细菌的人工培养
细菌的人工培养方法及意义(平板划线)
固体斜面培养基接种
液体培养基接种
细菌的人工培养
三、细菌生长结果观察
固体琼脂平板上
菌落 菌苔
EMB琼脂平板上大肠菌 SS琼脂平板上大肠
菌落具有金属光泽
杆菌为粉红菌落
➢半固体培养基观察细菌动力
无运动性 有运动性
表面生长 混浊生长 沉淀生长
➢液体培养基上生长现象
复习思考题：
1、培养基按用途分有哪些种类？麦糠凯琼 脂、SS琼脂分别属于哪类?分别用于那些菌 的分离培养？
•
9、一个人即使已登上顶峰，也仍要自 强不息 。上午 9时9分 46秒上 午9时9 分09:0 9:4620. 12.11
• 10、你要做多大的事情，就该承受多大的压力。12/11/
2020 9:09:46 AM09:09:462020/12/11
• 11、自己要先看得起自己，别人才会看得起你。12/11/
剂。
细菌的人工培养
一、培养基 二、细菌接种技术 三、细菌生长结果观察
细菌的人工培养
一、培养基
概念: 培养基是用人工方法将多种营养物质按 照各类微生物生长的需要而合成的一种混合养料。
任何培养基都应该具备微生物生长所需要六大 营养要素：
碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水
任何培养基一旦配成，必须立即进行灭菌处理
（2）右手拿接种 环，在火焰上烧灼 灭菌，特别是箍处。
（3）火焰边取下 两个棉塞，不能放 下；烧灼管口一周。
（4）将接种环伸 入试管内，冷却后， 轻轻挑取少量菌体， 立即将接种环抽出。
（5）火焰旁将沾有 菌种的接种环迅速伸 到斜面培养基的底部， 由里向外画蛇形细线， 线要画得细些。
（6）抽出接种环后， 烧管口，塞棉塞，接 种环灭菌。
细菌的人工培养
大肠杆菌在不同培 养基上形成的菌落
畜禽疫病防治 第1章 疫病的病原 第一节 细菌
细菌在固体培养基中的生长情况
菌落（R型）
固体培养基中 菌落（S型）
菌苔
细菌在固体培养基中的生长情况
光滑型菌落
粗糙型菌落
粘液型菌落
液体 培养基
斜面 培养基
纯培养 (pure culture)
菌落(colony)
三、人工培养细菌的意义
畜禽疫病防治 第1章 疫病的病原 第一节 细菌
（一）病料的采集、保存及运送
采集原则
无菌采病料 适时采病料 病料中病原含量多 采集适量病料：至少 检测量的4倍 低温保存 尽快送检 做好记录
（二）细菌的形态检查
1.病料处理
将病料涂成薄而均匀的涂片→室温下自然干
燥→若为细菌培养物涂片火焰固定 常用的染色方法有：革兰染色法、美蓝染色 法、瑞氏染色法和姬姆萨染色法
OH二乙酰 + 含胍基 化合物
（—）
（ +）
红色（+）
3、甲基红(methyl
red)试验：
葡萄糖
丙酮酸 （pH值>5.4） 甲酸、乙酸（红色）
（pH<4.5）
（—）
（+）
（五）动物接种试验
意义
为了证实所分离 菌是否有致病性 本动物
脑内接种
试验动物
静脉注射 腹腔注射
2. 毒素
来源：细菌生长繁殖中产生和释放的毒性 成分
作用：可直接或间接损伤宿主细胞、组织
和器官，干扰其生理功能
种类：外毒素和内毒素
接种途径
畜禽疫病防治 第1章 疫病的病原 第一节 细菌
一、致病性与毒力
人工培养细菌
细菌的人工培养人工制备营养充足的培养基并提供适宜的温度、气体、pH等培养条件，即能使细菌在体外环境迅速生长繁殖。
细菌培养对临床上病原菌的分离鉴定、制备抗生素、制备疫苗等生物制品都是必不可少的。
一、培养基的制备原则：1、必须有充足的营养。
2、合适的酸碱度。
3、绝对无菌。
二、培养基的制备培养基是用人工方法将多种营养物质按照各类微生物生长的需要而合成的一种混合营养料。
常用的培养基有基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培养基、厌氧培养基等。
按照培养基的物理性状可分为液体，固体和半固体三类。
以下介绍常用基础培养基的制备。
（一）肉汤培养基：制法：称取营养肉汤粉1.8g（含牛肉膏0.3克g，蛋白胨1g、氯化钠0.5g）加入100ml蒸馏水中，用玻棒搅拌加热溶解。
按需要分装于三角瓶或试管，瓶口或管口塞棉塞，包装后置高压蒸汽灭菌器内，在0.11Mpa（1.05公斤/厘米2）压力下，温度达1210C，维持15～20分钟。
冷却后贴好标签，40C冰箱贮存备用。
