药理实验方法学

另外，免疫性肝纤维化模型的建立目前常使用的异种 血清有猪血清、牛血清、人血清、血吸虫血清等。猪血清 以其中的白蛋白作为异种抗原物质，通过免疫反应活化枯 否细胞而诱导发生肝纤维化。形态学和免疫组化显示，免 疫复合物在血管和连接组织沉积先于肝纤维化的发生，而 肝细胞无显著改变。猪血清诱导的免疫性肝纤维化与人类 肝纤维化的原因有一定相似之处，纤维化形成率虽不太高， 但纤维化持久，停止注射3个月，对先前形成的肝组织改 变无影响，在研究肝纤维化产生机制和筛选抗肝纤维化药 物方面有一定的优势。因此，猪血清反复腹腔注射模型一 直用于研究吞噬细胞、贮脂细胞与肌纤维变性细胞在肝纤 维化中的作用及肝纤维化过程中微循环的改变。
方法：
将小鼠经尾静脉注射12.5 mg/kg剂量的1 mol/L刀豆素 蛋白A,每周1次,连续6周。
模型特点：
该方法所产生肝纤维化系免疫损伤所致,有利于从免 疫学角度探讨发病机制及评价药物。
与其他肝纤维化动物模型相比较,Con A诱导的肝纤 维化模型的方法成功率较高,动物死亡率较低,方法简便易 行。
一个理想的肝纤维化动物模型应该符合以下 条件: ①与人类肝纤维化疾病的基本病变特征相似; ②病变有一定发展过程，即明显分期，以及病程发展存 在一个可逆与不可逆的阶段性演进过程； ③形成率高，死亡率低，重复性好; ④造模方法简便易行和动物易获得，经济实用。
中医症候动物模型：
中医学研究认为肝纤维化多是湿热、疫毒、痰瘀、饮 食失节、情志失调、劳逸失当、正虚所致，对肝纤维化的 主要病理认识多数建立在“血瘀”基本病机之上，认为血 瘀是其主要病机,治疗也以疏肝化瘀通络贯穿始终。
方法：
对雌性Wistar大鼠采用胆管结扎与切断和逆行性注入 N-丁基-2氰基丙烯酸盐胆管粘堵的方法导致胆管阻塞,建 立肝纤维化模型。
模型特点：
采用胆总管结扎的方法可在狗、大鼠、猴等动物中制 作出实验性胆汁性肝纤维化肝硬化模型,被认为是一种能 模拟人肝纤维化的较理想动物模型,主要用于考察药物的 直接抗纤维化作用及用于筛选非创伤性肝纤维化血清指标 等的研究。 该模型主要特点是成型快、炎症反应轻、肝细胞坏死 不明显、自发逆转率低、实验指标稳定。
动物模型
临床上肝纤维化的发病机制较为复杂，涉及 到病毒复制、炎症介质释放、免疫功能紊乱、自 由基损伤等多个环节。因此，在抗肝纤维化药物 研究中可采取在损伤机制不同的多个模型上观察 药物的保肝作用，综合判断药效和作用机制。以 下介绍几种目前国际上常用的肝纤维化模型，中 毒机制的研究也较为深入。
肝纤维化造模
其他：
病毒性肝纤维化模型：给樱桃谷鸭胫静脉注 射鸭乙肝病毒(DHBV)血清,同时给予低蛋白质、低 维生素、高脂饲料喂养, 85 d后出现轻度肝纤维 增生。由DHBV复制的肝纤维化模型的优点是与人 类肝炎病毒引起的肝纤维化接近,但与鸭种来源、 DHBV接种量、接种次数、给药途径及间隔时间等 因素有关。缺点是造模时间长,影响因素偏多,不 易控制。
二甲基亚硝氨(DMN)诱导肝纤化大鼠模型： 原理：
DMN具有肝毒性、基因毒性和免疫毒性。大鼠染毒后肝 内小叶炎性细胞浸润,出血性坏死。在肝内形成中心-中心 纤维间隔或中心-门脉性纤维间隔。
方法：
用SD大鼠按10 mg/kg的剂量,给予1%DMN生理盐水稀释 液,腹腔注射10次,模型组大鼠均形成肝纤维化或早期肝硬 化。
