生物制品制备基本技术
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新GMP标准规范-生物制品
新GMP 标准规范-生物制品第一章第一章 范围范围第一条第一条 生物制品的制备方法是对其进行相应控制的关键因素。
按照下类方法制备的生物制品属本附录适用的范围： — 微生物培养物，不包括重组DNA 制品；— 微生物和细胞培养物，包括由DNA 重组或杂交瘤技术制备的制品；— 生物组织提取物；— 通过胚胎或动物体内的活生物体繁殖。
第二条第二条 采用上述方法制备的生物制品包括：细菌类疫苗（含类毒素）、病毒类疫苗、抗毒素及抗血清、血液制品、细胞因子、生长因子、酶、按生物制品管理的体内和体外诊断试剂以及其他活性制剂（如毒素、抗原、变态反应原、单克隆抗体、重组DNA 制品、抗原抗体复合物、免疫调节剂及微生态制剂等）。
第三条第三条 人血浆蛋白制品不属于本附录适用的范围。
第二章第二章 原则原则第四条第四条 应根据生物制品下列产品和工艺的特殊性对其生产过程和中间产品的检验进行特别的控制，以确保产品的质量和安全性：— 生物制品的生产涉及生物过程和生物材料，如细胞培养、活生物体材料提取等。
这些生产过程存在固有的可变性，因而其副产物的范围和特性也存在可变性，甚至培养过程中所用的物料也是污染微生物生长的良好培养基；— 生物制品质量控制需采用比理化测定可变性更大的生物学分析技术；— 为提高产品效价（免疫原性）或维持生物活性，常需在成品中加入佐剂或保护剂，致使部分检验项目不能在制成成品后进行。
第三章第三章 人员人员第五条第五条 从事生物制品生产的全体人员（包括清洁人员、维修人员）均应根据其生产的制品和所从事的生产操作进行专业（卫生学、微生物学等）和安全防护培训。
培训记录应归入个人培训档案，培训效果应进行考核评估和定期回顾。
第六条第六条 生产和质量管理负责人应具有相应的专业知识（细菌学、病毒学、生物学、分子生物学、生物化学、免疫学、医学、药学等），并有丰富的实践经验，以确保其能够在生产、质量管理中履行职责。
第七条第七条 根据所生产制品的生物安全评估结果，应对生产、维修、检验、动物饲养的操作人员、管理人员接种相应的疫苗并定期体检。
2第二章--生物制药工艺基础
第二节 微生物制药工艺技术基础
一、菌种的分离与筛选
1．含菌样品收集 2. 富集培养：“投其所好”，“取其所抗” 3. 菌种纯化：（1）平板划线法 （2）稀释平板法 4. 性能测定（菌种复筛）
（1）平板划线法
是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀 释而达到分离的目的。固体培养基四区划法接种法步骤：
二、菌种的选育与保藏
1．自然选育
依据自发突变原理，通过不断分离、筛选，除去 衰变菌落，从中选择维持原有生产水平的菌株或高产 突变株，达到纯化、复壮、稳定生产目的。
单孢子菌悬液的制备→分离→单菌落培养→筛选
2．诱变育种
指有意识地将生物体暴露于物理的、化学的或生物的一种 或多种诱变因子，促使生物体发生突变，进而从突变体中 筛选具有优良性状的突变株的过程。
优点是生产规模大、蒸发温度低、速度快， 目的是除去挥发性溶剂，保持物料生物活性， 加速蒸发原理是使液体形成薄膜，增加气化表面
积。
世界上最大的具有80m2蒸发面 积的薄膜蒸发器。
实验室常用真空旋转蒸发仪。
薄膜蒸发器
2.干燥
使物质从固体或半固体状经除去存在的水分或它种 溶剂，从而获得干燥物品的过程。
第二章 生物制药工艺技术基础
Basis of biopharmaceutical technology
生化制药工艺技术基础 微生物制药工艺技术基础 生物技术制药工艺技术基础 生物制药中试放大工艺设计 生物药物的研究与新药申报
本章学习目标
掌握：生化活性物质的提取、分离和纯化； 微生物菌种选育和培养。
②pH；
③盐；
④表面活性剂。
四、生化活性物质浓缩与干燥
