壁的完整性。
其次，溶菌酶的作用是有酶活选择性的。
溶菌酶在与细菌细胞壁特定结构结合形成复合体后，通过特定的底物结合位点和催化位点对底物进行水解。
溶菌酶能够选择性地加水分解β-1，4-糖肽键，使细菌细胞壁的肽聚糖链断裂。
另外，溶菌酶还可以选择性地水解膜少肽、β-1，6-糖肽键、肽交联环等，进一步破坏细菌细胞壁的完整性。
溶菌酶的这种酶活选择性是由其在底物特定结构上形成的氢键、静电作用、范德华力等多种相互作用力所决定的。
此外，溶菌酶除了直接对细菌细胞壁产生溶解作用外，还能够间接地增强机体的免疫能力。
溶菌酶在其水解过程中会产生一些抗菌肽，如β-defensin、LL-37等，这些抗菌肽具有直接抑制细菌生长的作用。
此外，溶菌酶还具有一定的免疫调节作用，能够增强机体的免疫应答能力，促进巨噬细胞吞噬和清除被破坏的细菌等。
总结起来，溶菌酶通过结构选择性和酶活选择性的作用机制，能够选择性地破坏细菌细胞壁的结构，达到溶解细菌的效果。
溶菌酶的这种抗菌作用在医药、食品等领域具有重要的应用价值。
溶菌酶作用机理
• 革兰氏阴性菌G-也有 一定程度溶解作用，
• 革兰氏阴性菌(G-)，如 其最有效浓度为0.05%。
大肠杆菌、变形杆菌、
痢疾杆菌、肺炎杆菌
等，细菌只有内壁层 为肽聚糖。
• 因此，溶菌酶对于破 坏G+细菌的细胞壁较
G-细菌强。
• 催化过程的要点：（The Critical Elements of
• Ibrahim等用梭菌蛋白酶水解蛋清溶菌 酶，发现 溶菌 酶的一个 螺旋一环一螺旋 基元结构域 为活性 位点，其中包括两个(一螺旋结构和 一个连接环)。
• 该区域对革兰氏阳性和阴性菌及真菌～白 色念珠菌均有杀菌活性。其中N一端螺旋对 革兰氏阳 性菌有特效，而C一端螺旋对革 兰氏阳性和阴性菌都 有效。
• 肽“尾”则是通过D-乳酰羧基连在NAM的 第3位碳原子上，肽尾之间通过肽“桥”(肽 键或少数几个氨基酸)连接，NAM、NAG、 肽“尾”与肽“桥”共同组成了肽聚糖的 多层网状结构，作为细胞壁的骨架。
底物简介
• 革兰氏阳性菌（G+）， • 该酶对革兰氏阳性菌
如藤黄微球菌、枯草
G+有分解作用。
杆菌或溶壁微球菌等，
• 有植物源溶菌酶和微生物源溶菌酶。而在病毒中发现的v 一型溶 菌酶具有转糖苷酶的性质，区别于其他种类的溶 菌酶。
• 虽然这些溶菌酶的氨基酸组成和排列不同， 但其活性中 心的活性位点非常保守，因此均具有水 解功能
作用部位（图示）
β- 1 , 4 糖苷键
底物简介
• 肽聚糖是细菌细胞壁的主要成份，它是由 N- 乙酰氨基葡糖乳酸NAM、N- 乙酰氨基葡 糖NAG和肽“尾”(一般是4个氨基酸)组成， NAM与NAG通过β-1.4糖苷键相连。
溶菌反应实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解溶菌反应的原理及其在微生物学中的应用。
2. 掌握溶菌酶、自溶酶等溶菌因子的检测方法。
3. 通过实验验证不同溶菌因子对细菌的溶菌效果。
二、实验原理溶菌反应是指微生物细胞壁或细胞膜被破坏，导致细胞内容物泄漏的过程。
溶菌反应在微生物学中具有重要意义，如细菌的分离、鉴定、疫苗制备等。
溶菌反应的原理主要包括以下几种：1. 溶菌酶作用：溶菌酶是一种水解酶，能特异性地水解细菌细胞壁肽聚糖结构，导致细胞壁破裂。
2. 自溶酶作用：自溶酶是一种内源性溶菌酶，在细菌生长过程中，细胞壁肽聚糖结构逐渐降解，导致细胞壁破裂。
3. 抗生素作用：抗生素可以抑制细菌细胞壁的合成，使细胞壁结构不完整，导致细胞内容物泄漏。
三、实验材料1. 菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。
2. 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、营养肉汤培养基等。
3. 试剂：溶菌酶、自溶酶、抗生素等。
4. 仪器：恒温培养箱、显微镜、离心机、移液枪、滴管等。
四、实验方法1. 细菌培养：将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基，37℃培养24小时。
2. 溶菌酶检测：取少量培养后的细菌，加入溶菌酶试剂，观察细菌溶解情况。
3. 自溶酶检测：将细菌培养液离心，取上清液，加入细菌悬液，观察细菌溶解情况。
4. 抗生素检测：将细菌培养液加入抗生素试剂，观察细菌溶解情况。
5. 溶菌效果比较：分别对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌进行溶菌实验，比较不同细菌的溶菌效果。
