谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸的调节控制

谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸的调节控制

1 菌种的选育

目前工业上应用的谷氨酸产生菌有谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌、噬氨短杆菌等。我国常用的菌种有北京棒状杆菌、纯齿棒状杆菌等。在谷氨酸发酵中，如果能够改变细胞膜的通透性，使谷氨酸不断地排到细胞外面，就会大量生成谷氨酸。研究表明，影响细胞膜通透性的主要因素是细胞膜中的磷脂含量。因此，对谷氨酸产生菌的选育，往往从控制磷脂的合成或使细胞膜受损伤入手，以提高细胞膜对谷氨酸的通透性，如生物素缺陷型菌种的选育。

发酵中原料要消耗在如下三个方面:第一、供菌体增殖，生成足够量的菌体，使其干重占到发酵液的1.0%1.5%，这是产酸前提与基础。第二、生成谷氨酸。第三、由于菌体代谢多支路及发酵条件控制不当而产生的一些其他副产物如乳酸、酮酸、其他氨基酸等等及一些原料被分解而随空气逸出。【1】

2 糖液质量是发酵的基础

糖液质量是发酵成功的基础" 这是氨基酸发酵业界同仁的共识。氨基酸发酵所需的糖液不同

于麦芽糖、结晶糖。有它自身特点，其糖液DX、DE、透光率高而且经糖谱分析，糖（及以上的)值要低，防止发生复合反应。为达到上述要求，作出符合发酵所需要的优质糖液，可按以下条件实施生产调控：

2.1一次喷射双酶法%

2.2选用高效优质酶和喷射器-水热器);

2.3 液化:调浆ph5.8～6.0 液化维持温度100～95％;液化维持时间100～120min 2.4糖化:ph4.1～4.3 糖化温度60% 糖化时间32～36h

2.5过滤:高液位压差法

3 接种量和种子培养扩大级数

为提高发酵罐中菌的增殖速度，菌体数尽快达到高峰，使产物的合成时间提前，力争采用较大种量。

大种量可使发酵时间缩短，但种量过大，也使菌体生长过快，料液粘度增加，导致DO不足，影响产物合成。同时要消耗过量的糖和营养，致使糖酸转化率下降。

一般常用接种量，谷氨酸发酵为5%～10％赖氨酸为10～15%更高者达20%

代谢产物的合成是靠菌来完成，菌体量越多自然产量越大，但菌体的活力必须保持在最佳状态。为提高单位容积内菌体数量可采用高细胞密度培养方式。但要防止种龄过长，菌体过早衰退。

为提高种量，缩短种龄，增强菌体活力，赖氨酸和谷氨酸发酵也可采取三级种子扩大培养方法。如谷氨酸发酵罐" 一级种瓶→二级4m3种罐→三级40m3种子罐→386m3发酵罐" 多一级种子扩大，应重视对染菌的控制。

4 溶氧水平和生物素用量

。理论上，对于生物索缺陷型菌株，增大用量可提高菌体浓度，在适当的发酵控制下，当菌体内生物素

被消耗至“贫乏”水平，菌体可大量合成谷氨酸，从而达到提高代谢产物浓度的目的。但是，谷氮酸产生菌的生长和代谢往往还受到其它因素影响，在目前的发酵条件下，发酵罐的溶氧条件就是制约因素之一

为提高生物素缺陷型菌株发酵生产谷氨酸的单罐产量，对发酵罐搅拌器和高生物素谷氨酸发酵工艺进行研究。试验结果表明：将 100 in 发酵罐原有 6弯叶圆盘涡轮搅拌器改造为 6半圆叶圆盘涡轮搅拌器，并对其尺寸进行优化。发酵罐的溶氧系数提高了147％；通过在最终改造的发酵罐中进行发酵试验，其适宜的初始生物素浓度和单罐谷氨酸产量均达到最高，分别为 12．2 L 和 l1．65 t，比搅拌器改造前分别提高了56％和25％。因此，提高发酵罐的溶氧系数，有利于提高生物素的适宜用量，最终促进了单罐谷氨酸产量的显著提高。

