细菌的人工培养
细菌的人工培养
人工培养细菌的意义
在医学中的应用：诊断；细菌鉴定；生物制品。 在工农业生产中的应用 ： 在基因工程中的应用
Stationary Phase
Logarithmic growth phase
Death Phase
Lag Phase
细菌在培养基中生长现象
固体培养基：菌落colony
平板接种
巧
克
杂菌污染
力
平
板
鉴别及选择培养基
EMB琼脂平板上大肠菌 SS琼脂平板上大肠菌为
菌落具有金属光泽
粉红菌落
Control organisms : Escherichia coli : Pink colonies (lactose fermentation) Proteus mirabilis : Colorless colonies ,no spreading Enterococcus sp. : No growth
Control organisms : Escherichia coli : A/A (G) Shigella flexneri : K/A Proteus vugaris : K/A, H2S Pseudomonas aeruginosa : K/N
Incubate : Aerobic 35° C, 24 hrs Shelf life : 8 weeks Price (Baht) : 5 (return tube)
Lowenstein-Jensen Medium
微生物试验-细菌的人工培养及形态学检查
实验一 细菌的人工培养
一、细菌在自然界的分布
1.空气中细菌的检查：每班两个血平板，标记 方法：在室内选择一处放一个平皿，揭开皿盖，
暴露放置10min，即盖上皿盖，放入37℃温箱 培养24小时，观察结果。
2.人体表面细菌的检查---手 指（每组1个平皿）
方法：取一普通平皿培养 基，一部分标记“前”， 另一部分标记“后”，然 后将手指在标记“前”的 部分沾一下，洗手后在标 记“后”的部分沾一下。 放入37℃温箱培养24h后 观察细菌的生长情况。
呼吸道咽部常驻菌群种类较多，正常人咽部需氧菌 中，甲型链球菌检出率最高，其次是奈瑟球菌属和表 皮葡萄球菌。
二、 理化因素对细菌的影响
1.物理因素对细菌的影响---紫外线
原理：紫外线主要作用于 DNA，使一条DNA链上相邻 的两个胸腺嘧啶以共价键结合成二聚体，从而干扰 DNA 的复制与转录导致细菌变异或死亡。
3.人体内部细菌的检查--咽喉部
方法：用“咳碟法”进行检查，取一个血琼脂平 皿培养基，打开平皿盖，置于口腔前约 10cm， 对着平皿咳嗽几次，标记时间，姓名，然后放 入37℃温箱培养24h后观察菌落特征。
二、外界因素对细菌的影响：
1.物理因素对细菌的影响 ：
紫外线：全班两份普通平板：一组大肠杆菌， 一组葡萄球菌，比较紫外线对G+，G-的抑制作 用。
满足a充足的营无菌
（三）分类：1、按物理性状
分类：
+0.3~0.5%琼脂
+1.5~2.5%琼脂
半固体培养基 液体培养基
固体培养基
观察细菌动力 大量繁殖细菌 细菌的分离和纯化
短期保存菌种
固体平板培养基
液体培养基
固体斜面培养基 半固体培养基
细菌的人工培养方法
细菌的人工培养方法[适用对象]生物工程专业[实验学时] 4学时一、实验目的了解常用的液体、固体和半固体培养基的成分、制备方法和用途。
初步掌握各种培养基接种技术；观察细菌在培养基中的生长现象；认识菌落、菌苔。
二、实验原理培养基是用人工方法将微生物生长繁殖所需的多种营养物质调配在一起，形成的一种营养物质的混合物，用以分离、传代和培养细菌。
按培养基的用途分为基础（普通）培养基、营养培养基、鉴别培养基，选择培养基、厌氧培养基等。
按培养基的物理形状又分为液体、固体和半固体三种。
三、仪器设备三角烧瓶、天平、试管、平皿、高压消毒灭菌器。
四、相关知识点培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。
在自然界，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究目的不同，所以培养基的种类很多。
但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、无机盐、生长因子等。