五、实验结果1. 溶菌酶检测：金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌在溶菌酶作用下溶解，大肠杆菌未溶解。
2. 自溶酶检测：金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌在自溶酶作用下溶解，大肠杆菌未溶解。
3. 抗生素检测：金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌在抗生素作用下溶解，大肠杆菌未溶解。
4. 溶菌效果比较：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌对溶菌酶、自溶酶和抗生素的敏感性较高，大肠杆菌敏感性较低。
溶菌酶作用机理范文
溶菌酶作用机理范文溶菌酶是一类具有杀菌作用的酶，能够溶解细菌细胞壁，其作用机制主要涉及溶菌酶的结构和功能特点、作用靶点以及作用方式等方面。
一、溶菌酶的结构和功能特点：溶菌酶是一种分泌性酶，在大多数情况下是由细菌自身产生。
它们通常由单个蛋白质分子组成，具有特定的序列和结构特点。
溶菌酶的结构特点主要包括以下几个方面：1.保守性序列：不同菌种的溶菌酶之间虽然存在差异，但在其中也存在着一些保守性序列，这些序列在不同种类的溶菌酶中具有相似性，从而保证了其基本的结构和功能特点。
2.催化三残基：溶菌酶催化活性通常由三个关键残基（谷氨酸、赖氨酸和组氨酸）共同参与，这三个氨基酸残基形成了一个三残基催化中心，通过其所具有的特殊催化能力，使溶菌酶能够将自身与细菌细胞壁结构适应并发挥杀菌作用。
3.结构域：溶菌酶通常由多个结构域组成，其中包括一个或多个结构特点的功能性结构域，以及辅助功能或调控作用的结构域。
这些结构域反应了溶菌酶与其靶标结合、识别和在其作用过程中发挥作用的机制。
溶菌酶具有针对靶菌种类的特异性，即只能清除特定种类的细菌。
这是因为溶菌酶对细菌细胞壁的作用是高度特异的，它们通过与细胞壁特定成分的结合来发挥杀菌作用。
二、溶菌酶的作用靶点：溶菌酶的作用靶点主要是细菌细胞壁。
细菌的细胞壁是由多层结构组成，包括脂质层、外膜、中壁和内膜等组分。
溶菌酶主要针对其中的一些关键成分进行作用，引起细胞壁的结构破坏。
细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖（peptidoglycan），也被称为靶菌特异性的靶标。
肽聚糖由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰穿醋酸葡萄糖组成，这两者通过肽链桥连接在一起。
溶菌酶通过酶催化作用可以将肽链桥切断，破坏肽聚糖的结构，导致细菌细胞壁的完整性丧失。
此外，溶菌酶对于其它一些细菌细胞壁成分的作用也起到了一定的作用，如脂质A、脂质B和脂质C等。
这些组分的破坏也会导致细菌细胞壁的结构受损。
三、溶菌酶的作用方式：溶菌酶主要通过两种方式发挥其杀菌作用：1.水解作用：溶菌酶通过水解肽聚糖骨架上的链接键，将细菌细胞壁中的肽链桥切断，导致细菌细胞壁结构的破坏。
DNA提取过程中所用试剂的机理
DNA提取过程中所用试剂的机理1.溶菌酶的作用机制是溶菌酶是一种碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰胺残基和芳香族氨，酸的比例较高，酶的活动中心是天冬氨酸和谷氨酸。
溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，称包胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，它专一地作用于肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键，从而破坏细菌的细胞壁，使之松驰而失去对细胞的保护作用，最终使细菌溶解死亡。
也可以直接破坏革兰氏阳性菌的细胞壁，而达到杀菌的作用，这主要是因为革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由胞壁质和磷酸质组成，其中胞壁质是由杂多糖和多肽组成的糖蛋白，这种多糖正是由N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键联结的。
对某些革兰氏阴性菌，如埃希氏大肠杆菌，伤寒沙门氏菌，也会受到溶菌酶的破坏。
溶菌酶是母乳中能保护婴儿免遭病毒感染的一种有效成分，它能通过消化道而保持其活性状态，溶菌酶还可以使婴儿肠道中大肠杆菌减少，促进双歧杆菌的增加，还可以促进蛋白质的消化吸收。