5

谷氨酸棒杆菌 Corynebacterium glutamicum 是40年来世界氨基酸生产的主要菌株。最近 Coryne2 bacterium glutamicum ATCC 13032 的基因组测序工作已经完成。该项工作的完成促进和方便了国内外研究人员采用分子生物学的方法对棒杆菌做更深入的研究。按照以往总结出的有关谷氨酸生产菌株的特点 ,乙醛酸循环为必需的代谢途径 ,这是因为以糖质原料发酵生产谷氨酸时 ,在谷氨酸发酵的菌体生长期 ,菌体需要它来提供部分能量和生物合成反应所需的中间产物 ,但同时指出 ,在菌体生长期后的谷氨酸合成期 ,为了大量生成和积累谷氨酸 ,最好封闭乙醛酸循环途径。这是因为如果三羧酸循环中的四碳二羧酸100 %地由 CO2 固定反应供给 ,则糖酸转化率为 87.1 %;如果四碳二羧酸100 %地由乙醛酸循 [2 - 3]环供给 ,则糖酸转化率只有 54.4 % 。所以我们可以乙醛酸循环途径缺失这方面来入手。

方法步骤有以下一些：

5.1乙醛酸循环途径缺失的谷氨酸棒杆菌突变株的构建

5.2细胞生长曲线的绘制

5.3摇瓶发酵及其葡萄糖和谷氨酸的测定

5.4粗酶液的制备

5.5细胞内异柠檬酸裂解酶( ICL) 活性的测定

5.6酶蛋白定量

上法能够得到乙醛酸循环途径缺失的谷氨酸棒杆菌突变株，然后我们将其和野生型菌株一桶进行培养，从图可知,当野生型菌株和乙醛酸循环途径缺失的谷氨

酸棒杆菌突变株在以葡萄糖为唯一碳源的基本培养基上生长时,它们的生长速度几乎相同,说明当以葡萄糖为碳源进行培养时谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum 不需要乙醛酸循环为其提供生长所需的能量和代谢中间产物。当在以乙酸为唯一碳源的基本培养基上培养时, 菌株由于缺乏乙醛酸循环途径而不能生长;野生型菌株与以葡萄糖为碳源进行生长时比较,迟缓期延长约15h。

从表2 可知异柠檬酸裂解酶基因被敲除的突变株WTΔA 没有异柠檬酸裂解酶活性。而野生型出发菌株WT 生长在以葡萄糖为唯一碳源的基本培养基上时有微弱的异柠檬酸裂解酶活性。但是在以乙酸盐为唯一碳源的基本培养基上生长时由于受到乙酸盐的诱导作用而酶活大增。

虽然乙醛酸循环途径是谷氨酸棒杆菌谷氨酸合成的中心代谢途径之一，但是有关谷氨酸棒杆菌的乙醛酸循环途径的作用并不明确。

6 温度对发酵的影响与调控

发酵温度升高，酶反应速率增大，生长代谢加快，但菌体易衰老，影响最终产酸。不同氨基酸的发酵适宜温度也是不同的。例如谷氨酸发酵前期33%～34%；中期35%～36%；后期38%～39％.

发酵过程，由于菌体增殖和生物合成代谢产物而产生热量（发酵热）使发酵液温度升高，须及时冷却，以难持适宜的发酵温度。

不同氨基酸发酵热是不同的。谷氨酸发酵热约3.5×104 (KJ／m3·h)赖氨酸的发酵热约为5.0×104(KJ／m3·h)。而且发酵温度也比较低，所需要的冷却面积和冷却水水量都高于谷氨酸。

生产上根据温度变化!用冷却水进行调控，一般采用数显指示，手段调节。最好使用pt电阻温控气动阀自动调节.