PCR原理、技术及常见问题分析
PCR原理及注意事项
PCR一、PCR的原理PCR;Polymerase Chain Reaction;聚合酶链式反应;由Kary Mullis博士在1985年于美国的PE-Cetus公司工作期间发明..该技术基本原理如下：在模板DNA、primers和4种dNTPs存在下;依赖于DNA polymerase的酶促合成反应..DNA polymerase以单链DNA为模板;借助一小段双链DNA来启动合成;通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合;形成部分双链..在适宜的温度和环境下;DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端退火;并以此为起始点;沿模板5´→3´方向延伸;合成一条新的DNA互补链的过程并依次循环..1.PCR反应的基本成分包括：Templates DNA待扩增DNA、Primers、4种脱氧核苷酸dNTPs、DNA聚合酶和适宜的Buffer对于高GC含量的模板有时加入3% DMSO..类似于DNA的天然复制过程;其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物..2.PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①.模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后;使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离;成为单链;以便它与引物结合;为下轮反应做准备；②.模板DNA与引物的退火复性：模板DNA经加热变性成单链后;温度降至55℃或60℃左右;引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③.引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq DNA聚合酶或Phusion DNA聚合酶或Pfu DNA聚合酶的作用下;以dNTPs为原料;靶序列为模板;按碱基互补配对半保留复制原理;合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链;新链又可成为下次循环的模板..3.PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行;使DNA扩增量呈指数上升..反应最终的DNA 扩增量可用Y＝1＋X n计算..Y代表DNA片段扩增后的拷贝数;X表示实际扩增效率;平均约为75%;n 代表循环次数..平均扩增效率的理论值为100%;但在实际反应中平均效率达不到理论值..如果进行30个Cycles;实际扩增倍数往往为106-107理论上以Y=2n计算;为109..反应初期;靶序列DNA片段的增加呈指数形式;随着PCR产物的逐渐积累;被扩增的DNA 片段不再呈指数增加;而进入线性增长期或静止期;即出现“停滞效应”;这种效应称平台期..PCR 扩增效率及DNA聚合酶、PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素与之都有关..大多数情况下;平台期的产生不可避免..二、PCR的种类1.常规PCR2.反转录PCRreverse transcription;RT- PCR先在逆转录酶的作用下;以mRNA为模板;Primer 1常用OligodT引物为引物合成与其互补的cDNAcomplementary DNA;再以cDNA为模板;Primer 2为引物进行PCR反应..常用逆转录酶有AMVavian myeloblastosis virus;酶活最适温度42℃和MMLVmoloney murine leukemia virus; 酶活最适温度37℃..RT-PCR是一种快速简便敏感度极高的检测mRNA转录量或蛋白表达水平的方法..半定量RT-PCR以组织中普遍表达且表达量恒定的管家基因的mRNA表达为对照;将目的基因mRNA 与之一起逆转录成各自cDNA;最后计算它们的比值来达到对mRNA表达半定量的目的..3.实时荧光定量PCRQuantitative Real-time PCR;Q-RT-PCR在PCR反应体系中加入荧光基团SYBP Green 1或Taqman或分子信标等;利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程;最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法..利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化;通过Ct值C 代表Cycle;T代表threshold和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析..Ct值：扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数..荧光阈值是前3-15个循环荧光信号的标准偏差的10倍..用途：绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数;通常用到标准曲线；相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间或不同基因之间的基因表达差异；基因型/等位基因分析;例如SNP检测；转基因生物监测等4.