不同的微生物在固体、半固体和液体培养基中能表现出各自特有的培养特征，这些特征可以作为不同种类微生物的鉴别特征之一。
了解它们的培养特征、掌握其生长规律对识别、控制和利用微生物具有重要价值。
五、实验步骤（一）常用培养基的制备1、普通液体培养基(1)将新鲜的精牛肉除去脂肪和筋膜制成肉馅，取500克牛肉馅加l000ml蒸馏水，置4℃冰箱浸泡过夜，使牛肉中的水溶性营养物质充分浸出。
(2)次日将浸泡过夜的牛肉馅加热煮沸30分钟，放凉，使残余的脂肪凝固，然后用纱布和滤纸过滤，最后将滤液补足为原量，此种液体为牛肉浸汁。
(3)取1 000ml牛肉浸汁加蛋白胨10克，氯化钠5克加热溶解，冷至50℃左右时用氢氧化钠调整pH至7．6，再煮沸10分钟(因牛肉浸汁中部分碳水化合物，经加热破坏产酸，影响pH；产生多磷酸盐，培养基不澄清)待冷却后，再调整pH至7．6，然后以滤纸过滤，滤液必须澄清，此种液体称为肉汤培养基。
(4)将肉汤培养基分装于试管或三角烧瓶中，塞好试管和瓶塞，包装好后，用15磅(121℃)蒸气15～30分钟灭菌。
细菌的人工培养
大肠杆菌在不同培 养基上形成的菌落
畜禽疫病防治 第1章 疫病的病原 第一节 细菌
细菌在固体培养基中的生长情况
菌落（R型）
固体培养基中 菌落（S型）
菌苔
细菌在固体培养基中的生长情况
光滑型菌落
粗糙型菌落
粘液型菌落
液体 培养基
斜面 培养基
纯培养 (pure culture)
菌落(colony)
三、人工培养细菌的意义
畜禽疫病防治 第1章 疫病的病原 第一节 细菌
（一）病料的采集、保存及运送
采集原则
无菌采病料 适时采病料 病料中病原含量多 采集适量病料：至少 检测量的4倍 低温保存 尽快送检 做好记录
（二）细菌的形态检查
1.病料处理
将病料涂成薄而均匀的涂片→室温下自然干
燥→若为细菌培养物涂片火焰固定 常用的染色方法有：革兰染色法、美蓝染色 法、瑞氏染色法和姬姆萨染色法
OH二乙酰 + 含胍基 化合物
（—）
（ +）
红色（+）
3、甲基红(methyl
red)试验：
葡萄糖
丙酮酸 （pH值>5.4） 甲酸、乙酸（红色）
（pH<4.5）
（—）
（+）
（五）动物接种试验
意义
为了证实所分离 菌是否有致病性 本动物
脑内接种
试验动物
静脉注射 腹腔注射
2. 毒素
来源：细菌生长繁殖中产生和释放的毒性 成分
作用：可直接或间接损伤宿主细胞、组织
和器官，干扰其生理功能
种类：外毒素和内毒素
接种途径
畜禽疫病防治 第1章 疫病的病原 第一节 细菌
一、致病性与毒力
5.第二章 细菌的生物学特性,第五节细菌的人工培养
一、培养细菌的方法
分离培养
将标本或培养物划线接种在固体培养基的表面，因划线的分散作用 ，使许多原混杂的细菌在固体培养基表面上散开，称为分离培养。
菌落
一般经过18~24小时培养后,单个细菌分裂繁殖成一堆肉眼可见的 细菌集团，称为菌落。
二、培养基
固体培养基：菌落，菌苔
二、培养基
液体培养基
半固体培养基
三、细菌在培养基中的生长现象
（一）在液体培养基中生长情况 混浊：大多数细菌 沉淀：链状生长的细菌 菌膜：专性需氧菌，如结核杆菌、枯草杆菌
三、细菌在培养基中的生长现象
（三）在半固体培养基中生长情况
通过分离培养，细菌可在固体培养 基上形成菌落。不同细菌大小、形 状、颜色、气味有助于鉴定细菌。 细菌的菌落一般分为：光滑性菌落、 粗糙性菌落和黏液性菌落。
纯培养
挑取一个菌落，移种到另一个培养基中，可生长出来的大量的纯种 细菌，称为纯培养。多用于某些菌种的扩増。
二、培养基
培养基：是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混 合营养物础培养基 增菌培养基 选择培养基 鉴别培养基 厌氧培养基
按其物理状态
液体培养基 固体培养基 半固体培养基
在工农业生产中的应用 在基因工程中的应用
本章小结
培养细菌的方法：分离培养，纯培养 培养基要求：营养物质、pH、渗透压、温度、气体 培养基的分类：营养组成和用途、物理状态 细菌培养用途：医学、工农业、基因工程
细菌的生物学特性
学习 目标
掌握 培养基的要求，菌落的概念，培养基的分类 熟悉 细菌在培养基中的生长情况 了解 人工培养细菌的用途