1.浓缩方法： 生化活性物质的热不稳定性 ①盐析，中性盐硫酸铵沉淀蛋白（酶）； ②有机溶剂沉淀，生物大分子溶液
生物制品概述(全套)
体内及体外诊断制品及其他活性制剂（包括毒素、抗 原、变态反应原、单克隆抗体、重组DNA产品、抗原抗体复合物、免疫调节剂、微生态制剂等）。
二、生物制品的分类
2.1 疫苗（Vaccines）
细菌类疫苗（Bacterial Vaccines）：也称菌苗，由细菌、 螺旋体或其衍生物制成，如卡介苗、伤寒Vi多糖疫苗、破伤 风疫苗（类毒素）等。 病毒类疫苗（Viral Vaccines） ：由病毒、衣原体、立克 次体或其衍生物制成，如麻疹减毒活疫苗、重组（CHO细 胞）乙型肝炎疫苗等。
异源苗是用具有共同保护性抗原的不同种微生物制备成的疫苗。如用鸽 痘病毒预防鸡痘等。
四、疫苗及疫苗制备技术
（2）灭活疫苗：病原微生物经理化方法灭活后，仍然保
持免疫原性，接种后使动物产生特异性抵抗力，这种疫苗 称为灭活疫苗（死苗）。
缺点：死苗接种后不能在动物体内繁殖，因此使用接种剂
量较大，免疫期较短，需加入适当的佐剂以增强免疫效果 延长免疫期。
细胞病变(CPE)。CPE可在光学显微镜下观察，是病
毒学检测及研究的常规手段之一。
病毒产生CPE的能力与其对动物的致病力正相关，因 此通常用CPE作为指标，来判定病毒的毒力，即计算 病毒的半数细胞感染量(TcID50)。Leabharlann 四、疫苗及疫苗制备技术
2.2 病毒与细胞相互作用的类型
空斑或蚀斑：将10倍梯度稀释的病毒样本接种吸附于
四、疫苗及疫苗制备技术
（4）生物技术疫苗
利用生物技术制备的分子水平的疫苗，包括基因工程 亚单位疫苗、合成肽疫苗、抗独特型疫苗、基因工程 活疫苗以及DNA疫苗。 基因工程亚单位疫苗 ：用DNA重组技术，将编码病原 微生物保护性抗原的基因导人受体菌(如大肠杆菌)或 细胞，使其在受体细胞中高效表达，分泌保护性抗原 肽链。提取保护性抗原肽链，加入佐剂即制成基因工 程亚单位疫苗。
兽医生物制品基本生产技术—病毒培养技术
细胞的制备
2.单层细胞的传代 多采用EDTA(乙二胺四乙酸)-胰酶消化法，胰酶浓度为
0.025％，EDTA浓度为0.01％。 具体方法：单层细胞弃去营养液，加37℃预热的EDTA-胰
酶消化液（覆盖细胞表面），待细胞开始脱落时，弃去消 化液，加入少量生长液轻轻吹打使细胞分散，再用生长液 稀释，分装成2～3瓶培养。 某些半悬浮培养或悬浮培养的细胞如SP2/O瘤细胞，不需 消化液消化，采用机械吹打即可形成单细胞。
病毒的细胞接种增殖技术
3.病毒增殖的判断指标 • 细胞病变效应（CPE ）
细胞圆缩 细胞聚集 形成合胞体 轻微病变
倒置显微镜
病毒的细胞接种增殖技术
接种单纯疱疹病毒1型的人角膜上皮细胞（CPE） （A-正常细胞，B-感染后8h，C-感染后12h， D-感染24h ）
病毒的细胞接种增殖技术
4.病毒的收获 一般在CPE达80%左右时收获。 通过冻融、超声波等方式破碎细胞，使病毒充分释放，
病毒的增殖过程
4.生物合成
• 病毒利用宿主细胞作为生物合成机构，使病毒核酸表达和 复制,产生大量的病毒蛋白质和核酸。
mRNA的合 成
早期：特异性酶的合成 核酸复制 结构蛋白质合成
病毒的增殖过程
5.装配与释放 • 新合成的毒粒结构组分组装成完整的病毒颗粒，称做病毒
的装配,亦称成熟。
• 成熟的子代病毒颗粒以一定的途径释放到细胞外。
如，猪甲状腺细胞培养猪传染性胃肠炎病毒 ·非宿主动物细胞
如，鸭胚成纤维细胞培养马立克氏病病毒。
病毒的细胞接种增殖技术
2.影响病毒在细胞中增殖的因素 （1）血清
• 维持液中血清含量：一般不超过2% （2）温度
• 最适温度多为37℃。 • 有些病毒生长的最适温度高于或低于37℃。 如，狂犬病
生物制品生产基本技术—菌种、毒种、虫种
（一）、自然选育培养法