简言之,破坏细菌细胞壁，由于细菌在没有细胞壁时不能生存，从而杀死细菌。
2. 十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）常用于DNA提取过程中使蛋白质变性后与DNA分开。
SDS是分离DNA时常用的一种阴离子除垢剂，它有四个作用：a. 溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂；b. 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；c. 对RNase、Dnase有一定的抑制作用；d. SDS能够与蛋白质结合形成R1-O-SO3-…R2+-蛋白质复合物，使蛋白质变性沉淀。
质粒提取常见问题1．溶液I—溶菌液：a.溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。
当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。
b.葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
C. EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA 的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
溶菌酶的种类及其作用机理比较
溶菌酶的种类及其作用机理比较溶菌酶是一类能够降解细菌细胞壁的酶类物质。
细菌细胞壁由多糖和蛋白质构成，溶菌酶通过降解细菌细胞壁，破坏其结构，从而导致细菌死亡。
溶菌酶广泛存在于许多生物体中，包括动物、植物和细菌。
它们在生物体的免疫系统中起着重要的作用。
溶菌酶可以分为三个主要的种类：α-溶菌酶、β-溶菌酶和γ-溶菌酶。
1.α-溶菌酶：α-溶菌酶是一类分子量较小的溶菌酶，主要存在于许多动物和植物中。
它们通常具有特异性，并对特定的细菌具有溶菌活性。
α-溶菌酶通过切断细菌细胞壁中的Glycan链或Glycan链与肽链的连接来发挥其溶菌作用。
α-溶菌酶通常是单链的，具有一个或多个结构域。
该酶的活性通常受到酸碱环境和温度的影响。
2.β-溶菌酶：β-溶菌酶是一类较大的分子，主要存在于细菌体内。
它们与细菌的细胞壁相互作用，通过水解酶切和穿孔作用来破坏细菌细胞壁。
β-溶菌酶与细菌细胞壁中的N-乙酰葡聚糖、N-乙酰肽聚糖和D-半乳糖产生相互作用，从而诱发细菌细胞壁的溶解。
β-溶菌酶通常是多链的蛋白质，具有多个结构域，这些结构域通过各种方法相互作用来发挥其功能。
3.γ-溶菌酶：γ-溶菌酶主要存在于细菌中，与细菌细胞表面的多糖和脂质相互作用。
γ-溶菌酶作用于细菌细胞壁的多糖物质上，产生酶解作用。
γ-溶菌酶可以导致细菌细胞的胞内渗透性增加，导致细菌溶解。
与α-溶菌酶和β-溶菌酶不同，γ-溶菌酶通常是水溶性的，具有单链结构。
总体而言，溶菌酶的作用机理有一些相似之处。
它们通过与细菌细胞壁中的多糖和蛋白质相互作用，降解、切割或破坏细菌细胞壁的结构，从而导致细菌死亡。
然而，不同类型的溶菌酶可能具有不同的底物特异性和结构特征，因此它们在溶菌作用上可能有所不同。
此外，溶菌酶在医学和生物技术领域具有广泛的应用。
它们可以用于治疗细菌感染，尤其对于那些对抗常规抗生素产生耐药性的细菌。
此外，溶菌酶还可以用于细菌的检测和鉴定、食品安全和环境保护等领域。
溶菌酶作用机理
溶菌酶作用机理
溶菌酶是一种能够分解细菌细胞壁的酶类物质，它在生物体内具有重要的生理功能。
溶菌酶主要作用于革兰氏阳性菌和某些革兰氏阴性菌的细胞壁，可以使细胞壁发生裂解，从而导致细菌死亡。
溶菌酶的作用机理主要包括以下几个方面：
1.针对革兰氏阳性菌
对于革兰氏阳性菌来说，其细胞壁主要由多糖和肽聚糖组成。
溶菌酶能够针对肽聚糖进行水解反应，从而破坏了肽聚糖之间的交联结构，使得细胞壁发生裂解。
2.针对革兰氏阴性菌
对于革兰氏阴性菌来说，其外层膜主要由脂多糖组成。
溶菌酶能够通过与脂多糖结合，并且通过改变其空间构象来使得外层膜发生裂解。
3.与其他抗微生物物质协同作用
除了直接对细菌细胞壁进行分解外，溶菌酶还可以与其他抗微生物物
质协同作用，如抗生素、免疫球蛋白等。
这些物质能够增强溶菌酶的
杀菌效果，并且减少细菌对这些物质的耐药性。
4.参与免疫反应
溶菌酶也是人体免疫系统中的重要成分之一。
在机体受到感染时，溶
菌酶能够通过激活补体系统来参与免疫反应，并且能够引起炎症反应，从而促进机体对抗感染。