血吸虫法： 用血吸虫尾蚴来制备肝纤维 化模型。实验第6周可见肝脏中心静脉的变形坏 死,门脉区网状蛋白聚集并伸入到肝小叶,并最 终形成肝纤维化。此种模型可用于血吸虫病性 肝硬化的药物治疗研究,但不适宜用于其他人类 肝纤维化的研究。
显微镜下放大40倍的血吸虫尾蚴：
营养法(高脂饮食法)：给大鼠含有胆固醇的高脂饲料 后，一定时间就可诱发体重超重、高脂血症、动脉粥样硬 化和脂肪肝。
原理:是CCl4进入机体后在肝内活化成自由基(.CCl 和.00Cl3),后者可直接损伤质膜,启动脂质过氧化作用,破 坏肝细胞的膜性结构等,造成肝细胞变性坏死。 方法：一般采用60%CCI4橄榄油溶液给雌性SD大鼠以 0.3ml/100g体重皮下注射,每周2次,共12周,肝功能检查模 型组谷丙转氨酶、总胆红素均较对照组明显升高,血清白 蛋白水平则明显下降,PCⅢ、LN、HA含量测定较对照组均 显著增高,病理组织学证实造模组大鼠有典型的假小叶形 成,纤维间隔增宽,形成肝纤维化。
目前尚缺乏依据中医病因病机理论建立的肝纤 维化动物模型。由于“证候”概念寓意深刻,包含的 信息量庞杂,是一个动态过程,具有复杂性、模糊性 和不确定性,因此证的研究受到很大的局限,与之相 关的肝纤维化的证候动物模型的研究也受到限制。
总之,理想的肝纤维化模型应具有人类肝纤维化 的基本形态特征,其病理改变呈阶段性进展,模型制作 具有可重复性以及低死亡率等到特点。今后应进一步 加强肝纤维化动物模型研究,并结合中医理论寻找符 合“证”本质的动物模型,从而促进中医药抗肝纤维 化的研究。
模型特点：
该模型造模周期短,大鼠死亡率低,肝纤维化形成也相 对稳定。在评价药物对伴凝血障碍、纤溶亢进的慢性肝病 致纤维化的防治方面是一个比较理想的模型。
缺点是小剂量不易形成肝纤维化,大剂量又容易形成 肝细胞坏死后纤维化,剂量不容易掌握。
胆汁性肝纤维化动物模型: 原理：
通过结扎胆管或注入硬化剂等方法人为地造成肝外胆 道梗阻,从而引起梗阻部位以上胆管扩张、胆汁淤积、 胆 道内压力增高,由于肝内血管受到扩张胆管的压迫及胆外 渗,肝细胞发生缺血和坏死,纤维组织增生向胆管伸展,包 绕肝小叶,形成肝纤维化。
肝纤维化动物模型的建立方法主要包 括：化学药物或毒物所致肝纤维化实验动 物模型，如:四氯化碳；胆管阻塞 (BCM)、 慢性酒精中毒性、实验性免疫法、致癌物 致肝纤维化动物模型等。
动物的选择:主要有小鼠、大鼠、鸭、 家兔、家犬、猕猴等,但从造模的成功性、 简便性、稳定性及经济性等方面考虑,目前 大多选择大鼠制备模型。
体外模型
肝脏细胞分为肝实质细胞和非实质细胞， 非实质细胞又可分为肝窦内皮细胞、 枯否 氏细胞、Ito细 胞和隐窝细胞。它们在整个 肝脏细胞中 (除外胆管细胞和血管细胞)所占 的细胞百分数和体积百分比见下表。
大鼠肝脏细胞的种类和比例
细胞数（﹪） 肝细胞 血窦内皮细胞 枯否细胞 肝星状细胞 隐窝细胞 60 19 15 5 1 体积（﹪） 92.2 3.3 2.5 1.7 0.3
方法：以基础饲料+100g/kg猪油+ 20g/kg胆固醇喂 养大鼠12wk，实验动物出现高胆固醇血症、中重度脂肪肝 伴以小叶内为主的肝脏炎症坏死，从而建立了高脂饲料诱 发的大鼠高脂饮食模型。