制成后的肉汤呈浅黄色，清晰透明，pH 7.1+0.2肉汤培养基常用于增菌培养。
（二）肉汤琼脂固体培养基：在上述肉汤培养基中加入2～3%琼脂即成。
经高压灭菌后，趁热将试管斜置、冷凝，即成普通琼脂斜面培养基；或趁热取出后，稍冷，以无菌操作倾入灭菌的空培养皿，冷凝后即为普通琼脂平板。
制作琼脂平板时，每一空皿（9厘米直径）需培养基15～20ml。
普通琼脂平板用于分离培养繁殖细菌；普通琼脂斜面用于纯培养和保存菌种。
（琼脂是从石花菜等海藻类中提取的多糖物质，当温度达到98℃以上可溶化，45℃以下则凝固。
琼脂对细菌一般无营养作用，用做斜面、平板、高层等不同类型固体培养基的凝固剂。
琼脂通常呈酸性，加入液体培养基中可使酸碱度下降pH 0.2左右。
）（三）肉汤琼脂半固体培养基：在上述肉汤培养基中加入0.3～0.5％琼脂，加热溶化后，分装于小试管（10×100mm），每管约3ml，高压灭菌后直立冷凝即成。
5.第二章 细菌的生物学特性,第五节细菌的人工培养
一、培养细菌的方法
分离培养
将标本或培养物划线接种在固体培养基的表面，因划线的分散作用 ，使许多原混杂的细菌在固体培养基表面上散开，称为分离培养。
菌落
一般经过18~24小时培养后,单个细菌分裂繁殖成一堆肉眼可见的 细菌集团，称为菌落。
二、培养基
固体培养基：菌落，菌苔
二、培养基
液体培养基
半固体培养基
三、细菌在培养基中的生长现象
（一）在液体培养基中生长情况 混浊：大多数细菌 沉淀：链状生长的细菌 菌膜：专性需氧菌，如结核杆菌、枯草杆菌
三、细菌在培养基中的生长现象
（三）在半固体培养基中生长情况
通过分离培养，细菌可在固体培养 基上形成菌落。不同细菌大小、形 状、颜色、气味有助于鉴定细菌。 细菌的菌落一般分为：光滑性菌落、 粗糙性菌落和黏液性菌落。
纯培养
挑取一个菌落，移种到另一个培养基中，可生长出来的大量的纯种 细菌，称为纯培养。多用于某些菌种的扩増。
二、培养基
培养基：是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混 合营养物础培养基 增菌培养基 选择培养基 鉴别培养基 厌氧培养基
按其物理状态
液体培养基 固体培养基 半固体培养基
在工农业生产中的应用 在基因工程中的应用
本章小结
培养细菌的方法：分离培养，纯培养 培养基要求：营养物质、pH、渗透压、温度、气体 培养基的分类：营养组成和用途、物理状态 细菌培养用途：医学、工农业、基因工程
细菌的生物学特性
学习 目标
掌握 培养基的要求，菌落的概念，培养基的分类 熟悉 细菌在培养基中的生长情况 了解 人工培养细菌的用途
第五节
实验二细菌的接种、培养及代谢产物
实验二细菌的接种、培养及代谢产物（B a c t e r i a l I n o c u l e t i o n a n d A r t i f i c a l C u l t u r e a n dM e t a b o i c p r o d u c t s）一、细菌的人工培养（A r t i f i c a l C u l t u r e o f B a c t e r i a）在适当条件下，绝大多数细菌可用人工方法培养，使其繁殖，通过人工培养，获得纯种细菌，是进一步观察研究各种细菌具有不同特性的基础。
(一)常用培养基的制备1、肉汤培养基：是常用的液体培养基，也是制备某些其他培养基的基础。
材料：（制备100m l肉汤培养基的用量）(1)培养基的成分：牛肉50g蛋白脂1g氯化钠0.5g磷酸氢二钾(K2H P04·12H20)0.1g蒸馏水100m1(2)玻皿、试剂、比色管、比色架、吸管、1N与1／20N 的N a O H、三角烧瓶、漏斗、中试管、酚红指示剂、滤纸、卷筒、天平、蒸馏水。
方法：（1）将已去筋膜脂肪并经绞碎鲜牛肉50g，加蒸馏水100m l，放入冰箱中过夜。
（2）加热45—50℃一小时，并煮沸半小时，用数层纱布或滤纸过滤，滤液用蒸馏水补足其量为100m1。
（3）于滤液中加氯化钠0.5g，蛋白脂1g、磷酸氢二钾0.1g，加热使之完全溶化。
（4）测定酸碱度并调整至P H7.6，必要时用滤纸过滤。
（5）按需要分装于试管或烧瓶内，加棉花塞并包装后，置高压蒸汽灭菌器内经15磅／寸220—30分钟灭菌。
（6）灭菌后置37℃温箱，孵育24h，无杂菌生长，即可应用。
或放冰箱备用。
2、普通琼脂培养基它是最常用的固体培养基。