第五节
实验二细菌的接种、培养及代谢产物
实验二细菌的接种、培养及代谢产物（B a c t e r i a l I n o c u l e t i o n a n d A r t i f i c a l C u l t u r e a n dM e t a b o i c p r o d u c t s）一、细菌的人工培养（A r t i f i c a l C u l t u r e o f B a c t e r i a）在适当条件下，绝大多数细菌可用人工方法培养，使其繁殖，通过人工培养，获得纯种细菌，是进一步观察研究各种细菌具有不同特性的基础。
(一)常用培养基的制备1、肉汤培养基：是常用的液体培养基，也是制备某些其他培养基的基础。
材料：（制备100m l肉汤培养基的用量）(1)培养基的成分：牛肉50g蛋白脂1g氯化钠0.5g磷酸氢二钾(K2H P04·12H20)0.1g蒸馏水100m1(2)玻皿、试剂、比色管、比色架、吸管、1N与1／20N 的N a O H、三角烧瓶、漏斗、中试管、酚红指示剂、滤纸、卷筒、天平、蒸馏水。
方法：（1）将已去筋膜脂肪并经绞碎鲜牛肉50g，加蒸馏水100m l，放入冰箱中过夜。
（2）加热45—50℃一小时，并煮沸半小时，用数层纱布或滤纸过滤，滤液用蒸馏水补足其量为100m1。
（3）于滤液中加氯化钠0.5g，蛋白脂1g、磷酸氢二钾0.1g，加热使之完全溶化。
（4）测定酸碱度并调整至P H7.6，必要时用滤纸过滤。
（5）按需要分装于试管或烧瓶内，加棉花塞并包装后，置高压蒸汽灭菌器内经15磅／寸220—30分钟灭菌。
（6）灭菌后置37℃温箱，孵育24h，无杂菌生长，即可应用。
或放冰箱备用。
2、普通琼脂培养基它是最常用的固体培养基。
材料：肉汤、琼脂方法：(1)在肉汤中加入2％琼脂，熔化后调整P H7.6，必要时用棉花纱布过滤。
(2)于琼脂凝固前，分装于试管或小烧瓶内，然后加棉塞并包装。
(3)放入高压蒸汽灭菌器内，经15磅/寸220分钟灭菌。
细菌的人工培养
任何培养基都应该具备微生物生长所需要六大营养要素：
碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水
任何培养基一旦配成，必须立即进行灭菌处理；
常规高压蒸汽灭菌： 1.05kg/cm2,121.3℃15-30分钟；0.56kg/cm2,112.6℃15-30分钟
培养基制备的一般程序
调配
培养基灭菌
★ 基础培养基：121℃高压蒸汽灭菌15分钟
溶化
矫正pH
★ 含糖培养基：113 ℃灭菌15分钟 过滤澄清 ★ 鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌3天3次 分装 灭菌 检定 ★ 不耐高温的液体成分：滤过除菌
保存
1、选用和设计培养基的原则和方法
目的明确 营养协调 理化条件适宜
经济节约
1）目的明确
根据不同的微生物的营养要求配制针对强的培养基。
培养化能自养型的氧化硫杆菌的培养基组成为： S 10g MgSO4.7H2O 0.5g NH4)2SO4 0.4g CaCl2 0.25g H2O 1000ml FeSO4 0.01g H2PO4 4g
液体培养基
不加任何凝固剂
大规模工业生产及在实验室进行微生物的 基础理论和应用方面的研究
含有一般微生物生长繁殖所 需的基本营养物质的培养基 按 用 途 不 同 划 分 基础培养基
在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的 一类营养丰富的培养基。特殊营养物质包括血 液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等 在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质， 用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体 抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物 中分离出来的培养基 的生长
