细菌的人工培养
细菌的人工培养
人工培养细菌的意义
在医学中的应用：诊断；细菌鉴定；生物制品。 在工农业生产中的应用 ： 在基因工程中的应用
Stationary Phase
Logarithmic growth phase
Death Phase
Lag Phase
细菌在培养基中生长现象
固体培养基：菌落colony
平板接种
巧
克
杂菌污染
力
平
板
鉴别及选择培养基
EMB琼脂平板上大肠菌 SS琼脂平板上大肠菌为
菌落具有金属光泽
粉红菌落
Control organisms : Escherichia coli : Pink colonies (lactose fermentation) Proteus mirabilis : Colorless colonies ,no spreading Enterococcus sp. : No growth
Control organisms : Escherichia coli : A/A (G) Shigella flexneri : K/A Proteus vugaris : K/A, H2S Pseudomonas aeruginosa : K/N
Incubate : Aerobic 35° C, 24 hrs Shelf life : 8 weeks Price (Baht) : 5 (return tube)
Lowenstein-Jensen Medium
微生物试验-细菌的人工培养及形态学检查
实验一 细菌的人工培养
一、细菌在自然界的分布
1.空气中细菌的检查：每班两个血平板，标记 方法：在室内选择一处放一个平皿，揭开皿盖，
暴露放置10min，即盖上皿盖，放入37℃温箱 培养24小时，观察结果。
2.人体表面细菌的检查---手 指（每组1个平皿）
方法：取一普通平皿培养 基，一部分标记“前”， 另一部分标记“后”，然 后将手指在标记“前”的 部分沾一下，洗手后在标 记“后”的部分沾一下。 放入37℃温箱培养24h后 观察细菌的生长情况。
呼吸道咽部常驻菌群种类较多，正常人咽部需氧菌 中，甲型链球菌检出率最高，其次是奈瑟球菌属和表 皮葡萄球菌。
二、 理化因素对细菌的影响
1.物理因素对细菌的影响---紫外线
原理：紫外线主要作用于 DNA，使一条DNA链上相邻 的两个胸腺嘧啶以共价键结合成二聚体，从而干扰 DNA 的复制与转录导致细菌变异或死亡。
3.人体内部细菌的检查--咽喉部
方法：用“咳碟法”进行检查，取一个血琼脂平 皿培养基，打开平皿盖，置于口腔前约 10cm， 对着平皿咳嗽几次，标记时间，姓名，然后放 入37℃温箱培养24h后观察菌落特征。
二、外界因素对细菌的影响：
1.物理因素对细菌的影响 ：
紫外线：全班两份普通平板：一组大肠杆菌， 一组葡萄球菌，比较紫外线对G+，G-的抑制作 用。
满足a充足的营无菌
（三）分类：1、按物理性状
分类：
+0.3~0.5%琼脂
+1.5~2.5%琼脂
半固体培养基 液体培养基
固体培养基
观察细菌动力 大量繁殖细菌 细菌的分离和纯化
短期保存菌种
固体平板培养基
液体培养基
固体斜面培养基 半固体培养基
实验细菌的人工培养
常用消毒器械的介绍
一、人工培养基的制备和种类
1.制备原则 2.制备程序 3.常用培养基的分类
1.制备原则
（1）适当的营养成分； （2）合适的酸碱度； （3）配制后经灭菌使之无菌，方可应用。
2.制备程序
配料→熔化→测定及矫正PH→滤过 →分装→灭菌→备用
3.常用培养基的分类
（一）按物理性状分：
生化反应——Indol实验
