第6章蛋白质工程
现代生物技术第六章 蛋白质工程
金属硫蛋白的作用与结构特点
金属硫蛋白（metallothionein，简称MT）是一类 小分子量的球蛋白，大量存在于哺乳动物体内，其 他低等动物如鱼、螃蟹、海胆中也有分布，在植物 和微生物中也发现有各种不同亚型的金属硫蛋白。 这类蛋白质分子中半胱氨酸的含且极高，约占全部 氨基酸总量的1/3左右，在分子中以与金属原子相结 合的方式存在。金属硫蛋白参与微量元素锌、铜等 的贮存、运输和代谢，参与重金属元素铜、汞、铅 等的解毒以及拮抗电离辐射和清除羟基游离基等， 在改善健康等诸多方面发挥着重要的作用。
分子设计 氨基酸序列 蛋白质 三维结构 折叠 预期功能 生物功能
DNA
mRNA 转录 翻译
多肽链
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
二、蛋白质工程的基本原理
基因工程与蛋白质工程的区别：
基因工程通过分离目的基因重组DNA分子，使目的 基因更换宿主得以异体表达，从而创造新类型，但 这只能合成自然界固有的蛋白质。 蛋白质工程则是运用基因工程的DNA重组技术，将 克隆后的基因编码序列加以改造，或者人工合成新 的基因，再将上述基因通过载体引入适宜的宿主系 统内加以表达，从而产生数量几乎不受限制、有特 定性能的“突变型”蛋白质分子，甚至全新的蛋白 质分子。
将金属硫蛋白的β结构域改造成为α结构域需 要利用蛋白质工程中的分子设计技术，对分 子改造的设计思想进行可行性分析，并提出 具体的改造方案。首先，应在大量生物学实 验的基础上，仔细分析金属硫蛋白的结构特 点和生物功能，并利用贮存于计算机中的生 物大分子信息数据库和序列分析、分子模型 等计算机软件，确定金属硫蛋白的氨基酸序 列、一级结构和高级结构。
金属硫蛋白α结构域多倍体的构建 用MT的α结构域二倍体代替天然MT，有可能使其结 合重金属能力提高一倍。我们知道，无论是天然MT， 还是人工构建MT的α结构域二倍体，在将其转人植 物中时，都需要用环状的DNA质粒作载体。如果能把 MT的α结构域二倍体首尾相接，构建MT的α结构域 多倍体，将有可能使表达产物成倍增加，消除镉金 属的能力也就会相应的成倍提高。 根据以上设想，可以利用基因工程的方法，构建金 属硫蛋白α结构域多倍体。
选修
《现代生物技术概论》任课教师介绍曾千春，男，1964年11月生，博士，教授，云南省第7批中青年学术技术带头人。
先后在湖南农学院植物保护专业，云南农业大学植物病理专业和四川农业大学作物遗传育种专业 (中国科学院遗传所联合培养)毕业，获学士、硕士和博士学位。
2003年中国科学院遗传发育所分子生物学博士后出站；2004年享受云南省人事厅高层次人才补贴与工作经费；2008-2011年美国佛罗里达大学食品与农业科学学院访问学者。
1987年参加工作，2007年任职教授。
云南农业大学作物遗传育种专业、生物化学与分子生物学硕士生导师，作物遗传育种专业博士生指导小组成员。
东亚与东南亚热带生物资源研究与发展（Eastern Tropical Bionet, ETB）中国分会理事，美国离体生物学会会员，国家自然科学基金委农学基础与作物学学科同行评议专家。
主讲“基础生物化学”，“植物生理学”和“蛋白质与酶工程”。
全校公共选修课程“现代生物技术概论”和“转基因与食品安全”。
主要从事杂交水稻生物技术育种、甘蔗转基因和植物病原真菌研究，主持或参加完成国家973、863、国家自然基金、国家科技支撑计划等科研项多项。
作为执笔人申报的“生物化学与分子生物学”硕士点同行专家评议通过率100％，2006年1月获得国务院学位委员会正式批准。