材料：肉汤、琼脂方法：(1)在肉汤中加入2％琼脂，熔化后调整P H7.6，必要时用棉花纱布过滤。
(2)于琼脂凝固前，分装于试管或小烧瓶内，然后加棉塞并包装。
(3)放入高压蒸汽灭菌器内，经15磅/寸220分钟灭菌。
细菌的人工培养
任何培养基都应该具备微生物生长所需要六大营养要素：
碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水
任何培养基一旦配成，必须立即进行灭菌处理；
常规高压蒸汽灭菌： 1.05kg/cm2,121.3℃15-30分钟；0.56kg/cm2,112.6℃15-30分钟
培养基制备的一般程序
调配
培养基灭菌
★ 基础培养基：121℃高压蒸汽灭菌15分钟
溶化
矫正pH
★ 含糖培养基：113 ℃灭菌15分钟 过滤澄清 ★ 鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌3天3次 分装 灭菌 检定 ★ 不耐高温的液体成分：滤过除菌
保存
1、选用和设计培养基的原则和方法
目的明确 营养协调 理化条件适宜
经济节约
1）目的明确
根据不同的微生物的营养要求配制针对强的培养基。
培养化能自养型的氧化硫杆菌的培养基组成为： S 10g MgSO4.7H2O 0.5g NH4)2SO4 0.4g CaCl2 0.25g H2O 1000ml FeSO4 0.01g H2PO4 4g
液体培养基
不加任何凝固剂
大规模工业生产及在实验室进行微生物的 基础理论和应用方面的研究
含有一般微生物生长繁殖所 需的基本营养物质的培养基 按 用 途 不 同 划 分 基础培养基
在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的 一类营养丰富的培养基。特殊营养物质包括血 液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等 在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质， 用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体 抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物 中分离出来的培养基 的生长
4）经济节约
以粗代精
以氮代朊
以野代家
以废代好 以简代繁
以纤代糖
细菌的人工培养
无菌 asepsis： 不存在活菌的意思。防止微生物进入人体 或其它物品的操作技术，称为无菌操作。
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二、物理消毒灭菌法
（一）热力灭菌法
1、干热灭菌法: 焚烧: 废弃物品、动物尸体等。 烧灼：接种环、试管口。 干烤：玻璃器皿、瓷器、玻制注射器等。 红外线：医疗器械等。
2、细菌在培养基中的生长现象
液体培养基：混浊生长、菌膜、沉淀生长 半固体培养基：沿穿刺线生长或扩散生长 固体培养基：菌落
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液体培养基：混浊生长、菌膜、沉淀生长
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半固体培养基：沿穿刺线生长或扩散生长
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固体培养基：菌落
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液体 培养基
斜面 培养基
纯培养 (pure culture)
菌落(colony) 24
一、消毒灭菌的常用术语
消毒 disinfection： 杀死物体上病原微生物的方法，并不一 定 能杀死含芽胞的细菌或非病原微生物 。
灭菌 sterilization：
杀灭物体上所有微生物的方法，包括芽
胞 在内的全部病原微生物和非病原微生
物。
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清洁 cleaning：指去除尘埃和一切污秽以减少微 生物数量的过程。
干扰细菌的酶系统和代谢 如氧化剂、重金 属盐类（低浓度）