4）经济节约
以粗代精
以氮代朊
以野代家
以废代好 以简代繁
以纤代糖
细菌的人工培养
无菌 asepsis： 不存在活菌的意思。防止微生物进入人体 或其它物品的操作技术，称为无菌操作。
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二、物理消毒灭菌法
（一）热力灭菌法
1、干热灭菌法: 焚烧: 废弃物品、动物尸体等。 烧灼：接种环、试管口。 干烤：玻璃器皿、瓷器、玻制注射器等。 红外线：医疗器械等。
2、细菌在培养基中的生长现象
液体培养基：混浊生长、菌膜、沉淀生长 半固体培养基：沿穿刺线生长或扩散生长 固体培养基：菌落
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液体培养基：混浊生长、菌膜、沉淀生长
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半固体培养基：沿穿刺线生长或扩散生长
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固体培养基：菌落
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液体 培养基
斜面 培养基
纯培养 (pure culture)
菌落(colony) 24
一、消毒灭菌的常用术语
消毒 disinfection： 杀死物体上病原微生物的方法，并不一 定 能杀死含芽胞的细菌或非病原微生物 。
灭菌 sterilization：
杀灭物体上所有微生物的方法，包括芽
胞 在内的全部病原微生物和非病原微生
物。
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清洁 cleaning：指去除尘埃和一切污秽以减少微 生物数量的过程。
干扰细菌的酶系统和代谢 如氧化剂、重金 属盐类（低浓度）
损伤菌细胞膜 如酚类（低浓度）、表面活 性剂、脂溶剂等
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四、消毒灭菌的应用
选用的消毒剂
病人排泄物、 分泌物
20％漂白粉，5％石炭酸，2％来苏，作用2h
皮肤
2.5％碘酊，70％乙醇
粘膜
1％硝酸银，0.1％新洁尔灭
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作业
1、写出细菌生长繁殖的条件 2、细菌生长的营养物质有哪
些？
知识拓展——细菌的营养
营养类型：自养菌（无机物作为碳源） 异养菌（有机物作为碳源）
营养物质：——培养基 水、碳源、氮源、无机盐、生长因子
细菌的营养方式
营养类型：自养菌（无机物作为碳源） 异养菌（有机物作为碳源）
营养物质：——培养基 水、碳源、氮源、无机盐、生长因子
细菌的培养方法
需氧培养法 在表面培养（固体培养基中） 在深层培养（液体培养基中） 厌氧培养法 生物学方法 化学方法 物理方法 CO2培养法 微需氧培养法
培养
教师指导 学生分析
细菌的人工培养
为什么要人工培养细菌？Fra bibliotek 确定病原菌 研究细菌的特性 制备疫苗 收集细菌的代谢产物 基因工程
如何培养？
合适的营养——培养基制备技术 将细菌（菌种）接种到合适的培养
基上——接种技术 合适的环境——生长习性 培养结果——生长现象观察
细菌生长繁殖的条件
营养物质:水、无机盐、碳源、氮源、 生长因子
酸碱度： 6.8-7.4 温度：37℃ 气体：氧气和二氧化碳
细菌的分类 ——根据对氧气的需求情况
专性需氧菌 专性厌氧菌 兼性厌氧菌 微需氧菌 耐氧厌氧菌
细菌的繁殖方式
二分裂法
二分裂法的步骤： 核分裂 形成横膈 子细胞分离
生长繁殖的方式
二分裂法
生长繁殖的速度与生长曲线
20-30分钟/代
试验材料： 1、培养箱 2、记号笔 3、标签纸 准备工作： 1、做标记 2、包扎
课堂练习
1、细菌生长繁殖的四个基本条件是： 、
、、。
2、细菌生长繁殖的四种必须的基本营养物 质是： 、 、 、 。
3、细菌生长繁殖的最适pH是
。
4、细菌生长繁殖的最适温度是 。
5、细菌根据对氧气的需求情况分为五类：