在测定时，还应设生理盐水或培养液阴性对照和同种菌(毒、虫)种的阴性对照，以 免得出错误结论。 如果阴性对照动物发病，则实验不能成立； 如果阴性对照不发病，则对结论应慎重。 免疫原性测定是使对菌(毒、虫)种免疫敏感的动物产生免疫力，然后再用强毒攻击， 如果动物不发病死亡则表明有一定的免疫原性。如果分离的菌(毒、虫)株有数种，可 分别免疫，然后交叉攻击感染以确定抗原谱。 作为菌(毒、虫)种应选用的免疫原性好，且抗原谱广，能提供交叉保护的菌(毒，虫) 株。
（二）、人工选育培养法
（2）通过细胞培养物 ➢将强毒力菌(毒、虫)株通过细胞培养物反复传代也可以使其毒力减弱或消失。 如马传染性贫血驴白细胞弱毒株，山羊痘细胞弱毒株，通过猪肾细胞继代的伪狂犬 病弱毒株等。 ➢通过上述方法人工选育培养的菌(毒、虫)种，其形态、生理生化特性可能也会随之改
变，但最重要的是要保证遗传上稳定的弱的毒力和有良好的免疫原性。
（二）、按菌(毒、虫)种的用途分类
1、生产用菌(毒、虫)种 是指用于生产生物制品的菌(毒、虫)种，即指生产疫苗、抗毒素、类毒素、 抗血清及诊断用品的菌、毒种。 2、检定用菌(毒、虫）种 是指用于检定生物制品效力等菌(毒、虫)种。 3、工具用菌（毒、虫）种 是指在生物制品生产中作为工具使用的菌（毒、虫）种。
（二）、人工选育培养法
1、物理学方法 主要包括以下几个方面。
（1）温 度 ➢各种微生物都有其最适宜的生长繁殖温度，如果改变温度可引起发生变异，以 适应环境。再通过选择生产性能比较稳定的变异株，如巴斯德将炭疽杆菌培养 于42℃育成减毒株，用于预防注射；猪肺疫内蒙古系弱毒株也是经高温培养选 育的。的条件
➢菌（毒、虫）种是决定生物制品质量的重要因素，悬于培养好的菌（毒、 虫）种也是生物制品工作中最重要的一环。好的菌（毒、虫）种应具备如 下条件。
第二章 生物制品生产基本技术
强毒株→含海鸥牌洗衣粉培养基上传630代
羊链球菌弱毒菌株（F60） 马流产弱毒菌株（C355） 禽霍乱弱毒菌株（G190E40） 布鲁氏菌羊5号弱毒菌株 牛肺疫兔化弱毒株 牛瘟兔化弱毒株、猪瘟兔化弱毒株 羊痘弱毒株、鸭瘟弱毒株 马传贫驴白细胞弱毒株 鸡痘弱毒株 口蹄疫A型鼠化弱毒株、O型鼠化弱毒 株、ZB型弱毒株
3、寄生虫在抗原变异，抗原摹拟和寄生虫摄入宿主DNA和获得 宿主蛋白或以宿主抗原伪装自己方面也表现出非常复杂而有效的 免疫逃避机制。但是，任何一种寄生虫在宿主体内长期存活的免 疫逃避机制均未能完全搞清楚。仍是一个值得深入研究和探讨的 课题。
二、寄生虫疫苗的分类（category of parasite vaccine）
• 消毒：以物理或化学等方法杀灭物体上或介质中的病原微生物。
• 防腐：用物理或化学方法防止和抑制微生物生长繁殖。
• 热原：微生物的代谢产物，是一种致热性物质，是发生在注射给药后病人高热反应的根源。 这种致热物质被认为是微生物的一种内毒素，存在于细菌的细胞膜和固体膜之间。内毒素是 由磷脂、脂多糖和蛋白质所组成的复合物。由于此物质具有热稳定性，甚至用高压灭菌器或 细菌过滤后仍存在于水中。
源，高温灭菌区平行流热空气是自动循环使用 的，加热时所产生的部分温热空气由下部排风 机排出，由另一台小风机补充新鲜空气。）
主要用于针剂联动生产线上，适用于2-20mL安瓿瓶、 西林瓶、口服液瓶和其他药用玻璃瓶的灭菌干燥。
湿热灭菌设备
一、原理
利用饱和水蒸汽或沸水来杀灭细菌。当被灭菌物品置于高温高压的蒸汽介质中时，蒸汽遇冷 物品放出潜热，把被灭菌物品加热，温度上升到某一温度时，就有一些沾染在被灭菌物品上 的菌体蛋白质和核酸等一部分由氢键连接而成的结构受到破坏，尤其是细菌所依靠、新陈代 谢岁必须的蛋白质结构-酶，在高温和湿热条件下失去活性，最后导致微生物灭亡。
第02章 生物制品制备的一般步骤
方法：离心、膜过滤、自然沉降。
目的：将细胞碎片或未充分破碎的组织等杂质去掉。 （三）目的产物的分离纯化 除去可溶性杂质，同时富集目的产物的过程，称之为分
离纯化。这是生物制品制备的核心。