重组PCR又称重叠PCR;overlap PCR：制备杂合基因5.多重PCR又称复合PCR;multiplex PCR两对或两对以上引物在一个反应体系中扩增多条目的基因片段6.不对称PCR：使用浓度相差100倍的正反引物;得到单链DNA7.反向PCR：扩增引物相反方向DNA 序列目的基因之外的序列;从而研究未知序列8.巢式PCRNest PCR：高特异性扩增;一对引物扩全长;一对引物扩内部部分序列此外;还有Touchdown PCR、锚定PCRA-PCR、Allele- specific PCRAS-PCR、单链构型多态性PCRSSCP-PCR和低严格单链特异性引物PCRLSSP- PCR等..。
1、试述荧光定量pcr技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用
1、试述荧光定量pcr技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用
荧光定量PCR是一种在PCR反应过程中，通过荧光信号的检测来对PCR产物进行实时定量分析的技术。
1. 原理：
荧光定量PCR利用荧光染料或者荧光探针，标记扩增过程中的每一个循环的产物，这些荧光标记的产物在激发光的作用下会发出荧光。
随着反应的进行，PCR产物不断累积，荧光信号也随之增强。
通过对荧光信号的实时监测，可以推断出样本中起始模板的数量。
2. 方法：
主要方法包括探针法、SYBR Green I染料法和分子信标法等。
探针法使用与目标序列特异性结合的荧光探针来标记PCR产物。
SYBR Green I染料法则是利用染料与双链DNA的结合特性，将染料添加到反应体系中，随着PCR产物的增加，染料的荧光信号也增强。
3. 注意事项：
荧光定量PCR对样品纯度要求较高，应避免杂质的干扰。
反应体系中的成分和浓度需要精确控制，以确保实验结果的准确性。
荧光定量PCR的结果解读需要参考标准曲线，以确定未知样本中的目标序列数量。
4. 在临床与科研中的应用：
在临床应用中，荧光定量PCR被广泛用于病原体检测、基因突变分析、遗传病诊断以及癌症研究等。
例如，用于检测病毒如HIV、HBV等的载量，或者检测癌症相关基因的表达水平。
在科研领域，荧光定量PCR可用于基因表达分析、基因组学和表观遗传学研究中。
例如，比较不同组织或细胞类型的基因表达差异，或者研究表观遗传修饰对基因表达的影响。
总的来说，荧光定量PCR技术是一种高灵敏度、高特异性的核酸定量分析方法，对于临床诊断和科学研究具有重要意义。
pcr凝胶显色
pcr凝胶显色摘要：1.PCR 技术简介2.PCR 凝胶显色的原理3.PCR 凝胶显色实验操作步骤4.实验结果分析5.常见问题及解决方法正文：1.PCR 技术简介聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是一种在体外将特定DNA 片段快速扩增的技术。
PCR 技术在基因工程、分子生物学、遗传学等领域具有广泛应用。
在PCR 实验过程中，需要对扩增产物进行检测，这时就涉及到PCR 凝胶显色。
2.PCR 凝胶显色的原理PCR 凝胶显色是利用琼脂糖凝胶电泳将扩增产物分离，并通过染色剂使其在紫外光下产生荧光信号，从而检测特定DNA 片段的扩增情况。
常用的染色剂有溴化乙锭（Ethidium bromide，EtBr）和荧光染料SYBR Green I。
3.PCR 凝胶显色实验操作步骤(1) PCR 扩增：设计引物，选取目标DNA 片段，进行PCR 扩增。
(2) 凝胶制备：准备凝胶板，倒入琼脂糖凝胶液，待凝固后放入电泳槽。
(3) 点样：将PCR 扩增产物加入上样孔，通常使用微型移液器。
(4) 电泳：将凝胶板放入电泳槽，加入电泳缓冲液，进行电泳。
(5) 显色：电泳结束后，将凝胶板放入显色液中，加入适量的染色剂，显色约30 分钟。
(6) 观察与拍照：在紫外光下观察凝胶，拍照记录实验结果。
4.实验结果分析通过观察凝胶显色，可以判断目标DNA 片段是否成功扩增。
在显色结果中，目标片段会显示为一个狭窄的条带，其位置和大小与预期一致，说明PCR 扩增成功。
若未见预期条带，可能是引物设计、扩增条件或实验操作等方面出现问题，需要重新设计实验。
5.常见问题及解决方法(1) 条带不清晰：可能是显色时间过短或过长，需要调整显色时间；也可能是染色剂浓度过低，需要优化染色剂浓度。
(2) 条带位置与预期不符：可能是引物设计或扩增条件不合适，需要重新设计引物和优化扩增条件。
(3) 出现非特异性条带：可能是引物设计不够特异，需要优化引物设计；也可能是扩增过程中出现污染，需要严格操作规程和实验环境。
PCR技术之——常见问题解析及处理方法
PCR技术之——常见问题解析及处理方法我们进行核酸扩增时，往往会不定的出现一些异常问题，本期我给大家搜集了一些平时经常性遇到的一些问题，希望对大家有所帮助。
（一）相对特异性 PCR产物的特异性主要取决于引物链的特异性。
由于存在同源序列，随意设计的引物链，其PCR产物在电泳分析时可能出现多条链，因此在设计引物链时应考虑其绝对特异性和相对特异性。
前者指两条引物链的核苷酸序列只与靶DNA片段互补，后者是指两条引物链的核苷酸序列及两者之间的DNA长度对靶DNA片段是特异的，但亦可与其他区域的DNA片段互补，而其PCR产物的长度与靶DNA片段的扩增产物的长度明显不同，应根据两引物问的DNA片段长度，预计PCR产物的大小，并与电泳分析的DNA片段大小比较．或用寡聚核苷酸限制性内切酶片段分析，或用分子杂交、核苷酸序列分析来测定。