曾获云南农业大学优秀教师称号，获云南省自然科学三等奖1项，发表论文45篇，参编专著2部。
《现代生物技术概论》课程介绍随着现代生物技术的发展，转基因食品、加酶洗衣粉等现代生物技术产品已经走进了人们的日常生活。
愈来愈多的同学希望了解（掌握）生物技术产生的简要历程，生物技术的基本知识，了解生物技术发展对国家政治、军事、经济、文化、生活及其他科学技术发展的影响。
本课程包括两大部分。
第一部分包括生命的中心法则、基因工程、细胞工程、酶工程和蛋白质工程等基础生物技术知识，较全面地介绍生物技术五大工程的基本原理和知识。
第六章1分子生物学改造
一、定点突变
利用分子生物学技术，在体外通过碱基取代、插入 或缺失可以使基因DNA序列中任何一个特定的碱基 发生改变。这种体外特异性改变某个碱基的技术， 称谓定点突变（site directed mutagenesis）。
定点突变具有简单易行、重复性高等优点，现已发 展成为基因操作的一种技术。这种技术不仅适用于 基因结构与功能的研究，还可通过改变基因的密码 子来改造天然蛋白质。
(%) 100 100
96 106
0 95 0
0
(℃) 41.9 41.9 46.7 48.3 52.9 57.6 58.9 65.9
wtα：野生型T4溶菌酶；pwt:假野生型酶；A－F：六种设计的半胱氨酸 变体；Tm:熔点温度
将Asn和Gln转换成其他氨基酸
当蛋白质暴露于高温时:
天冬酰胺（Asn）
而将2个Asn分别换为苏氨酸(Thr)和异亮氨酸(Ile)，其半衰 期则延长。
酵母菌磷酸丙糖异构酶及其变体的热稳定性
氨基酸位点
酶
14
78
半衰期（min）
野生型 Asn
Asn
13
变体A Asn
Thr
17
变体B Asn
Ile
16
变体C Thr
Ile
25
变体D Asp
Asn
天冬氨酸(Asp) + NH3
谷氨酰胺(Gln)
谷氨酸(Glu) + NH3
导致肽链折叠的局部的改变,可能影响其活性。
如酵母的丙糖磷酸异构酶是由两个相同的亚基组成的二聚体， 每个亚基都含有两个Asn残基，均位于两个亚基相互接触的 表面上，可能与该酶的热稳定性有关。
生物化学蛋白质章节考点总结
第三章蛋白质第一节蛋白质概论蛋白质是所有生物中非常重要的结构分子和功能分子，几乎所有的生命现象和生物功能都是蛋白质作用的结果，因此，蛋白质是现代生物技术，尤其是基因工程，蛋白质工程、酶工程等研究的重点和归宿点。
一、蛋白质的化学组成与分类1、元素组成碳50% 氢7% 氧23% 氮16% 硫0-3% 微量的磷、铁、铜、碘、锌、钼凯氏定氮：平均含氮16%，粗蛋白质含量=蛋白氮³6.252、氨基酸组成从化学结构上看，蛋白质是由20种L-型α氨基酸组成的长链分子。
3、分类（1）、按组成：简单蛋白：完全由氨基酸组成结合蛋白：除蛋白外还有非蛋白成分（辅基）详细分类，P 75 表3-1，表3-2。
（注意辅基的组成）。
（2）、按分子外形的对称程度：球状蛋白质：分子对称，外形接近球状，溶解度好，能结晶，大多数蛋白质属此类。
纤维状蛋白质：对称性差，分子类似细棒或纤维状。
（3）、功能分：酶、运输蛋白、营养和贮存蛋白、激素、受体蛋白、运动蛋白、结构蛋白、防御蛋白。
4、蛋白质在生物体内的分布含量(干重) 微生物50-80%人体45%一般细胞50%种类大肠杆菌3000种人体10万种生物界1010-1012１二、蛋白质分子大小与分子量蛋白质是由20种基本aa组成的多聚物，aa数目由几个到成百上千个，分子量从几千到几千万。
一般情况下，少于50个aa的低分子量aa多聚物称为肽，寡肽或生物活性肽，有时也罕称多肽。
多于50个aa 的称为蛋白质。
但有时也把含有一条肽链的蛋白质不严谨地称为多肽。