方法：沉淀技术、离心技术、过（超）滤技术、层析技术、 萃取技术、电泳技术等，是生物制品制备的常用技术。 但应注意，生物分子千差万别，不同的目的产物，由于其 物理、化学性质不同，生物学特性迥异，因此没有一个方法适 合于任何生物制品的分离纯化
SDS-PAGE测定蛋白质分子量
凝胶过滤法： 又称分子筛层析法
分子筛层析示意图
蛋白质洗脱体积与分子量的关系
将几种已知分子量的蛋白质混合溶液上柱洗脱，记录各种蛋白质的洗脱 体积。以分子量的对数为纵坐标，以洗脱体积为横坐标，作标准曲线。 待测蛋白质溶液在上述相同的层析条件下分离，记录其洗脱体积，然后 根据标准曲线计算其分子量。
四、蛋白质提取、纯化的一般步骤
1.选材： 制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。 原则：原材料来源充足；目标蛋白含量丰富；易于处理 和提取。 2.生物材料的破碎和预处理：常用的方法有组织匀浆法、
研磨、反复冻融、溶菌酶、高压破碎等。
目的：将目标蛋白以可溶态充分暴露出来，并与其他成 分分离。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
3.粗分离：将绝大多数杂质去掉的过程。方法多为离心、
离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确
估计和判断，因而实验结果常有很大的经验成份，实验重复性 较差，个人的实验技术水平和经验对实验结果有较大的影响。
三、蛋白质提取、纯化前的准备
在进行蛋白质的制备前，通常需要对以下几方面的内容加
以确定或预先了解。 ①明确实验目的和要求。科研、开发，还是要发现新的物 质。 ②通过文献调研和预备性实验，掌握目的蛋白质的理化性 质和生物学特性。如分子大小；溶解度；电荷；吸附性质；热 稳定性；对配体分子的生物学亲和力等。 ③建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备蛋白质的关 键。 ④确定可能的技术路线和实验方案，这是最困难的过程， 要求具有很高的综合知识和实验技术水平。
生物制品制造工艺
第十五章 生物制品制造工艺
第一节 生物制品的基本概念
生物制品（biological product）是应用普通的或 以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生 物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织 和液体等生物材料制备，用于人类疾病预防、治疗和 诊断的药品。
现代生物技术发展使生物制品在产品结构上发生 了很大变化，极大地扩展了生物制品的研究内容。
3、基因工程疫苗
基因工程疫苗 是指用重组DNA技术克隆并表达保 护性抗原基因，利用表达的抗原产物或重组体本身制 成的疫苗。
主要包括基因工程亚单位疫苗、基因工程载体疫 苗、核酸疫苗、基因缺失活疫苗及蛋白工程疫苗等。
4、合成肽疫苗
合成肽疫苗 是指用化学方法合成能够诱发机体产 生免疫保护的多肽制成的疫苗。
生物制品必须强调质量第一的原则。质量好的生物 制品必须具备两个重要条件：安全和有效。
生物制品的质量要求：世界卫生组织要求各国生产 的制品必须有专门检定机构负责成品的质量检定，检 定部门要有熟练的高级技术人员，精良的设备条件， 以保证检定工作的质量。未经专门检定部门正式发给 检定合格的制品，不准出品使用。
血液制品、抗毒素和类毒素等制品，需要进行纯度 检查或做鉴别试验。
4、分子量或分子大小测定
提纯的蛋白质制品，在必要时需测定其单体或裂解 片段的分子量及分子的大小；提纯的多糖体菌苗需测 定多糖体的分子大小及其相对含量，常用的方法有凝 胶层析法、SDS － PAGE法和超速离心分析法。
5、防腐剂含量测定
1、常规疫苗
常规疫苗有活疫苗和死疫苗两类：
活疫苗是指用人工定向变异的方法或从自然界筛选 出来的毒力高度减弱或基本无毒的活的微生物制成的 预防制剂。