靛基质试验：分别接种（大3肠）埃希半菌和固伤体寒沙培门菌养于基蛋白：胨水沿培穿养基刺（含线色生氨酸长）内，，穿置37刺度2线4小清时培晰养后，，周然后沿管壁徐徐加入靛基
质试剂（对二甲基醛）数滴，静置片刻，在两液界面出现红色环者为靛基质试验阳性（大肠埃希菌），无红色环者为阴性（伤寒沙门
菌 （）2）。固体培养基：菌落和菌苔。围培养基仍为透明，动力阴性；穿刺线向周围扩 观穿察刺菌 线落向的周大围小扩、散形生态长、，透穿明刺度线、模散颜糊色，生、整长表个面培，和养边基穿缘变刺情成况混线及浊菌，模落动糊周力围阳，有性无。整溶个血环培等。养基变成混浊，动 力阳性。 （2）细菌对氨基酸分解产物观察
2.细菌的代谢产物观察
（1）细菌对糖分解产物观察
方法：将大肠埃希菌和伤寒沙门菌分别接种于葡萄糖、乳糖发酵 培养基中，置37度24小时培养后观察结果。
结果：大肠埃希菌分解葡萄糖、乳糖，产酸产气；
伤寒沙门菌分解葡萄糖产酸不产气，不分解乳糖。
糖 发 酵 试 验
2.细菌的代谢产物观察
（2）固体•培养基：菌落（和菌2苔）。 细菌对氨基酸分解产物观察
液体培养基 固体培养基: 1.5～2.5% 琼脂 半固体培养基: 0.3～0.5%琼脂
（二）按用途不同可分：
基础培养基； 营养培养基； 选择培养基； 鉴别培养基； 厌氧培养基。
细菌的人工培养方法
细菌的人工培养方法[适用对象]生物工程专业[实验学时] 4学时一、实验目的了解常用的液体、固体和半固体培养基的成分、制备方法和用途。
初步掌握各种培养基接种技术；观察细菌在培养基中的生长现象；认识菌落、菌苔。
二、实验原理培养基是用人工方法将微生物生长繁殖所需的多种营养物质调配在一起，形成的一种营养物质的混合物，用以分离、传代和培养细菌。
按培养基的用途分为基础（普通）培养基、营养培养基、鉴别培养基，选择培养基、厌氧培养基等。
按培养基的物理形状又分为液体、固体和半固体三种。
三、仪器设备三角烧瓶、天平、试管、平皿、高压消毒灭菌器。
四、相关知识点培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。
在自然界，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究目的不同，所以培养基的种类很多。
但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、无机盐、生长因子等。
不同的微生物在固体、半固体和液体培养基中能表现出各自特有的培养特征，这些特征可以作为不同种类微生物的鉴别特征之一。
了解它们的培养特征、掌握其生长规律对识别、控制和利用微生物具有重要价值。
五、实验步骤（一）常用培养基的制备1、普通液体培养基(1)将新鲜的精牛肉除去脂肪和筋膜制成肉馅，取500克牛肉馅加l000ml蒸馏水，置4℃冰箱浸泡过夜，使牛肉中的水溶性营养物质充分浸出。
(2)次日将浸泡过夜的牛肉馅加热煮沸30分钟，放凉，使残余的脂肪凝固，然后用纱布和滤纸过滤，最后将滤液补足为原量，此种液体为牛肉浸汁。
(3)取1 000ml牛肉浸汁加蛋白胨10克，氯化钠5克加热溶解，冷至50℃左右时用氢氧化钠调整pH至7．6，再煮沸10分钟(因牛肉浸汁中部分碳水化合物，经加热破坏产酸，影响pH；产生多磷酸盐，培养基不澄清)待冷却后，再调整pH至7．6，然后以滤纸过滤，滤液必须澄清，此种液体称为肉汤培养基。
(4)将肉汤培养基分装于试管或三角烧瓶中，塞好试管和瓶塞，包装好后，用15磅(121℃)蒸气15～30分钟灭菌。
人工培养细菌
细菌的人工培养人工制备营养充足的培养基并提供适宜的温度、气体、pH等培养条件，即能使细菌在体外环境迅速生长繁殖。