此时，多肽一词着重于结构意义，而蛋白质原则强调了其功能意义。
P 76 表3-3 （注意：单体蛋白、寡聚蛋白；残基数、肽链数。
）蛋白质分子量= aa数目*110对于任一给定的蛋白质，它的所有分子在氨基酸组成、顺序、肽链长度、分子量等方面都是相同的，均一性。
三、蛋白质分子的构象与结构层次蛋白质分子是由氨基酸首尾连接而成的共价多肽链，每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构，这种空间结构称为蛋白质的（天然）构象。
蛋白质工程教学计划
蛋白质工程教学计划一、教学目标本课程的教学目标是通过系统的理论教学和实践操作，使学生掌握蛋白质工程的基本原理、方法和技术，具备独立设计和构建蛋白质工程相关项目的能力，为学生将来从事相关科研和实际应用工作打下坚实基础。
二、教学内容1. 蛋白质结构与功能- 蛋白质的结构、功能和生物学意义- 蛋白质结构的研究方法- 蛋白质与其他生物分子的相互作用2. 蛋白质工程基础- 基因工程与蛋白质工程的关系- 蛋白质表达和纯化技术- 蛋白质修饰和功能改造技术3. 蛋白质设计与构建- 蛋白质结构预测与模拟- 蛋白质工程方法和技术- 蛋白质工程的应用领域4. 实验操作与项目设计- 蛋白质表达系统的构建- 蛋白质纯化和鉴定技术- 蛋白质功能改造和应用研究三、教学方法1. 理论教学采用课堂讲授、案例分析和讨论等多种方法，使学生掌握蛋白质工程的基本理论知识。
2. 实践操作实验室操作是蛋白质工程课程的重要组成部分，通过实验操作，使学生掌握蛋白质表达、纯化和功能改造的基本技术。
3. 项目设计鼓励学生在课程学习的基础上，进行小型的蛋白质工程项目设计，培养学生的科研和实践能力。
四、教学手段1. 教学设备- 实验室设备：包括PCR仪、电泳仪、分光光度计、离心机等。
- 计算机及软件：用于蛋白质结构预测与模拟，以及数据分析和图表制作。
2. 教学资料- 教材：选用蛋白质工程相关的专业教材。
- 课件：制作蛋白质工程相关的PPT课件，便于课堂教学和学生学习。
3. 实验材料- 实验材料：包括蛋白质表达载体、蛋白质纯化试剂盒、蛋白质功能改造试剂等。
五、教学过程1. 开设理论课程本课程会分为多个模块进行理论课教学，包括蛋白质结构与功能、蛋白质工程基础、蛋白质设计与构建等内容。
2. 安排实验操作在理论教学的基础上，安排相关的实验操作课程，包括蛋白质表达和纯化实验、蛋白质功能改造实验等，使学生能够将理论知识应用到实际操作中。
3. 项目设计鼓励学生进行小型的蛋白质工程项目设计，可以是文献综述、实验设计或者理论模拟等，培养学生的科研能力和创新思维。
09135蛋白质工程
《蛋白质工程》课程（09135）教学大纲一、课程基本信息课程中文名称：蛋白质工程课程代码：09135学分与学时：2学分38学时课程性质：专业选修授课对象：生物工程专业二、本课程教学目标与任务蛋白质工程是随着生物化学、分子生物学、结构生物学、晶体学和计算机技术等的迅猛发展而诞生的，也与基因组学、蛋白质组学、生物信息学等的发展密切相关，是融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。
由于蛋白质工程学科的边缘性，所以本课程在介绍蛋白质基本内容的同时，兼顾学科发展动向，旨在使学生了解现代蛋白质工程理论的新进展并为相关学科提供知识和技术。
通过本课程的学习，使学生掌握蛋白质工程的基本理论、基础知识、主要研究方法和技术以及生物信息学和现代生物技术在蛋白质工程上的应用及典型研究实例，熟悉从事蛋白质工程的重要方法和途径。