总之，溶菌酶是一种重要的抗微生物物质，在人体内具有多种生理功能。
其作用机理主要包括针对革兰氏阳性菌和阴性菌的不同分解方式、与其他抗微生物物质协同作用以及参与免疫反应等方面。
因此，在医
学和生命科学领域中，溶菌酶被广泛地应用于治疗感染性疾病和开发
新型药物等方面。
溶菌酶
二、白色链霉菌(S.albus). 最早是1936年Welsch首次分 离到的白色链霉菌(S.albus) G菌株.该菌株能产生十余种
作用于细胞壁的溶解酶。其中研究较多的有32酶和F1 酶，二者均属于N-O-二乙酰胞壁质酶。其他的还有MA 酰胺酶及SA、ML、MR内肽酶。
三、灰色链霉菌（S. griseus) 研究较多的有S-35菌株、
酶，用于制造和提取菌体内活性物质如核酸、酶及活性多肽等。 M1 、M2 ( EC 3. 2. 1. 17) 、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶 (种主EC要3.溶5菌.酶1.,并18且)都和已AM被3-纯内化肽至酶电是泳从纯变。溶M菌1 素可中用分来离作得为到细的菌四细 胞壁结构研究和从细菌细胞壁制备特殊种类的抗原、质粒DNA、天 然微生物蛋白和原生质体的有力工具。细菌细胞壁含有很多种生
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灰色链霉菌RX-17溶菌酶的研究
1
第一部分：溶菌酶简介
一、溶菌酶的发现
溶细菌酶（Bacteriolytic enzyme），又称细菌
细胞壁水解酶，专门作用于细菌细胞壁的骨架
物质—肽聚糖（peptidoglycan）。按对肽聚糖
作用位点的差异，溶菌酶可分为作用于聚糖链
的N-乙酰胞壁质酶（N-acetyl- muramidase）， 作用于肽桥的内肽酶（Endopeptidase）以及作 用于连接聚糖链与肽桥间酰胺键的N-乙酰-L-丙 氨酸酰胺酶（N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase
1.c型(chicken-type):鸡卵清溶菌酶 2.g型(goose-type):鹅卵清溶菌酶 3.t型(T4-type):T4噬菌体溶菌酶 4.Ch型(Chalarosis-type):
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裂解酶PlySs2裂解细菌的作用机理研究
1.实验目的
PlySs2是从猪链球菌（Streptococcus suis）噬菌体中分离到的一种裂解酶，对甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant streptococcus aureus,MRSA）、万古霉素中介耐药
金黄色葡萄球菌（V ancomycin-intermediate streptococcus aureus,VISA）、猪链球菌、李斯特
菌（Listeria）、模仿葡萄球菌（Streptococcus simulans）等细菌具有抑制活性，活性高，抗菌谱广[1, 2]。
研究发现，PlySs2由两个功能结构域构成，即催化结构域（Catalytic domain,CD,PlySc）和细胞壁结合结构域（Cell wall binding domain,CBD,PlySb）[1, 2]。
CBD结构域负责与细胞壁上相应基质结合，CD结构域侧催化相应的化学反应促使细胞壁上特定物质分解，从而破坏细胞壁结构并裂解细胞。
PlySs2的N端为半胱氨酸-组氨酸氨基水解酶（Cysteine-histidine amidohydrolase/peptidase，CHAP）催化结构域，C端为SH3 5型结合结构域。
CHAP结构域即具有丙氨酸酰胺酶活性，也具有肽桥内切酶活性[2]。
研究发现，只有完整的PlySs2才能
保持其较高的溶菌活性，PlySs2属于结合结构域PlySb依赖型，单独的催化结构域PlySc的溶解活性很小或者基本无活性[1]，说明PlySb对底物的识别十分重要。
PlySs2能识别多种菌的细胞壁并产生裂解活性，但是不同菌之间存在活性差异，这即体现了其广谱性，又体现了活性差异性。
相关报道表明，多数裂解酶与细菌细胞壁中肽聚糖的特定位点结合并破坏其结构，从而裂解细菌。
不同菌株之间细胞壁的组成成分具有差异，导致裂解酶存在活性差异[3]。
目前推测，PlySs2的结合位点在细胞壁肽聚糖上，并破坏其结构以裂解细菌。
本研究的目的是找到PlySs2与肽聚糖相互作用的结合位点，分析PlySs2裂解细菌的作用机理。
2.实验思路