细菌培养对临床上病原菌的分离鉴定、制备抗生素、制备疫苗等生物制品都是必不可少的。
一、培养基的制备原则：1、必须有充足的营养。
2、合适的酸碱度。
3、绝对无菌。
二、培养基的制备培养基是用人工方法将多种营养物质按照各类微生物生长的需要而合成的一种混合营养料。
常用的培养基有基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培养基、厌氧培养基等。
按照培养基的物理性状可分为液体，固体和半固体三类。
以下介绍常用基础培养基的制备。
（一）肉汤培养基：制法：称取营养肉汤粉1.8g（含牛肉膏0.3克g，蛋白胨1g、氯化钠0.5g）加入100ml蒸馏水中，用玻棒搅拌加热溶解。
按需要分装于三角瓶或试管，瓶口或管口塞棉塞，包装后置高压蒸汽灭菌器内，在0.11Mpa（1.05公斤/厘米2）压力下，温度达1210C，维持15～20分钟。
冷却后贴好标签，40C冰箱贮存备用。
制成后的肉汤呈浅黄色，清晰透明，pH 7.1+0.2肉汤培养基常用于增菌培养。
（二）肉汤琼脂固体培养基：在上述肉汤培养基中加入2～3%琼脂即成。
经高压灭菌后，趁热将试管斜置、冷凝，即成普通琼脂斜面培养基；或趁热取出后，稍冷，以无菌操作倾入灭菌的空培养皿，冷凝后即为普通琼脂平板。
制作琼脂平板时，每一空皿（9厘米直径）需培养基15～20ml。
普通琼脂平板用于分离培养繁殖细菌；普通琼脂斜面用于纯培养和保存菌种。
（琼脂是从石花菜等海藻类中提取的多糖物质，当温度达到98℃以上可溶化，45℃以下则凝固。
琼脂对细菌一般无营养作用，用做斜面、平板、高层等不同类型固体培养基的凝固剂。
琼脂通常呈酸性，加入液体培养基中可使酸碱度下降pH 0.2左右。
）（三）肉汤琼脂半固体培养基：在上述肉汤培养基中加入0.3～0.5％琼脂，加热溶化后，分装于小试管（10×100mm），每管约3ml，高压灭菌后直立冷凝即成。
5.第二章 细菌的生物学特性,第五节细菌的人工培养
一、培养细菌的方法
分离培养
将标本或培养物划线接种在固体培养基的表面，因划线的分散作用 ，使许多原混杂的细菌在固体培养基表面上散开，称为分离培养。
菌落
一般经过18~24小时培养后,单个细菌分裂繁殖成一堆肉眼可见的 细菌集团，称为菌落。
二、培养基
固体培养基：菌落，菌苔
二、培养基
液体培养基
半固体培养基
三、细菌在培养基中的生长现象
（一）在液体培养基中生长情况 混浊：大多数细菌 沉淀：链状生长的细菌 菌膜：专性需氧菌，如结核杆菌、枯草杆菌
三、细菌在培养基中的生长现象
（三）在半固体培养基中生长情况
通过分离培养，细菌可在固体培养 基上形成菌落。不同细菌大小、形 状、颜色、气味有助于鉴定细菌。 细菌的菌落一般分为：光滑性菌落、 粗糙性菌落和黏液性菌落。
纯培养
挑取一个菌落，移种到另一个培养基中，可生长出来的大量的纯种 细菌，称为纯培养。多用于某些菌种的扩増。
二、培养基
培养基：是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混 合营养物础培养基 增菌培养基 选择培养基 鉴别培养基 厌氧培养基
按其物理状态
液体培养基 固体培养基 半固体培养基
在工农业生产中的应用 在基因工程中的应用
本章小结
培养细菌的方法：分离培养，纯培养 培养基要求：营养物质、pH、渗透压、温度、气体 培养基的分类：营养组成和用途、物理状态 细菌培养用途：医学、工农业、基因工程
细菌的生物学特性
学习 目标
掌握 培养基的要求，菌落的概念，培养基的分类 熟悉 细菌在培养基中的生长情况 了解 人工培养细菌的用途
第五节