努力培养学生具有科学思维方式、启发学生科学思维能力和勇于探索，善于思考、分析问题的能力，激发学生的学习热情，为未来的学习和工作奠定坚实的理论和实践基础。
三、学时安排四、课程教学内容与基本要求第一章绪论教学目的：使学生了解蛋白质工程的基本概况。
基本要求：理解掌握蛋白质工程研究内容和蛋白质工程设计的原理。
重点与难点：蛋白质工程的原理，蛋白质工程的程序和操作方法。
教学方法：课堂讲授为主。
主要内容：一、蛋白质工程的物质基础二、蛋白质工程的原理三、蛋白质工程的程序和操作方法四、蛋白质工程的产生与发展五、蛋白质工程的应用领域第二章蛋白质结构基础教学目的：使学生理解蛋白质的结构与功能及二者之间的关系，理解蛋白质多肽链的折叠方式。
基本要求：要求掌握蛋白质各个结构层次的组成、基本特点和维持结构的作用力、结构与功能的关系。
蛋白质的变性和复性、蛋白质的折叠以及分子伴侣和折叠酶在蛋白质折叠中的作用。
重点与难点：重点：蛋白质的结构与功能，蛋白质结构与功能的关系。
难点：多肽链的折叠。
蛋白质分子设计
h
12
二、蛋白质设计原理
①内核假设。所谓内核是指蛋白质在进化中保守的 内部区域。在大多数情况，内核由氢键连接的二 级结构单元组成
②所有蛋白质内部都是密堆积(很少有空穴大到可以 结合一个水分子或惰性气体)，并且没有重叠。
③所有内部的氢键都是最大满足的(主链及侧链)
h
13
④ 疏水及亲水基团需要合理地分布在溶剂可及表面 及不可及表面
⑤ 在金属蛋白中，配位残基的替换要满足金属配位 几何，符合正确的键长、键角及整体的几何
⑥ 对于金属蛋白，大部分配基含有多于一个 与金属 作用或形成氢键的基团。其余形成围绕金属中心 的氢键网络，这涉及与蛋白质主链、侧链或水分 子的相互作用
⑦ 最优的氨基酸侧链几何排列
⑧ 结构及功能的专一性。形成独特的结构，独特的 分子间相互作用是生物相互作用及反应的标志
h
14
蛋白质设计的目标及解决办法
设计目标
热稳定性 对氧化的稳定性 对重金属的稳定性 pH稳定性 提高酶学性质
解决办法
引入二硫桥，增加内氢键数目，改善内疏水 堆积，增加表面盐桥
把Cys转换为Ala或Ser，把Met转换为Gln、 Val、Ile或Leu，把Trp转换为Phe或Tyr
• 在未知立体结构的情形下借助于一级结构 的序列信息及生物化学性质所进行的分子 设计工作
h
6
蛋白质分子设计程序
• 蛋白质分子设计程序：各种蛋白质结构 预测和分子设计程序
• 按照蛋白质分子设计的层次分为序列分 析、二级结构预测、同源蛋白质结构预 测、蛋白质突变体结构预测、蛋白质的 性能预测和蛋白质分子设计六个部分
蛋白质工程的原理和应用高二生物优质课件(人教版2019选择性必修3)
科学家解析了多管水母绿色荧光蛋白的晶体结构，并利用计算机进行辅助设计，在 此基础上再采用定点突变的技术将绿色荧光蛋白发光基团正下方的第203位的苏氨酸替 换为酪氨酸，从而获得了一种新的绿色荧光蛋白的衍生物——黄色荧光蛋白。
问题3: 这种对现有蛋白质进行改造的技术与基因工程技术一样吗？
天冬氨酸激酶
+
二氢吡啶二羧酸合成酶
352位的苏氨酸 变成异亮氨酸
调控 赖氨酸合成
提 高
提高5倍
达到一定浓度 抑制
两种酶的活性 提高 限制
赖氨酸含量
104位的天冬酰 胺变成异亮氨酸
提 提高2倍 高
问题5: 蛋白质工程是怎 样进行的呢？
二、蛋白质工程的基本原理
合作探究一：请同学们自主阅读教材P94，小组合作思考讨论完成问题。
C.②③①④ D.④②①③
问题9: 蛋白质工程有哪些运用呢？请举例。
四、蛋白质工程的运用
合作探究二：请同学们自主阅读教材P95，小组合作思考讨论总结蛋白质 工程可以应用于哪些领域，有哪些案例。
应用
实例
