荧光原位杂交技术
荧光原位杂交技术原理
荧光原位杂交技术原理
荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）
是一种用于检测和定位靶标DNA序列的方法。
其原理是利用
荧光标记的DNA探针与靶标DNA特异性结合，通过荧光显
微镜观察细胞核内荧光信号的强度和位置，从而确定目标
DNA序列在细胞核中的位置和数量。
荧光原位杂交技术的步骤包括标记DNA探针、固定细胞样品、使细胞核开放透明化、探针与目标DNA杂交、洗涤去掉无特
异连接的探针、显微镜观察和分析。
在标记DNA探针的过程中，将目标DNA序列特异性引物和
荧光标记的核苷酸引物结合，通过聚合酶链反应使DNA探针
荧光标记。
标记DNA探针可以选择性地与目标DNA序列进
行互补结合。
固定细胞样品后，可以通过化学方法将细胞膜破裂并使细胞核透明化，使DNA探针能够更好地进入细胞核。
随后将标记好
的DNA探针加入样品中，在适当的温度下进行DNA杂交反应。
如果目标DNA序列在细胞核中存在，则DNA探针与目
标DNA序列结合，形成探针-目标DNA复合物。
在杂交反应后，需要进行洗涤步骤以去除无特异连接的DNA
探针。
这样可以提高荧光信号的特异性和强度。
最后，利用荧光显微镜观察样品中的荧光信号。
荧光探针与目标DNA序列结合后会发出特定颜色的荧光信号，可以通过观
察荧光信号的位置和强度来确定目标DNA序列在细胞核中的位置和数量。
荧光原位杂交技术可以应用于医学诊断、基因定位等领域，成为研究细胞遗传学和基因组学的重要工具。
荧光原位杂交(fish)
荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization），简称FISH。
是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。
中文名fish外文名fluorescent in situ hybridization建立时间1986年发展历程1969年，Pardue和John等两个研究小组开始采用放射性标记DNA或28S RNA发明了原位杂交技术（ISH）。
尽管当时原位杂交技术已经具有较高的特异性和灵敏度，但鉴于放射性同位素自身特性的局限，如安全性、空间分辨率低、不稳定性等问题，这项技术仅限于实验室研究方面的应用。
1986年科研工作者开始利用异硫氰酸盐荧光素来标记探针，并在荧光显微镜下进行观察分析，建立了荧光原位杂交技术（FISH）。
1989年，Delong首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。
由于FISH技术具有敏感度高、信号强、背景低、快速等优点，该方法在环境微生物的检测中得到了广泛的应用。
随着科技的迅速发展，FISH探针标记物越来越多，不仅从单一荧光发展到多色荧光检测，而且应用范围也进一步扩大，不仅可以用于分裂相细胞而且可以用于间期细胞检测，为FISH技术的临床应用打下了坚实的基础。
操作步骤编辑播报（1）样品的固定；（2）样品的制备和预处理；（3）预杂交；（4）探针和样品变性；（5）用不同的探针杂交以检测不同的靶序列；（6）漂洗去除未结合的探针；（7）检测杂交信号，进行结果分析·荧光信号观察：将处理好的样品置于荧光显微镜下，选择分散较好的区域来观察。
三色（或者更多）荧光激发下，观察到不同颜色的荧光图像。
通常选用20X物镜来扫描样品杂交区域，40X或100X物镜下观察样品，从一定的方向进行计数，并对计数情况进行分析。
荧光原位杂交技术
荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术（Fluorescence in Situ Hybridization，FISH）是一种分子生物学技术，用于研究染色体结构和功能、基因组描绘、肿瘤和遗传性疾病诊断及治疗等领域。
其原理是利用荧光探针与目标DNA碱基序列互补配对，使染色体或基因区域成为荧光标记物，从而实现对核酸序列的直接可视化和定量分析的一种分子探针技术。
1. FISH技术的发展历程FISH技术首次应用于分子遗传学研究可以追溯到20世纪70年代。
最初的技术主要是通过蛋白质标记方法，如辣根过氧化酶结合（HRP）和碱性磷酸酶结合等，来识别DNA序列。
然而这种方法往往存在较大的检测误差和信号弱等问题。
随着荧光染料和显微镜方法的发展，荧光成为FISH技术中的关键技术。