实验二细菌的接种、培养及代谢产物
实验二细菌的接种、培养及代谢产物（B a c t e r i a l I n o c u l e t i o n a n d A r t i f i c a l C u l t u r e a n dM e t a b o i c p r o d u c t s）一、细菌的人工培养（A r t i f i c a l C u l t u r e o f B a c t e r i a）在适当条件下，绝大多数细菌可用人工方法培养，使其繁殖，通过人工培养，获得纯种细菌，是进一步观察研究各种细菌具有不同特性的基础。
(一)常用培养基的制备1、肉汤培养基：是常用的液体培养基，也是制备某些其他培养基的基础。
材料：（制备100m l肉汤培养基的用量）(1)培养基的成分：牛肉50g蛋白脂1g氯化钠0.5g磷酸氢二钾(K2H P04·12H20)0.1g蒸馏水100m1(2)玻皿、试剂、比色管、比色架、吸管、1N与1／20N 的N a O H、三角烧瓶、漏斗、中试管、酚红指示剂、滤纸、卷筒、天平、蒸馏水。
方法：（1）将已去筋膜脂肪并经绞碎鲜牛肉50g，加蒸馏水100m l，放入冰箱中过夜。
（2）加热45—50℃一小时，并煮沸半小时，用数层纱布或滤纸过滤，滤液用蒸馏水补足其量为100m1。
（3）于滤液中加氯化钠0.5g，蛋白脂1g、磷酸氢二钾0.1g，加热使之完全溶化。
（4）测定酸碱度并调整至P H7.6，必要时用滤纸过滤。
（5）按需要分装于试管或烧瓶内，加棉花塞并包装后，置高压蒸汽灭菌器内经15磅／寸220—30分钟灭菌。
（6）灭菌后置37℃温箱，孵育24h，无杂菌生长，即可应用。
或放冰箱备用。
2、普通琼脂培养基它是最常用的固体培养基。
材料：肉汤、琼脂方法：(1)在肉汤中加入2％琼脂，熔化后调整P H7.6，必要时用棉花纱布过滤。
(2)于琼脂凝固前，分装于试管或小烧瓶内，然后加棉塞并包装。
(3)放入高压蒸汽灭菌器内，经15磅/寸220分钟灭菌。
细菌的人工培养
任何培养基都应该具备微生物生长所需要六大营养要素：
碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水
任何培养基一旦配成，必须立即进行灭菌处理；
常规高压蒸汽灭菌： 1.05kg/cm2,121.3℃15-30分钟；0.56kg/cm2,112.6℃15-30分钟
培养基制备的一般程序
调配
培养基灭菌
★ 基础培养基：121℃高压蒸汽灭菌15分钟
溶化
矫正pH
★ 含糖培养基：113 ℃灭菌15分钟 过滤澄清 ★ 鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌3天3次 分装 灭菌 检定 ★ 不耐高温的液体成分：滤过除菌
保存
1、选用和设计培养基的原则和方法
目的明确 营养协调 理化条件适宜
经济节约
1）目的明确
根据不同的微生物的营养要求配制针对强的培养基。
培养化能自养型的氧化硫杆菌的培养基组成为： S 10g MgSO4.7H2O 0.5g NH4)2SO4 0.4g CaCl2 0.25g H2O 1000ml FeSO4 0.01g H2PO4 4g
液体培养基
不加任何凝固剂
大规模工业生产及在实验室进行微生物的 基础理论和应用方面的研究
含有一般微生物生长繁殖所 需的基本营养物质的培养基 按 用 途 不 同 划 分 基础培养基