医药工业方面
其他工业方面 农业方面
四、蛋白质工程的运用
四、蛋白质工程的运用
（一）医药工业方面： 定点突变 1.实例二：研发速效胰岛素类似物
二、蛋白质工程的基本原理
蛋白质工程基本思路的应用
某多肽链的一段氨基酸序列是：
丙氨酸
色氨酸
赖氨酸
谷氨酸
苯丙 氨酸
问题7: 确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？
确定目的基因的碱基序列后，可以根据人类的需要改造它，通过人工合成的方法获取。
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Serine (Ser)
O
NH 3
蛋氨酸 Methionine
(Met)
天冬酰胺 Asparagine
(Asn)
HO
CH2 CH COO 酪氨酸 H2N C CH2 CH2 CH COO
NH 3
Tyrosine (Tyr) O
NH 3
谷氨酰胺 Glutamine
(Gln)
HS CH2 CH COO 半胱氨酸
第六章 蛋白质工程
蛋白质立体结构与复杂生
物功能的关系
蓝图
蛋白质组学
基因的定位诱变技术 工具
1982年，Winter等首次报道了通过基因定位诱变获得 改性酪氨酸tRNA合成酶 ；
1983年，Ulmer在“Science”发表 “Protein Engineering”（蛋白质工程）蛋专白论质工程诞生的标志
蛋白质的生物学重要性
1. 蛋白质是生物体的重要组成成分 2. 蛋白质具有重要的生物学功能
1）作为生物催化剂 2）代谢调节作用 3）免疫保护作用 4）物质的转运和存储 5）运动与支持作用 6）参与细胞间信息传递 3. 氧化供能
一 蛋白质结构的组成及性质
蛋白质的元素组成 主要有C、H、O、N和S。 有些蛋白质含有少量P或金属元素
பைடு நூலகம்
主要功能:
H2O2 2H2O
2GSH
GSH过氧 化物酶
GSSG
NADP+
GSH还原酶
NADPH+H+
肽类激素及神经肽 •肽类激素：如促甲状腺素释放激素（TRH）
CH COO NH 3
甘氨酸 Glycine(Gly)
丙氨酸 Alanine (Ala)
H3C CH2 CH
H3C
CH COO NH 3
CH2 CH COO
缬氨酸 Valine (Val)
NH 3 COO
亮氨酸 Leucine (Leu)
H2N CH
H2C
CH2
C H2
异亮氨酸 Isoleucine (Ile)
4. 碱性氨基酸
NH 2CH2CH2CH2CH2 CH COO NH 3
赖氨酸 Lysine (Lys)
NH 2CNHCH 2CH2CH2 CH COO
NH
NH 3
精氨酸 Arginine (Arg)
HC C CH2 CH COO
N NH
NH 3
C H
组氨酸 Histidine (His)
习惯分类方法 1. 芳香族氨基酸：Trp、Tyr、Phe 2. 含羟基氨基酸：Ser、Thr、Tyr 3. 含硫氨基酸：Cys、Met 4. 杂环族氨基酸：His 5. 杂环族亚氨基酸：Pro 6. 支链氨基酸：Val、Leu、Ile
几种特殊氨基酸
Gly：无手性碳原子。 Pro：为环状亚氨基酸。 Cys：可形成二硫键。
CH2 CH2
CH2
CHCOONH2+
COOH
2 CH CH2 SH
NH 2
Cys
二硫键
COOH
NH 2
CH CH2 S S CH2 CH
2H NH2
胱氨酸
COOH
修饰氨基酸： 蛋白质合成后通过修饰加工生成的氨基
COO-
CHRH3
C +NH3
H
丙甘氨氨酸酸
L-氨基酸的通式
氨基酸的分类