根据实验室已有的方法诱导表达和纯化PlySs2，备用。
选择PlySs2裂解活性最高的金
黄色葡萄球菌作为实验菌，在最适条件下培养并获得菌体。
实验思路一：PlySs2直接与金黄色葡萄球菌相互作用。
在最适条件下孵育PlySs2和金黄色葡萄球菌的混合物，离心并收集上清液。
由于PlySs2与金黄色葡萄球菌细胞壁上某种物质相互结合并反应，可能存在PlySs2与底物结合在一起
的复合物，离心后收集上清液，其中可能存在少量该复合物，再采用非变性聚丙烯酰胺凝胶
电泳（Native-PAGE）检测分析。
若与空白对照比较有特异性条带出现，回收产物并分析其中的物质成分。
方法特点：简单易行，但可能上清液中PlySs2与底物结合的复合物含量较低，无法检测出来。
实验思路二：PlySs2与金黄色葡萄球菌细胞壁相互作用。
若实验思路一无法找到PlySs2的结合底物，则进一步提取金黄色葡萄球菌的细胞壁，直接让PlySs2与细胞壁反应，反应方式有两种：（1）在最适条件下孵育PlySs2和细胞壁的混合物，离心后收集上清液，采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）检测分析。
若与空白对照比较有特异性条带出现，回收产物并分析其中的物质成分；（2）找到合适的方法固定PlySs2，然后让固定化的PlySs2与细胞壁反应，分离出固定化的PlySs2与细胞壁成分结合的复合物，再从PlySs2上解离出结合底物，收集底物并鉴定。
方法特点：提高了PlySs2底物的浓度，减少了细胞内容物对结合反应的影响，但细胞壁提取过程中有可能破坏其天然结构，可能影响PlySs2与底物的结合，固定化PlySs2也有可能影响其结合位点的结合活性。
实验思路三：PlySs2与金黄色葡萄球菌细胞壁单一成分相互作用。
3.实验方法
3.1.PlySs2的诱导表达和纯化
PlySs2的诱导表达和纯化参考黄燕玲的毕业论文[4]。
3.2.金黄色葡萄球菌细胞壁的提取和纯化
采用超声波法提取细胞壁[5, 6]，具体操作步骤如下。
（1）菌体收集：在Baird-Parker培养基中培养金黄色葡萄球菌。
培养完毕后，迅速降温至4℃（冰浴），在4℃下3000 r/min离心20 min，收集菌体沉淀。
4℃蒸馏水
反复洗涤菌体至白色，收集菌体，置于100℃沸水中灭活20 min。
（2）超声波细胞破碎：条件为超声功率400 W、超声时间30 min、超声温度40℃。
（3）细胞壁收集：超声处理过的混合液在3000 r/min下离心20 min，去除未破碎的菌体沉淀，收集上清液，12000 r/min离心15 min，收集沉淀即为细胞壁。
3.3.PlySs2与细胞壁的结合实验
方法一：
4.实验材料
4.1.菌株和质粒
PlySs2表达菌株：E.coli BL21（DE3）/pET28a-PlySs2；活性测试菌株：Streptococcus aureus B30/B31。
均为本实验室保存。
4.2.试剂和耗材
4.3.培养基和溶液配制
4.4.仪器
5.实验预期结果
参考文献
[1] HUANG Y, YANG H, YU J,等. Molecular dissection of phage lysin PlySs2: integrity of the catalytic and cell wall binding domains is essential for its broad lytic activity [J]. Virologica Sinica, 2015, 30(1): 45-51.
[2] GILMER D B, SCHMITZ J E, EULER C W,等. Novel Bacteriophage Lysin with Broad Lytic Activity Protects against Mixed Infection by Streptococcus pyogenes and Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus [J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2013, 57(6): 2743-50.
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[4] 黄燕玲. 噬菌体裂解酶PlySs2细胞壁结合功能域的鉴定与应用研究[D]; 中国科学院大学, 2015.
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