死疫苗是指用物理或化学方法杀死或灭活培养增 殖的标准微生物株制成的预防制剂。
第一节 生物制品的基本概念
生物制品（biological product）是应用普通的或 以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生 物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织 和液体等生物材料制备，用于人类疾病预防、治疗和 诊断的药品。
现代生物技术发展使生物制品在产品结构上发生 了很大变化，极大地扩展了生物制品的研究内容。
3、基因工程疫苗
基因工程疫苗 是指用重组DNA技术克隆并表达保 护性抗原基因，利用表达的抗原产物或重组体本身制 成的疫苗。
主要包括基因工程亚单位疫苗、基因工程载体疫 苗、核酸疫苗、基因缺失活疫苗及蛋白工程疫苗等。
4、合成肽疫苗
合成肽疫苗 是指用化学方法合成能够诱发机体产 生免疫保护的多肽制成的疫苗。
生物制品必须强调质量第一的原则。质量好的生物 制品必须具备两个重要条件：安全和有效。
生物制品的质量要求：世界卫生组织要求各国生产 的制品必须有专门检定机构负责成品的质量检定，检 定部门要有熟练的高级技术人员，精良的设备条件， 以保证检定工作的质量。未经专门检定部门正式发给 检定合格的制品，不准出品使用。
血液制品、抗毒素和类毒素等制品，需要进行纯度 检查或做鉴别试验。
4、分子量或分子大小测定
提纯的蛋白质制品，在必要时需测定其单体或裂解 片段的分子量及分子的大小；提纯的多糖体菌苗需测 定多糖体的分子大小及其相对含量，常用的方法有凝 胶层析法、SDS － PAGE法和超速离心分析法。
5、防腐剂含量测定
1、常规疫苗
常规疫苗有活疫苗和死疫苗两类：
活疫苗是指用人工定向变异的方法或从自然界筛选 出来的毒力高度减弱或基本无毒的活的微生物制成的 预防制剂。
死疫苗是指用物理或化学方法杀死或灭活培养增 殖的标准微生物株制成的预防制剂。
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植物组织培养的基本步骤
1.材料的采集 2.材料的消毒 3.制备外植体 4.接种和培养 5.根的诱导
6.组培苗的
练苗移植
愈伤组织(callus)
在人工培养基上由外植体上形成的一团 无序生长状态的薄壁细胞。
外植体（Explants）
由活植物体上切取下来的可以用于组织 培养的组织或器官
初代培养（Primary culture）
两个主要的哺乳动物细胞表达系统
瞬时表达系统
稳定表达系统
瞬时基因表达系统是一个简单、有效的 外源蛋白表达手段，其表达水平最高可 以达到稳定细胞表达水平。蛋白质是由 未整合的、不复制的质粒DNA产生的， 这样使得蛋白质表达的时间相对短，只 有48h到7天。
稳定表达系统需要得到稳定转化的细 胞株，需要1～2个月的时间，在稳定 转化的细胞中，DNA被整合到染色体 中，这使得重组蛋白质产物可以一代 接一代地产生。
植物组织与细胞培养
植物组织培养与细胞培养的概念
组织培养：是指从机体内提取出组织或细 胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培 养，使之生存或生长成组织。 细胞培养：是指动植物细胞在体外条件下的 存活或生长，此时细胞不再形成组织。
植物组织培养过程
离体的植物 脱分化 器官、组织、 细胞 愈 再分化 伤 组 织 根 植 物 体
病毒载体
1 .反转录病毒（Retrovirus, RTV） 2. 腺病毒(Adenovirus, AV) 3. 腺病毒相关病毒 （Adeno-associated virus, AAV） 4. 单显性疱疹病毒 （Herpes simplex virus, HSV） 5. 痘病毒（Poxvirus, PV）
有机溶剂沉淀法