（二）标本中存在的有形成分对反应的抑制这一点主要是针对来自临床标本中的杂质加细菌蛋白质和Taq DNA聚合酶抑制因子，须注意避免污染和去除标本中的杂质；将标本加热煮沸使抑制因子与DNA分离。
对于来自标本中的细胞和细胞器的崩解、核酸酶的激活均可使待检的DNA降解，降解的DNA是Taq DNA聚合酶作用良好底物，能与靶DNA竞争，从而扩增大量的非特异性DNA，这种非特异性DNA会使背景干扰超过了前景信号影响PCR循环扩增效率，减少特异性DNA扩增产量。
（三）Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶扩增的特异性受PCR循环次数及延伸时间与温度的影响循环次数太多使延伸时间延长和Taq DNA聚合酶单位用量增长可能导致非特异性扩增；循环次数太少，则不能得到充足的扩增产物，温度不适宜会影响扩增产物数量，延伸温度一般高于复性温度。
（四）复性温度与时间引物与变性DNA的复性温度对PCR 的特异性有影响，复性温度由引物的碱基成分决定。
在低温度（37℃）下复性可出现比扩增DNA长的非特异性扩增带；而在55～60℃复性的扩增带一般是特异的，复性时间过长或过短都会增加非特异性扩增。
pcr原理及应用中存在的问题
pcr原理及应用中存在的问题
PCR（聚合酶链反应）是一种利用酶催化的反应，可以在几小时内从微量样本中大量扩增DNA片段，是一种非常有效的DNA扩增技术。
它的原理是，在一定的温度和时间内，利用DNA聚合酶将DNA片段进行复制，从而获得大量的DNA片段。
PCR技术在生物学研究中有着广泛的应用，如基因组学、分
子诊断、基因工程等。
但是，PCR技术也存在一些问题。
首先，PCR技术的反应条件要求严格，如温度、时间、pH值等，如果反应条件不合适，可能会导致反应失败，从而影响结果的准确性。
其次，PCR技术的反应过程中，可能会受到外界环境的干扰，如污染物、抗生素等，这些物质可能会影响反应的准确性，从而影响结果的准确性。
此外，PCR技术的反应过程中，可能会受到DNA片段的长度
和结构的影响，如果DNA片段过长或结构复杂，可能会影响
反应的准确性，从而影响结果的准确性。
最后，PCR技术的反应过程中，可能会受到DNA片段的浓度
的影响，如果DNA片段的浓度过低，可能会影响反应的准确性，从而影响结果的准确性。
总之，PCR技术的反应条件要求严格，可能会受到外界环境
的干扰，DNA片段的长度和结构以及浓度的影响，都可能会
影响反应的准确性，从而影响结果的准确性。
因此，在使用PCR技术时，应该注意控制反应条件，避免外界环境的干扰，以及控制DNA片段的长度和结构以及浓度，以保证反应的准
确性，从而获得准确的结果。
PCR常见问题、原因分析及其对策汇总
提高PCR反应特异性的策略
策略之二：递减PCR（TouchDown PCR）
递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火 条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃ 的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃,直到 退火温度低于Tm 5℃。 特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在 随后的循环中继续扩增占据优势。 递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程 度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析。
PCR技术的简介
PCR技术的发展历史
1985 关于PCR 的文章首次由美国科学Kary Mullis等 人在 《Science》杂志上发表 1989 《Science》杂志报道了耐热性DNA多聚酶 Taq酶 （生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到的一种耐 热的DNA聚合酶 ）的发现,预示着分子时代的到 来。12月《Science》杂志将PCR和它所使用的聚 合酶命名为第一个“年度分子”。 1993 Kary Mullis 因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。
1. 现象：空白对照出现目的扩增产物 原因：靶序列或扩增产物的交叉污染 对策： 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪 内或溅出离心管外； 2. 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材 均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应 一次性使用。 3. 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。
原 因
1.
2. 3. 4. 5. 6.
模板不纯 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多
1.
2.
对 策
3. 4. 5.
6.