特点： 此大鼠脂肪性肝炎伴随肝纤维化模型与人类的脂肪性 肝炎肝纤维化在生化、病理等方面较为接近。且该造模方 法简便，仅需含有一定比例的猪油和胆固醇的高脂饲料， 造模过程中大鼠死亡率为零。 不足之处是，这些动物模型一般无明显的脂肪性肝炎， 更少出现肝纤维化，除非有内毒素等“二次打击”的作用。
复合模型的建立： （1）先用苯巴比妥诱导肝酶 （2）2周后加用CCl4建立肝纤维化模型,皮下注射四氯 化碳花生油溶液、高脂饮食、酒精等。此方法造模时间短, 肝纤维化形成率较高,死亡率较低。 （3）联合应用血管紧张素每100g体重0.3mg,分2次腹 腔注射及CCI4皮下注射每100g体重0.3ml,每3天1次,首剂 加倍,结果使原先单独使用CCl4需时8周的肝纤维化在4周 内完成,加速了大鼠肝纤维化进程,缩短了造模时间。
乙醇法：
原理： 肝脏是乙醇代谢的主要场所,90%以上的乙醇在 肝脏通过乙醇脱氢酶(ADH)和微粒体乙醇氧化酶系 统(MEOS)进行氧化代谢,乙醇脱氢酶和微粒体乙醇 氧化酶系统通路均可产生毒性代谢产物乙醛。乙醛 通过多种途径损害肝脏的结构和功能,直接刺激胶 原蛋白质的合成,从而促进肝纤维化的发生。 方法： 国外已经创建成型的有Lieber-Decarli模型 Tsukamoto-French模型和Lieber-Decarli液体饲料加 辅剂模型。
肝纤维化是肝脏对各种原因所致肝损 伤的创伤愈合反应，表现为肝内结缔组织 增生与沉积，是慢性肝病重要的病理特征， 也是进一步向肝硬化发展的重要环节。
在体外模型上，肝星状细胞（HSC）在肝 纤维化发病中的作用得到深入探讨。HSC梯度 离心分离和体外培养研究的建立与推广应用始 于上世纪八十年代，为研究肝脏基质的产生和 作用（如硬度、收缩性、组成、比较生物学等） 提供了有力工具，并证实HSC具有产生胶原等 细胞外基质的能力，在肝损伤和纤维化发病中 起重要作用。 研究证实，HSC体外激活模型可复制许多 但不是全部的体内激活特征。因此分离和培养 肝脏内其他细胞也极为重要。
HF造模：
CCl4 法制备HF动物模型 致癌物及毒物（化学性）HF动物模型 胆管阻塞法诱导HF模型 免疫性HF动物模型 高脂造HF模型 血吸虫性HF动物模型的制备 金属离子摄入建立HF模型 复合因素致肝纤维化模型
四氯化碳(CCI4)诱导的肝纤维化模型：
四氯化碳又称四氯甲烷,主要用于制造二氯二氟甲烷和 三氯氟甲烷,还可用于制造氯仿和其它药物,也可用作溶等。 CCl4法造模的途径有口服、腹腔注射及皮下注射,依据 药途径和剂量的不同,所需时间8周至4个月不等。动物实验 研究证明,四氯化碳除致急性肝损伤外,反复多次的刺激可导 致慢性肝损伤的发生,主要表现为肝细胞再生和肝纤维化。 临床研究表明,四氯化碳是引起人类肝损害的剧毒类化学药 物。
药理实验方法学 —肝纤维化
南京中医药大学药学院 郑仕中 教授、博导
2009年AASLD (American association for the study of liver diseases)主席、美国西奈山医学院肝病研 究中心主任弗里德曼（Friedman）教授在 专题会上介绍了肝纤维化模型的研究历史 和进展。肝纤维化主要的模型包括动物模 型和体外模型。 目前的肝纤维化动物模型可模仿人肝 硬化发生过程，是研究肝硬化发病机制和 药物疗效的重要方法。