向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质 的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。 主要机理： (1)亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数， 使得溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。 (2)水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓 度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度， 降低了它的亲水性，导致脱水凝集。
2. DEAE-Dextran法
将DNA溶液溶解在TBS〔含Tris、 K＋、Na＋等〕缓冲液中，与二乙胺乙 基葡萄糖（DEAE-Dextran）混合，滴 加到受体细胞表面，供体DNA便会进 入受体细胞。
3. 脂质体转染法
脂质体是由磷脂、胆固醇或其它脂 类形成的一种可以高效包装 DNA 的人造 单层膜。其结构和性质与细胞膜极为相 似，因而二者易于融合， DNA 则由于细 胞的内吞作用而进入细胞。
2.生物制品制备基本技术
一般生物制品的制备方法 生物制品的分离纯化方法 生物制品质量检测与控制 生物制品的保存与运输
动物细胞、植物组织、 微生物培养基本技术
动物细胞培养基本概念与技术
1.动物细胞的生长与培养
动物细胞的特点
进化程度高 结构、形态、成分复杂 细胞间连接形式多样 生长相对缓慢 功能全面
植物要注意生长的季节 动物要注意年龄和性别 微生物要选取对数生长期
原料的预处理
动物：去除结缔组织、脂肪组织等， 并迅速冷冻 植物：去除不用的部分，保鲜处理 微生物：及时将菌细胞与培养液分开， 并保鲜处理
原料的保存
适用于所有的生物原料， 常用-40℃
冷冻法 有机溶剂脱水法 防腐剂保鲜
指外植体的最初培养
继代培养（Subculture）
将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中， 这种反复多次移植的培养，称为继代培养
分化培养
壮苗与生根
出瓶移栽
出瓶嫁接
微生物培养
细菌生长曲线
迟缓期 对数生长期 稳定生长期
衰亡期
微生物生长繁殖的控制
杀菌 彻底杀灭－－灭菌 溶菌 杀灭 部分灭菌－－消毒 控制害菌 抑制霉腐微生物－－防腐
培养细胞的生长和增殖过程
细胞培养是指从体内组织取出细胞 在体外模拟体内环境下，使其生长 繁殖，并维持其结构和功能的一种 培养技术。细胞培养的培养物可以
是单个细胞，也可以是细胞群
过程：
动物组织细胞间隙中 含有一定量的弹性纤 维等蛋白质，将细胞 网络起来形成具有一 定弹性和韧性的组织 和器官。
动物胚胎或幼龄动 物的组织、器官
极高的速度带入人体外的细胞内或直
接带入人体内。
6. 超声波法
超声波可对细胞膜直接作用，使 细胞膜的通透性增高， DNA 可通过扩 并且超声波可 通过培养瓶瓶壁发挥作用。
7. 受体介导法
此方法依赖于受体和配体间的特异 结合所介导的细胞内吞作用而将外源基 因导入细胞。一般是将DNA与多聚物 （如多聚赖氨酸）结合而浓缩，再结合 以一定的配体即可用于基因转移。不过 效果仍不理想。
胰蛋白酶 （分解弹性纤维）
细胞悬浮液 10代细胞 50代细胞
原代培养
细胞株 传代培养
细胞系
无限传代
接触抑制
指数生长期
培养细胞的 一代生存期
潜伏期
停滞期
体外培养细胞的种类
细胞系
细胞株
二倍体细胞
遗传缺陷细胞
肿瘤细胞
动物细胞基因表达系统
具有复杂的翻译后加工系统
糖基化以及二硫键在合成和分泌过
程中自然而然的正确形成
质 粒 穿 梭 载 体
质粒的转染（transfection）方法
1. 磷酸钙共沉淀法 2. DEAE-Dextran法 3. 脂质体转染法 4. 电穿孔法（electroporation） 5. 基因枪法 6. 超声波法 7. 受体介导法