纯化模板 更换Buffer 适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和镁离子的 浓度 减少循环次数
RTPCR常见问题分析
11.富含GC的 模板
于GC含量>50%的模 板，使用PCRx Enhancer Solution。
12. 镁离子浓度 太低
从1mM到3mM，间隔 0.5mM进行一系列反 应，确定对于每个模 板和引物对的最佳镁 离子浓度。注意：对 实时定量PCR，使用 3mM到5mM的镁离子 浓度。
13.退火温度 太高
2、 RNA被损害和降解：必要的话更换RNA。
3、 RNAse污染：维持无菌条件;加入RNase抑制 剂。
4、 无效的Biblioteka DNA：通过增加70%乙醇清洗的次数 来去除制备RNA过程中的抑制剂。
5、 无效的PCR扩增：注意：反转录的抑制剂包 括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精 胺。调整cDNA合成温度或引物设计。
RNA提取后，应储存在 100％甲酰胺中，如果使 用RNase抑制剂，加热时 ＜45℃；pH＜8.0，否则 抑制剂会释放所有结合的 RNase。而且，在 ≥0.8mM DTT时加入 RNase抑制剂，一定要存 在DTT。
2. RNA中包含 逆转录抑制剂
过乙醇沉淀RNA除去抑制 剂。用70%(v/v)乙醇对 RNA沉淀进行清洗。可以 加入糖元(0.25μg到 0.4μg/μl)以帮助小量样品 RNA的恢复;逆转录抑制剂 包括：SDS，EDTA，甘 油，焦磷酸钠，亚精胺， 甲酰胺和胍盐;将对照RNA 同样品混合，同对照RNA 反应比较产量以检验抑制 剂;
pcr实验知识点总结
pcr实验知识点总结PCR实验（聚合酶链反应）是一种在生物化学中广泛使用的分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段。
该技术由Kary Mullis于1983年发明，并于1993年获得了诺贝尔化学奖。
以下是关于PCR实验的知识点总结。
一、PCR原理PCR的基本原理是利用DNA聚合酶对单链DNA进行复制的能力。
这个过程分为三个步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性：在高温（通常为95℃）下，双链DNA被解旋成两条单链模板。
2. 退火：温度降低（一般为50-65℃），引物与模板DNA的互补序列结合。
3. 延伸：在适宜的温度（72℃左右）和DNA聚合酶的作用下，引物沿着模板DNA向两侧延伸，形成新的双链DNA。
这三个步骤循环进行，每次循环都会使目标DNA的数量翻倍，经过几十到几百次循环后，就能得到大量的目标DNA。
二、PCR所需材料1. DNA模板：待扩增的目标DNA。
2. 引物：两段短的寡核苷酸，与目标DNA的两端互补。
3. dNTPs：脱氧核苷三磷酸，作为合成新链的原料。
4. Taq DNA聚合酶：能在高温下保持活性的酶，用于催化DNA的合成。
5. 缓冲液：提供合适的pH和离子环境。
三、PCR操作步骤1. 设计引物：根据目标DNA的序列设计出两条引物，分别与DNA的正反两条链互补。
2. 配制反应体系：将模板DNA、引物、dNTPs、Taq酶和缓冲液按照一定比例混合。
3. PCR循环：将反应体系放入PCR仪中，设定好变性、退火和延伸的温度和时间，开始循环反应。
4. 产物检测：可以通过凝胶电泳等方法检测PCR产物的大小和数量。
四、PCR的应用1. 分子诊断：如病原体检测、基因突变检测等。
2. 基因克隆：将目的基因扩增后，可以方便地进行后续的克隆和表达。
3. 序列分析：通过扩增特定的基因区域，可以进行基因测序和SNP分析等。
4. 生物考古学：可以从古代样本中提取DNA并进行扩增，研究古生物的遗传信息。
五、PCR实验注意事项1. 引物设计：引物应具有良好的特异性和稳定性，避免产生非特异性扩增和二级结构。
PCR检测常见问题与解决途径
PCR检测常见问题与解决途径PCR 检测常见问题与解决途径利用 PCR 方法检测转基因成分时，经常出现假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带。
尤其是假阳性和假阴性可使检测结果得出错误结论，有时可造成严重后果。
为了提高转基因检测的准确性和可靠性，PCR 检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现象的发生。
一个好的PCR 方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、重现性、鲁棒性，尽量减少假阳性、假阴性和非特异性扩增。
本文对 PCR 检测中出现的假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带的原因及其解决方法予以综述。
一、假阳性：（一）假阳性现象假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。
如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。
实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。
（二）造成假阳性的原因1.样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；2.PCR 试剂的污染：主要是由于在 PCR 试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被 PCR 核酸模板污染。
3. PCR 扩增产物污染：这是 PCR 贝量大 (一般为 1013 拷贝 /ml)，远远高于物污染，就可形成假阳性。
反应中最主要最常见的污染问题。
因为PCRPCR 检测数个拷贝的极限，所以极微量的产物拷PCR 产4. 气溶胶污染：在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。
据计算一个气溶胶颗粒可含 48000 拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
5.实验室中克隆质粒的污染：由于克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。
pcr实验知识点总结
pcr实验知识点总结PCR（聚合酶链反应）是一种体外扩增DNA片段的技术，由Kary Mullis在1983年发明。
自那时以来，这项技术已成为分子生物学、遗传学、医学和法医学等领域的基础工具。
以下是关于PCR实验的知识点总结。
一、PCR原理PCR的原理是利用DNA聚合酶对DNA进行复制的过程。
通过循环加热和冷却的过程，将目标DNA序列扩增到数百万份甚至数十亿份。
每个循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。
二、PCR所需材料与设备1. 材料：模板DNA、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、缓冲液等。
2. 设备：PCR仪（热循环器）、离心机、电泳设备、凝胶成像系统等。
三、PCR反应体系的建立一个标准的PCR反应体系通常包含以下成分：- 模板DNA：10-100 ng- 正向引物和反向引物：各0.5-2 μM- dNTPs：每种200 μM- 缓冲液：1X- Taq DNA聚合酶：1.5-2 U- 无菌水：补足至总体积20-50 μL四、PCR反应条件设置1. 变性：94℃，1-3分钟2. 退火：根据引物Tm值设定，一般为55-65℃，持续时间15-30秒3. 延伸：72℃，持续时间1-2分钟4. 循环次数：通常为25-35次五、PCR产物分析1. 凝胶电泳：是最常用的PCR产物分析方法，可以直观地观察PCR产物的大小和数量。
2. 克隆和测序：对于需要进一步研究的PCR产物，可以通过克隆和测序来确定其精确序列。
六、PCR的应用1. 遗传病诊断：如地中海贫血、囊性纤维化等遗传病的基因诊断。
2. 法医鉴定：如亲子鉴定、个体识别等。
3. 病原体检测：如HIV、乙肝病毒、新冠病毒等的检测。
4. 肿瘤基因检测：如BRCA1/2突变的检测。
5. 生物科技研究：如基因克隆、基因表达分析等。
七、PCR实验常见问题及解决办法1. 无扩增产物：可能的原因有模板质量差、引物设计不合理、PCR条件不合适等。
可通过优化模板提取、重新设计引物或调整PCR条件来解决。
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PCR 原理、技术及常见问题分析PCR 原理、技术及常见问题分析Jeff Wu 编辑整理1PCR 技术概论聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。
