免疫球蛋白的鉴定

单向扩散试验
试管法 该方法由Oudin于1946年报道，将混有抗体的琼脂凝胶注入小口
径试管内，待其凝固后在上层加上抗原溶液，让抗原自由扩散人凝胶 内，在抗原与抗体比例适当位置形成沉淀环。本法多用于排泄物和组 织匀浆中的细菌、寄生虫、螺旋体等抗原的检测。但此法的沉淀环不 易观察及定量，目前较少应用。
一定范围内，沉淀环随时间延长而逐渐扩大，当抗原抗体反应充分而 终止时，沉淀环直径的平方(d2)与抗原浓度(C)呈线性关系，常数 K=C/d2，此为Mancini曲线。使用普通坐标纸画曲线。 2.Fahey曲线 适用于小分子抗原和较短时间(24h)扩散的结果处理。抗 原浓度的对数(logC)与沉淀环直径(d)呈线性关系，常数K=logC/d， 此为Fahey曲线。使用半对数坐标纸画曲线。
火箭免疫电泳图 ①②③④为标准抗原;⑤⑥为标本
对流免疫电泳
【 实验原理 】 当抗原和抗体在琼脂介质中电泳时 ，抗体的 PI 比较高， 在适当的 pH 值下，抗体带正电荷而抗原带负电荷，故在 电场中抗体向阴极方向移动而抗原向阳极运动，直至相遇 后形成沉淀线，其原理与双向免疫扩散相同，但具有方法 简便，快速及一次电泳可以检测多个样品等特点。
100 μ l生理盐水
注意事项
1．不规则的沉淀线可能是加样过满溢出、孔型不规则、边缘开 裂、孔底渗漏、孵育时没放水平、扩散时琼脂变干燥、温度过 高蛋白质变性或未加防腐剂导致细菌污染等所致。 2．抗原抗体的比例与沉淀带的位置、清晰度有关。如抗原过多， 沉淀带向抗体孔偏移和增厚，反之亦然。可用不同稀释度的反 应液试验后调节。
免疫球蛋白的鉴定
免疫球蛋白
免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)是一组具有抗体活性的蛋白质， 由浆细胞产生，主要存在于生物体血液和其他体液（包括组织液和 外分泌液）中，约占血浆蛋白总量的20％；亦可分布在B细胞表面。
人血浆内的免疫球蛋白大多数存在于丙种球蛋白（γ-球蛋白）中。 免疫球蛋白可以分为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五类。 Ig是体液免疫应答中发挥免疫功能最主要的免疫分子，免疫球蛋白
1：16，1：32，1：64 等不同滴度。并用微量加样器分别加10μ l于周围孔中； 4 . 用微量加样器加 10 μ l 抗原于中心孔； 5. 将凝胶板置于湿盒，室温过夜（ 24h 以上）后观察结果，绘出沉淀线位置、
数量、形态。
100 μ l 抗体
100 μ l 100 μ l 100 μ l 100 μ l
【 实验材料 】 1% 琼脂糖，玻片或培养皿，凝胶打孔器（直径 3mm）,水浴箱， 5μl 微量加样 器，抗体，抗原，电泳仪，阳性对照血清，滤纸 【 实验方法 】 1 ）取一张玻璃片，用水冲洗干净后，再用少量 75% 乙醇冲洗，晾干后置于水 平台备用。 2 ） 1% 琼脂糖融化， 56 ℃水浴中保温 3 ）吸取琼脂糖铺于玻璃板上，厚约 1.5mm ），制成所需胶板。 4 ）等待琼脂糖凝固后，用打孔器成对打孔，孔径 3mm ，孔间距 3mm 。排距 3mm 。 5 ）在孔中分别加入抗原和抗体，每孔 5 μ l 6 ）在电场中电泳 30 分钟（ 5v/cm ） 7 ）观察结果。在两孔间出现沉淀线的为阳性。 【 结果分析 】 本实验是定性实验，用于多种疾病的检测，如 HbsAg ， AFP 等的检测，血吸虫 ，包虫病等抗体的测定。