1.磷酸钙共沉淀法
把供体DNA溶解在HEPES溶液中， 然 后 缓 慢 加 入 Na2HPO4-CaCl2 溶 液 ， 供体 DNA 便被包裹在磷酸钙溶液中， 这种共沉淀可被细胞吞噬，外源基因 便导入了受体细胞。
常用丙酮
常用乙醇、苯酚、甘油
原材料的提取
磨切法 压力法 反复冻融法 超声破碎法 酶破碎法
渗透压 高压 减压
提取时要注意
采用缓冲系统
添加保护剂
抑制水解酶
其他
防紫外线、强酸、强碱、 高温、高频振荡、氧化
2. 生物制品的分离纯化方法
细胞破碎 固液相分离 浓缩与初步纯化 高度纯化 蛋白质类制品的的分离纯化方法
亲和层析
利用生物大分子特异性亲和力而设计的层析技术称为 亲和层析。 在亲和层析中起可逆结合的特异性物质称为配基 与配基结合的层析介质称为载体 亲和层析的设计原理和过程： 1)配基固定化 2)吸附样品 3)样品洗脱
L 配基 ＋ L
＋
S 样品 L
L
S
配基固定化 L ＋ S L S ＋ 杂质
吸附样品 L S L ＋ S
泵
色谱柱
溶剂
3. 生物制品质量检测与控制
生物制品质量检测包括
毒性试验
原材料
安全性
防腐剂试验
安全试验(DNA、致敏原、重金属 浓度测定 活菌率或病毒滴度测定
培养过程
纯化工艺 目的产品
效力检测
动物保护率试验 免疫抗体滴度测定
稳定性试验
生物制品的管理与控制
生物制品国家管理6项基本职能
1.完整的生物制品审批程序和审批标准的法规文件； 2.审批结论要以实验和临床试验数据为依据； 3.国家质控当局对疫苗和生物制品出厂销售实行国家批 签发制度； 4.要有对疫苗和生物制品进行质量评价的法定的实验检 定机构和实验实施； 5.对生物制品生产企业实施GMP定期检查； 6.对生物制品有效性和不良反应进行上市后检测。
产生正确折叠和完全生物活性的蛋
白质
分泌型哺乳动物细胞表达系统
哺乳动物细胞表达系统可以通过设计，使外源 重组蛋白直接分泌到培养基中。
N末端的信号肽，其作用是起始新生肽链插入到内质 网中，此信号肽在分泌过程中被切除，从而产生具 正确N端的重组蛋白质。
从内质网到高尔基体再到细胞外空间的分泌过程产 生糖基化和防止蛋白被胞内蛋白酶水解。分泌过程 也使蛋白质二硫键正确配对和正确折叠。
X＋OH－ X＋
Ｘ＋
nX＋ X＋
X＋ X＋
X＋
Z＋
Z＋
X＋
X＋ X＋
X＋
X＋
Y＋
Z＋
Z＋
＋ Z Y＋
X＋ Z＋
X＋ Ｘ＋ Z＋ X＋ ＋ X ＋ ＋ Z X X＋ Y＋Y＋
Ｚ Ｚ＋
＋
X＋ X＋ 平衡上样 吸附 洗杂
洗脱
凝胶层析
将样品化合物通过一定孔径的凝胶固定相，用于流经体 积的差异，使不同分子量的组成得以分离的层析。
结晶法
改变溶液的某些条件，使其中的溶质以结晶态析出的 过程称作结晶。 （一）盐析结晶法 通过向结晶溶液中引入中性盐，逐渐降低溶质的溶解 度使其过饱和，经过一定时间后晶体形成并逐渐长大。 （二）透析结晶 （三）有机溶剂结晶 （四）等电点结晶 （五）温度诱导结晶
吸附法
吸附是物质分子在两相界面上浓度的增加。 由于界面上的分子同时受到不相等的两相分子的作用 力，因此界面分子的力场是不饱和的，即存在一种固 体的表面力，它能从外界吸附分子、原子或离子，并 在吸附剂表面附近形成多分子层或单分子层。我们称 物质从流动性（气或液相）浓缩到固体表面从而达到 分离的过程称为吸附作用。把在表面上能发生吸附作 用的固体称为吸附剂；将被吸附的物质称为吸附物。
预处理
上样
吸附
洗杂
洗脱
再生
离子交换法
离子交换法是利用溶液中各种带电粒子与离子 交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作 方法。带电粒子与离子交换剂间的作用力是静 电力。它们结合是可逆的，在一定条件下能够 结合，条件改变后也能被释放出来。离子交换 剂由惰性的不溶性载体，功能基团和平衡离子 组成。