在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的 一类营养丰富的培养基。特殊营养物质包括血 液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等 在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质， 用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体 抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物 中分离出来的培养基 的生长
4）经济节约
以粗代精
以氮代朊
以野代家
以废代好 以简代繁
以纤代糖
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大肠杆菌在不同培 养基上形成的菌落
畜禽疫病防治 第1章 疫病的病原 第一节 细菌
细菌在固体培养基中的生长情况
菌落（R型）
固体培养基中 菌落（S型）
菌苔
细菌在固体培养基中的生长情况
光滑型菌落
粗糙型菌落
粘液型菌落
液体 培养基
斜面 培养基
纯培养 (pure culture)
菌落(colony)
三、人工培养细菌的意义
畜禽疫病防治 第1章 疫病的病原 第一节 细菌
（一）病料的采集、保存及运送
采集原则
无菌采病料 适时采病料 病料中病原含量多 采集适量病料：至少 检测量的4倍 低温保存 尽快送检 做好记录
（二）细菌的形态检查
1.病料处理
将病料涂成薄而均匀的涂片→室温下自然干
燥→若为细菌培养物涂片火焰固定 常用的染色方法有：革兰染色法、美蓝染色 法、瑞氏染色法和姬姆萨染色法
OH二乙酰 + 含胍基 化合物
（—）
（ +）
红色（+）
3、甲基红(methyl
red)试验：
葡萄糖
丙酮酸 （pH值>5.4） 甲酸、乙酸（红色）
（pH<4.5）
（—）
（+）
（五）动物接种试验
意义
为了证实所分离 菌是否有致病性 本动物
脑内接种
试验动物
静脉注射 腹腔注射
2. 毒素
来源：细菌生长繁殖中产生和释放的毒性 成分
作用：可直接或间接损伤宿主细胞、组织
和器官，干扰其生理功能
种类：外毒素和内毒素
接种途径
畜禽疫病防治 第1章 疫病的病原 第一节 细菌
一、致病性与毒力
致病性与毒力的概念
致病性：是指病原微生物引 起动物机体发生疾病的能力 毒力：病原微生物致病力的 强弱程度称为毒力
改变毒力的方法
增强毒力的方法
连续通过易感动物可增强微生物毒
力
减弱毒力的方法
长时间在体外连续培养传代、在高
加入0.3%～0.5%琼脂
加入2%～3%琼脂
半固体培养基
液体培养基
固体培养基
（二）按营养基用途分
基础培养基
营养培养基 鉴别培养基 选择培养基
普通培养基
血液培养基
5、 厌氧培养基：
专供厌氧菌的分离、培养和鉴别用. 将普 通培养基放在无氧环境中培养，或者使 培养基本身成为无氧的环境。
蛋白质类分解试验
硫化氢试验、靛基质试验等
其他类型试验
枸橼酸盐利用试验、触酶试验、尿素 酶试验等
畜禽疫病防治 第1章 疫病的病原 第一节 细菌
1、糖酵解试验：
气泡
— + +
不发酵
产酸不产气 产酸又产气
糖发酵试验
发酵 产酸 +
细菌
分解
糖
发酵 产酸产气
+
不发酵
2、VP试验：
葡萄糖
丙酮酸
乙酰甲基甲醇
不 同 种 沙 门 氏 菌 的 生 化 鉴 定
鸡伤寒沙门氏菌
鼠伤寒沙门氏菌
细菌的生化试验
1.糖分解试验 2.维-培试验 3.甲基红试验 4.枸橼酸盐利用试验 5.吲哚试验 6.硫化氢试验 7.触媒试验 8.氧化酶试验 9.脲酶试验
常见生化试验类型
糖类分解试验
糖发酵试验、甲基红试验、V-P试验 等
于最适生长温度条件下培养和连续 通过非易感动物等方法可减弱微生 物毒力