荧光标记FISH（Fluorescence-Labeled FISH，Fl-FISH）技术逐渐取代了传统的蛋白质标记方法，成为目前FISH技术的主流。
2. FISH技术的原理FISH技术的主要原理是利用荧光探针或荧光标记分子与特定的目标DNA序列互补配对，使其可视化。
荧光探针主要包括含有荧光染料结构域和与目标DNA碱基序列相互作用结构域的寡核苷酸或单链DNA分子。
探针长度通常在15-30bp左右，越短的探针对于特异性检测越有利。
FISH技术的操作过程一般包括以下几个步骤：（1）标本制备，如组织切片、细胞准备等。
（2）脱氧核糖核酸（DNA）变性，使之成为单链状态，以方便荧光探针与目标DNA碱基序列的互补配对。
（3）探针杂交，将荧光标记探针与目标DNA碱基序列杂交，或者将探针标记在载体DNA上，通过载体DNA与目标DNA 互补配对实现探针的标记。
（4）洗涤，去除杂交与未杂交的探针，防止假阳性结果的产生。
（5）荧光染色，使探针与目标DNA形成的复合物发生荧光信号，从而能够通过荧光显微镜观察到。
3. FISH技术的应用（1）研究染色体和基因组的结构和功能，如染色体结构异常、基因扩增和缺失等病理变化的检测和评价。
荧光素原位杂交
荧光素原位杂交
荧光素原位杂交（FISH）是一种高灵敏度，高特异性的分子解剖技术，它可以在细胞和分子水平上检测某一特定基因的存在和位置。
荧光素原位杂交是一种可以识别特定基因（目标基因）在特定基因组内位置，确定目标基因的复制数等的分子生物学技术。
该技术和其它一些分子生物技术一起，使我们能够理解基因的调控、功能和遗传性的机制。
荧光素原位杂交是由弗朗斯·勒罗（Franz Lerner）和Ralph Rapley于1989年独立发明的，它使用荧光素作为探针，由一种荧光素探针与另一种荧光素探针结合制作而成，可以检测
目标基因在{指定的DNA片段上的位置。
荧光素原位杂交技术由原位杂交（IF）和荧光原位杂交（FISH）组成，FISH的过程包括荧光素标记、原位杂交、固定、染色和荧光素检测五个步骤。
第一步是将探针结合荧光素标记，第二步是将标记的探针与样品中的DNA片段结合，以形成杂交物，第三步是将杂交
物固定在载体上，第四步是进行染色，第五步是鉴别杂交区域并直接检测荧光素。
在生物医学研究领域，FISH已经广泛应用于多种疾病的诊断。
它可以检测遗传和病理性
疾病，如亚型特异型慢性粒细胞白血病、慢性克隆细胞白血病和体核异常的诊断等，这些
疾病常常受到其他分子检测技术的限制。
此外，FISH还可以用于检测肿瘤克隆，可以检
测在肿瘤恶化和转移过程中的基因调控，为癌症早期诊断和治疗提供了可靠可靠的依据。
荧光素原位杂交这种既高灵敏又高特异的分子生物学技术，不仅可以为疾病诊断提供非常便捷和精准的方法，而且还可以帮助人们了解疾病发病机理，为疾病治疗和预防提供重要
的研究基础。
荧光原位杂交
荧光原位杂交荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种分子生物学技术，可以用来检测DNA或RNA序列的存在、位置和数量。
该技术通常使用荧光染料标记DNA或RNA的探针来识别特定的序列。
在荧光原位杂交中，常常使用单链DNA或RNA的Oligonucleotide探针。
探针的序列与待检测样品中的特定DNA或RNA序列互相互补，使得探针和样品DNA或RNA序列可以杂交在一起。
探针可以被标记成许多不同的荧光染料，如荧光素、罗丹明等，以使得检测到的探针可根据颜色进行区分。
荧光原位杂交过程包括以下步骤：1. 选择合适的探针。
选择的探针实际上就是一个人工合成的核酸分子，其长度在20-200bp不等，可以与靶序列DNA或RNA中的任意位置相互匹配，检测的种类也包括基因、病毒、染色体等。
2. 标记探针。
标记探针是指把荧光染料等标记物与探针进行化学共价修饰，使之形成标记的探针，标记的探针使用单染色荧光或双染色荧光。
3. 处理样品。
把检测样品进行前处理、处理固定等。
4. 杂交。
把标记的探针打入处理好的样品中，如细胞、组织、染色体等，探针就会与相应的靶分子发生杂交，然后把样品用适当的盐洗。
5. 检测结果。
通过荧光显微镜进行探针的显示，可以看到细胞核内亮相区域，确定靶序列的定位和相应的染色体编号，并可以通过比较实验组和对照组的信号强度，得到目标序列的数量和比例。
荧光原位杂交在基因检测、疾病诊断、癌症诊断和治疗中都有广泛应用。
在基因诊断中，荧光原位杂交可以检测微观缺失、染色体重排列和染色体数目异常等，具有高准确度、高敏感度、高特异性和可显性等特点。