1. 非极性疏水性氨基酸 2. 极性中性氨基酸 3. 酸性氨基酸 4. 碱性氨基酸
1. 非极性疏水性氨基酸
H
H3C
H3C CH
H3C H3C
CH CH2 H3C
CH COO NH 3
CH COO NH 3
CH COO NH 3
Fe、Cu、Zn、Mn、Co、Mo，个别蛋 白质还含有 I 。
蛋白质元素组成的特点 蛋白质的含氮量平均为16％。
通过样品含氮量计算蛋白质含量的公式：
蛋白质含量 ( g % ) = 含氮量( g % ) × 6.25
氨基酸 ——蛋白质的基本组成单位
存 在 自 然 界 中 的 氨 基 酸 有 300 余 种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有 20种，且均属 L--氨基酸（甘氨酸 除外）。
苯丙氨酸 Phenylalanine
(Phe)
脯氨酸 Proline (Pro)
2. 极性中性氨基酸
C CH2 CH N H
CH COO NH 3
HO CH2 CH COO
NH 3
色氨酸
CH3SCH2CH2 CH COO
Tryptophan (Try)
NH 3
丝氨酸
H2N C CH2 CH COO
什么是蛋白质工程？
蛋白质工程的内容：改造现有蛋白质；制造新型蛋白质
蛋白质工程的目的：生产性能比自然界存在的天然蛋 白质更加优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质
第一节 蛋白质的基础知识
蛋 白 质 (protein) 是 由 许 多 氨 基 酸 (amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子 含氮化合物。
酸。没有相应的编码。如：胱氨酸、羟脯氨 酸（Hyp）、羟赖氨酸（Hyl）。
非生蛋白氨基酸： 蛋白质中不存在的氨基酸。如：瓜氨酸、
鸟氨酸、同型半胱氨酸，是代谢途径中产生 的。
氨基酸的理化性质
1. 两性解离及等电点 2. 紫外吸收 3. 茚三酮反应
肽
（一）肽(peptide) * 肽键(peptide bond)：是由一个氨基
（carboxyl terminal） • 主链和侧链
多肽链
多肽链 :由许多氨基酸按一定的排列顺序通 过肽键相连而成。
酰胺键 :一个氨基酸的氨基与另一氨基酸的 羧基缩合失去一分子水。
多肽链
几种生物活性肽
1. 谷胱甘肽(glutathione, GSH) 结构:
• 谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽 • 谷氨酸的-羧基形成肽键 • －SH为活性基团 • 为酸性肽 • 是体内重要的还原剂
NH 3
Cysteine (Cys)
H3C CH CH COO
苏氨酸 Threonine
HO NH3
(Thr)
3. 酸性氨基酸
OOC CH2 CH COO NH 3
天冬氨酸 Aspartic acid (Asp)
OOC CH2 CH2 CH COO
NH 3
谷氨酸 Glutamic acid (Glu)
酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基 脱水缩合而形成的化学键。
R1 H2N C C
HO
H
OH + H N C COOH
H R2
H2O
R1
HH
H2N C C N C COOH
HO
R2
肽键
• 多肽链(polypeptide chain) • 二肽，三肽…… • 寡肽(oligopeptide)，多肽(polypeptide) • 氨基酸残基(residue) • 氨基末端（amino terminal）和羧基末端