它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA 片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA 供分析研究和检测鉴定。
过去几天几星期才能做到的事情，用PCR 几小时便可完成。
PCR 技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。
2PCR 技术简史2.1PCR 的最早设想核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana 于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA 变性，与合适的引物杂交，用DNA 聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA 基因”。
2.2PCR 的实现1985年美国PE-Cetus 公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。
其原理类似于DNA 的体内复制，只是在试管中给DNA 的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA 聚合酶，合适的缓冲体系，DNA 变性、复性及延伸的温度与时间。
2.3PCR 的改进与完善Mullis 最初使用的DNA 聚合酶是大肠杆菌DNA 聚合酶I 的Klenow 片段，其缺点是：①Klenow 酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。
②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR 产物特异性较差，合成的DNA 片段不均一。
此种以Klenow 酶催化的PCR 技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow 酶不耐热，在DNA 模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR 技术操作程序添了不少困难。
这使得PCR 技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。
1988年初，Keohanog 改用T4DNA 聚合酶进行PCR，其扩增的DNA 片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA 片段。
但每循环一次，仍需加入新酶。
1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取到一种耐热DNA 聚合酶。
此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h 后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h 后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h 后其残留活性是原来的40%。
②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。
③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。
由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。
为与大肠杆菌多聚酶I Klenow 片段区别，将此酶命名为Taq DNA 多聚酶(Taq DNA Polymerase)。
此酶的发现使PCR 广泛的被应用。
3PCR 技术基本原理3.1PCR 技术的基本原理类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA 的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
3.2PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。
反应最终的DNA扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。
平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。
反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。
大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。
3.3PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。
短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。
短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。
进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。
引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。
不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。
4PCR反应体系与反应条件4.1PCR反应体系中的五要素引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。
dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH 或1M Tris-HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。
多次冻融会使dNTP降解。
在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。
浓度过低又会降低PCR产物的产量。
dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。
SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。
提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。
一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。
RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。
Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA4.2PCR反应条件的选择PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。
在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。
对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。
①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。
一般情况下，93℃～94℃min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。
此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致P CR失败。
②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。
变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。
由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。
退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。
对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)复性温度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。