4.扩散环有时可出现双重沉淀环现象，这是由于抗原性相同但扩散率不 同的两个组分所致。例如。重链病血清中出现。重链和正常IgA两种成 分并存，它们都与抗IgA发生反应，就形成内外双重环。
双向扩散试验
平板法 该方法是鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一。 该方法的基本步骤是：先在乎板玻璃上倾注一均匀的琼脂薄层，凝固 后在琼脂板上打孔，孔径一般为3mm，孔间距通常在3-5mm，孔的排 列可呈梅花形、双排形或三角形等。在相对的孔中加入抗原或抗体， 放置湿盒37 ℃ ，18-24h后，琼脂中各自扩散的抗原和相对应的抗体可 在浓度比例适当处形成可见的沉淀线。
根据抗原与抗体反应的方式和特性，免疫沉淀试验可分为单向扩散 试验和双向扩散试验。
单向扩散试验(single diffusiontest)是在琼脂凝胶中混入一定 量的抗体，使待测的抗原溶液从局部向琼脂内自由扩散，在一定区 域内形成可见的沉淀环。
双向扩散试验(double diffusiontest)是让抗原和抗体双方都在 琼脂中各自向对方扩散，在比例恰当之处形成抗原抗体沉淀线，观 察这种沉淀线的位置、形状以及对比关系，可对抗原或抗体进行定 性分析。
火箭电泳
将抗原抗体反应置于一定的电场中进行，能使抗原抗体反应更 加快速，灵敏。根据方法的不同，主要有火箭电泳，对流免疫 电泳，交叉免疫电泳等。 【 实验原理 】 火箭电泳是把单向扩散技术与电泳技术结合起来。抗原在含有 抗体的琼脂糖凝胶中电泳时，在电场的作用下，抗原向一个方 向移动并逐步与凝胶中的相应抗体结合形成沉淀峰。沉淀峰的 高度与抗原的浓度成正比。
影响因素
单向扩散试验作为抗原的定量测定方法，若操作规范，其重复性和线 性均好，灵敏度稍差。
1.抗血清不但要求亲合力强、特异性好和效价高，还应注意存放的方法， 防止效价下降。
2.标准曲线必须在每次测定时同时制作，每次测定还须带质控血清，以 保证定量准确性。
3.单向扩散试验时，有时会出现结果与真实含量不符，主要发生在Ig测 定中。如用单克隆抗体测定正常人多态性抗原，则抗体相对过剩，使 沉淀环直径变小，测量值降低;反之如用多克隆抗体测定单克隆病(M蛋 白)，则抗原相对过剩(单一抗原决定簇)，沉淀环呈不相关扩大，从可作如下分析： 抗原或抗体的存在与否以及相对含量的估计：沉淀线的形成是根据抗原抗 体两者比例所致，沉淀线如果靠近抗原孔，则表示抗体含量较大;沉淀线如果 靠近抗体孔，则表示抗原含量较大; 不出现沉淀线则表明无对应的抗体或抗 原或者抗原过量。 沉淀线形状、位置与抗原抗体分子量及浓度的关系 抗体效价的滴定：双向扩散试验是抗血清抗体效价滴定的常规方法。固定 抗原的浓度，稀释抗体;或者抗原和抗体双方皆作不同的稀释，经过自由扩散， 形成沉淀线，以出现沉淀线最高的抗体稀释度为该抗体的效价。 抗原或抗体纯度鉴定：用混合抗原或抗体鉴定抗体或抗原，出现一条沉淀 线说明待测抗原或抗体纯，出现多条沉淀线说明不纯。 双向扩散试验简单易行，用途广泛，但该技术灵敏度低，出现结果慢，不 能精确定量，这些弱点在相当程度上限制了它的应用。
合适比例：
1934年，Marrack 网格学说（lattice theory）