损伤菌细胞膜 如酚类（低浓度）、表面活 性剂、脂溶剂等
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四、消毒灭菌的应用
选用的消毒剂
病人排泄物、 分泌物
20％漂白粉，5％石炭酸，2％来苏，作用2h
皮肤
2.5％碘酊，70％乙醇
粘膜
1％硝酸银，0.1％新洁尔灭
细菌的人工培养一般检验方法主要动物细菌
（3） 致病性与抵抗力
致病力主要是毒素和酶,所 致的疾病为畜禽的化脓性疾 病，如：创伤感染、脓肿、 皮炎、乳房炎、败血症等。
抵抗力是在不形成芽胞的 细菌中是最强的，80℃30分 钟才被杀死，碳酸效果最好。
对青霉素、庆大霉素高度 敏感。耐药菌株逐年增多。
（4）检查： 根据病型采集病料，如取血液，乳汁，脓汁等
链球菌在血平板上菌落特征
丙链
甲链
乙链
（3）致病性与抵抗力： 产生多种酶和外毒素，不同的血清群的链球菌所致动
物的疾病不同，引起急性败血症，肺炎，淋巴结脓肿，脓 毒败血症。
本菌抵抗力不强，青霉素是首选药物。
（4）检查 根据不同的疾病，采集相应的病料，如取血液，乳汁，
脓汁、渗出物等。
• 1、直接涂片镜检：链状排列的球菌。 • 分离培养：病料接种于血液琼脂平板。
菌 膜
对
液体培养基
照
菌沉 淀
均匀浑浊
固体培养基
半固体培养基 粘液型菌落
细菌的生长表现
菌落：细菌在固体培养基上定点繁殖时，形成孤立的、肉 眼可见的堆积物。 表现：大小、形态、透明度、隆起度、度、湿润度，表面 光滑、粗糙、有无光泽。 菌苔：许多菌落融合成一片。
培养基的基本要求
1、有丰富的营养物质 2、PH、水分 3、均匀透明，易于观察。 4、经过灭菌和无菌检验
破伤风梭菌
猪丹毒杆菌G+
能力单元一（ 1-3）
细菌的人养基是人工配制的适合于不同微生物生长繁殖 或积累代谢产物营养基质。
根据培养基的用途来分
基础培养基：满足一般微生物生长繁殖所需要的营养物质。 牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的基础培养基。
营养培养基:在自然界中各种微生物通常是混杂在一起的， 了解了某一些微生物的营养要求，配制适合这种微生物生长 而不适合其他微生物生长的培养基，就达到了从自然界中分 离这种微生物的目的，这种培养基就称为营养培养基。一般 常加入血、血清或动植物提取液等。－－－－“投其所好”
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培养13年230代
卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin,BCG)
02 在固体培养基中生长现象
菌苔 菌落
分离 细菌
光滑型菌落
粗糙型菌落
鉴别 细菌
粘液型菌落
03
细菌疾病的诊断
标本
增菌培养
染色 显微镜观察 初步诊断
分离培养 纯培养
生化鉴定
确定诊断
03
细菌疾病的治疗
标本
划线接种
最敏感药物 抑菌环
青
链
培养
庆
红
药3
细菌疾病的预防
牛分支杆菌
在胆汁中适应性生 长，充分减毒成为 预防肺结核的疫苗
02 在液体培养基中生长现象
沉
混
菌
淀
浊
膜
生
生
生
长
长
长
02 在半固体培养基中生长现象
阴性对照 无鞭毛菌
鞭毛菌
（无生长）（沿穿刺线生长）（扩散生长）
02 在固体培养基中生长现象
菌落
菌苔
菌落
菌落(colony)：单个细菌在固体培养基生长形成肉眼可见的细菌集团，可分离、鉴别细菌 菌苔(mossy)：多个菌落融合形成的细菌集团，可增菌培养
细菌的人工培养
主讲人：王传生
01 培养基 02 细菌在培养基中的生长现象 03 细菌人工培养的意义
01 培养基的概念
人工配制适合于细菌生长繁殖的营养基质
01 培养基的种类
按照成分分类
合成培养基 → 已知化学物质 天然培养基 → 天然物质 半合成培养基 → 天然物质+已知化学物质
01 培养基的种类
按用途分类
基础培养基 → 牛肉膏+蛋白胨+氯化纳+水 营养培养基 → 基础培养基 + 葡萄糖、血液等 选择培养基 → 营养培养基 + 抑制性化学物质 鉴别培养基 → 营养培养基 + 指示剂 厌氧培养基 → 营养培养基 + 无氧环境
01 培养基的种类
按物理性状分类
液体培养基 → 不加琼脂 半固体培养基 → 0.2〜0. 5%琼脂 固体培养基 → 2〜5%琼脂