二、细菌的致病性
病原菌致病力的强弱 毒力 侵袭力
毒素
1. 侵袭力： 是指病原细菌突破宿主皮肤、黏膜等防御
屏障，进入机体定居、繁殖和扩散的能力 黏附与定植
侵入
繁殖与扩散能力
干扰或逃避宿主的防御机制
（1）黏附与定植
黏附：是指病原微生物附着在敏感细胞 的表面，以利于其定植、繁殖。在黏附 的基础上，才能获得侵入的机会。 黏附结构：细菌的菌毛等
（2）侵入
侵入：是指病原菌主动侵入吞噬细胞或非 吞噬细胞的过程 侵入方法：是通过侵袭蛋白来实现的
（3）繁殖与扩散能力
繁殖：细菌在宿主体内的增殖速度对致病性极为 重要 扩散：通过一些侵袭性酶类实现的 ，如透明质酸 酶、胶原酶等
（4）干扰或逃避宿主的防御机制
机制：是因为具有抵抗吞噬及杀菌物质作用的 表面结构荚膜等
（三）细菌的分离培养
意义
看培养基中有无细菌生长推断是否为细菌病 依据菌落的特征判断细菌种类 用菌落中的细菌进一步作形态学鉴定 可进一步作生化鉴定、血清学鉴定及动物试 验 可进一步作药敏试验
畜禽疫病防治 第1章 疫病的病原 第一节 细菌
鸡白痢沙门氏菌
（四）细菌的生化试验
检验时，根据可疑 细菌的生化特性选 择特定的一组生化 试验，将结果与标 准进行对比，以确 定病原菌的种类
有鞭毛的细菌可 沿穿刺线呈羽毛状 或云雾状混浊生长
无鞭毛细菌则 只能沿穿刺线呈 明显的线状生长 半固体培养基
畜禽疫病防治 第1章 疫病的病原 第一节 细菌
2、细菌在半固体培养基 中的生长现象
有鞭毛的细菌，沿 穿剌线呈模糊羽毛 状生长。 无鞭毛的细菌，沿 穿剌线呈清晰的线 状生长。
细菌在固体培养基中的生长
（一）在医学中的应用
1 疾病的诊断和治疗 2 细菌的鉴定和研究 3 生物制品的制备 4 细菌毒力分析及细菌学指标的 检测
（二）在其他方面的应用 1 在工农业生产中的应用 2 在基因工程中的应用
五、细菌病的一般诊断程序
（一）病料的采集、保存及运送 （二）细菌的形态检查 （三）细菌的分离培养 （四）细菌的生化试验 （五）动物接种试验
(三)按照培养基的成分来分
1. 合成培养基
2. 天然培养基
3. 半合成培养基
三、制备培养基的要求
含有丰富的营养物质
均质透明，易于观察。 具有适当的pH值和水分。 不含抑菌物质和杂菌
经过灭菌和无菌检验
四、细菌在液体培养基中生长
沉 淀 生 长
混 浊 生 长
表 面 生 长
细菌在半固体培养基中生长
细菌的人工培养
细菌的人工培养定义： 提供细菌生长繁殖所 需要的条件，可进行 细菌的人工培养
一、培养基的概念
把细菌生长繁殖所需要的各种营养 物质合理地配合在一起，制成的营 养基质称为培养基。
二、培养基的类型及用途
（一）按物理状态分：
液体培养基：用于扩增纯培养的细 菌 半固体培养基：检查细菌运动性, 0.3 % -0.5%琼脂 固体培养基：细菌分离、纯化、鉴 定、药敏试验等, 2%~3%琼脂
2.显微镜检查
染色水洗后的涂片标本→吸水纸吸干(切勿 磨擦)或 在酒精灯火焰的远端烘干→滴加香柏油→用油 浸镜观 察细菌的形态结构和染色特性。 形态检查的意义
观察病料中有无细菌以及细菌的形态、数量、 分布、结构、种类等，进行初步判断
畜禽疫病防治 第1章 疫病的病原 第一节 细菌
（三）细菌的分离培养
通常选用适合目标菌生 长的平板培养基对细菌 进行分离培养 细菌菌落的形状、大小、 色泽、气味、透明度、 黏稠度、边缘结构和有 无溶血现象等，均因细 菌的种类不同而异，根 据菌落的这些特征，即 可初步确定细菌的种类
不同细菌的菌落大小、形态、色泽、 表面特征、边缘状态、隆起度、透 明度等特征不同
有的细菌在鲜血培养基上有β-溶血现象