常用的检测方法
经典的抗原抗体反应 凝集反应 沉淀反应 补体参与的反应 中和反应
凝集反应 agglutination
直接凝集反应 间接凝集反应 间接凝集抑制反应 Coomb’s试验
直接凝集反应
1%血球
抗A
抗B
【 结果分析 】 1. 本实验主要用于抗原的测定（只能测定μ g/ml 以上的含量）。计
算方法同单向扩散，均需先根据系列稀释的标准抗原的峰高作出标 准曲线，然后在标准曲线上找出待检抗原对应的浓度。 2. 可用于检测血清免疫球蛋白或分泌型 IgA 及补体 C3 等的含量。 3. 一般来说，抗原应放在负极的一侧，因为多数蛋白性抗原在碱性电 泳缓冲液中带负电，在电场中向阳极运动。
(singleradialimmunodiffusion，SRID)，最后测量沉淀环的直
径或计算环的面积。沉淀环的直径或面积的大小与抗原量呈正相关， 同时这种沉淀环还与分子量和扩散时间有关。
单向扩散示意图
抗原量与沉淀环直径的关系有两种计算方法： 1.Mancini曲线 适用于大分子抗原和长时间扩散(>48h)的结果处理，在
【 实验材料 】 1.2% 琼脂糖，玻片，凝胶打孔器，水浴箱，吸管，微量加样器，抗原，抗体， 生理盐水。 【 实验方法 】 1. 用定量吸管吸取热琼脂3.5ml，平铺于载玻片上； 2. 待凝固后，按图形卡，用打孔器打孔，用针挑去孔内琼脂； 3. 在100 μ l Ab1中加入100 μ l生理盐水，依次稀释成1：2，1：4，1：8，
所具有的功能是由其分子中不同功能区的特点所决定的。
体外抗原抗体反应的特点
高度特异性
可逆性
Ag+Ab ←→ AgAb
[AgAb] K= —————
[Ag][Ab]
Ab结合部位 affinity 亲和力 Ag决定簇
体外抗原抗体反应的影响因素
电解质 ： 生理盐水 / PBS
pH：
6-8
温度： 37-42℃
采用平板法对待测蛋白质样品定量测定，需具备以下三种条件： 1. 仅针对某待测抗原的单价特异性抗血清; 2. 已知浓度的标准品; 3. 待测样品含量在1.25mg/L以上。 常用于临床检测的项目有IgC;、IgA、IgM、C3、C4等。
[ 结果分析 ] 1 . 由于各类免疫球蛋白的分子量大小不等，因此同样浓度的 IgG ， IgA ， IgM 在琼脂糖中的扩散速度各异， IgG 扩散最快，形成的 沉淀环直径最大， IgM 的分子量最大，扩散速度慢，形成的沉淀 环较小。 2. 形成的沉淀环大小与抗原或抗体的浓度相关，沉淀环的大小与所 检测的抗原浓度成正比。 检测时应先调整抗体和抗原各自的最适浓度，抗体的最适浓度应使 免疫扩散后的沉淀环边缘清晰，且能测出血清中的免疫球蛋白的正 常值和最大限度的异常值。抗体浓度过高，形成的沉淀环直径小； 浓度过低，不易检测抗原的最高限浓度。抗原浓度过低时，沉淀环 太小不易测定，过高时，沉淀环太大，浪费抗体。
琼脂糖的疏散网状结构有利于大分子的自由迁移； 合适比例的抗原抗体结合后聚集形成沉淀； 沉淀的产生阻止抗原抗体复合物的自由运动； 沉淀带形成一种特异性的半渗透性屏障，阻滞相同抗原抗体复合 物，而允许不同的分子通过。 沉淀线的特征与位置： 1 抗原、抗体的特异性和浓度， 2 抗原、抗体分子的大小 3 扩散率 当抗原抗体存在多种成分时，将呈现多条沉淀线以至交叉反应线， 可用来检查抗原和免疫血清的特异性、纯度或浓度比较抗原之间 的异同点。