在肿瘤诊断和治疗中，荧光原位杂交是一种高效而准确的技术，可以评估患者的病情、选择合适的治疗方案，预测预后。
因此，荧光原位杂交在生命科学研究和医学诊断中的应用前景非常广阔。
荧光原位杂交技术在产前诊断中应用的专家共识
荧光原位杂交技术（FISH）在产前诊断中的应用一直备受关注。
近年来，随着该技术在临床实践中的不断深入和发展，专家共识也逐渐形成。
在本文中，将从深度和广度上对荧光原位杂交技术在产前诊断中的专家共识进行全面评估，并撰写一篇有价值的文章，以便读者能更深入地理解这一领域的最新进展和专家观点。
1. 荧光原位杂交技术概述- 荧光原位杂交技术是一种基于DNA的细胞遗传学技术，能够定位和检测细胞中特定DNA序列的存在和定位。
该技术通过使用标记了荧光物质的探针，使得特定的DNA序列在细胞或组织的显微镜下呈现出荧光信号，从而实现对细胞遗传信息的定量和定位检测。
在产前诊断中，荧光原位杂交技术能够用于检测胎儿染色体异常、基因突变等遗传性疾病，具有高灵敏度和特异性的优势。
2. 专家共识的形成- 随着荧光原位杂交技术在产前诊断中的广泛应用，越来越多的专家学者参与其中，并在临床实践和科研工作中积累了大量的经验和数据。
通过学术会议、专家讨论会、文献研究等形式，专家们逐渐达成了对荧光原位杂交技术在产前诊断中应用的共识。
这些共识涵盖了该技术的临床适应症、操作规范、质控要求、结果解读等方面，为该领域的规范化和标准化提供了重要指导。
3. 专家共识的内容和意义- 在产前诊断中，荧光原位杂交技术的专家共识主要包括对该技术的临床应用范围和标准化操作流程的制定。
专家们一致认为，该技术在胎儿染色体异常、染色体结构异常、基因突变等方面具有重要应用意义，可以为胎儿遗传疾病的早期筛查和诊断提供可靠依据。
专家共识还对该技术的样本采集、实验操作、结果解读等方面提出了具体要求，以确保临床应用的准确性和可重复性。
4. 个人观点和理解- 就我个人来说，我认为荧光原位杂交技术在产前诊断中的应用具有重要的临床意义和发展前景。
通过该技术，我们可以更准确地了解胎儿遗传信息，及时发现和诊断潜在的遗传疾病，为家庭和社会减少遗传疾病的发病率和负担提供了可能。
专家共识的形成也为该技术在临床实践中的标准化和规范化提供了重要支持，有助于推动该领域的进一步发展和应用。
荧光原位杂交法 pcr-荧光对比
荧光原位杂交法 pcr-荧光对比荧光原位杂交法（FISH）和PCR-荧光对比（PCR-FLP）都是分子生物学中常用的技术，可以用于基因定位、染色体结构和功能等方面的研究。
本文将分别介绍这两种技术的基本原理、应用场景和优缺点。
一、荧光原位杂交法1.基本原理荧光原位杂交法是一种基于DNA序列互补碱基配对原理的技术，利用荧光探针对染色体上的特定区域进行标记，以便于观察和分析。
该技术主要包括以下几个步骤：（1）制备探针：将已知序列的DNA片段与荧光标记分子连接，生成荧光标记的DNA探针。
（2）加热解离：将待检样品中的DNA加热，使其解离成两条单链DNA。
（4）荧光显色：利用显微镜观察染色体上的荧光标记，并确定标记位置及数目。
2.应用场景荧光原位杂交法可用于以下方面的研究：（1）核型分析：检测染色体数目、大小和形态等信息。
（2）染色体重排：观察染色体间的换位、倒位等结构改变。
（3）基因定位：确定特定基因在染色体上的位置。
（4）肿瘤诊断：检测肿瘤细胞染色体的数目和结构变化。
3.优缺点（1）高灵敏度：能够检测到细胞核中的单个分子。
（2）高特异性：探针与目标序列可以实现完全互补。
（3）数据可视化：能够直观地呈现染色体结构及荧光信号大小。
而其缺点主要包括：（1）长时间实验：需要多个步骤和时间，且荧光信号非常容易被淬灭。
（2）需要DNA标记：需要荧光标记作为探针，费用较高。
二、PCR-荧光对比PCR-荧光对比（PCR-FLP）是一种应用荧光标记测量PCR产物数量的技术，能够在短时间内准确、可靠地检测和测量DNA的含量和变异。
具体操作过程如下：（1）样品制备：将待测DNA标记荧光标记，与另一非标记探针PCR反应。
（2）荧光PCR扩增：通过PCR反应增生DNA分子。
（3）荧光观察：利用荧光标记观察PCR产物。
（1）定量PCR：准确检测PCR反应中模板DNA的数目。
（2）基因表达：测量基因在不同实验条件下的表达水平。
（3）点突变检测：定性判断DNA中的单个碱基是否发生变异。
2024荧光原位杂交技术在血液肿瘤中的应用规范(全文)
2024荧光原位杂交技术在血液肿瘤中的应用规范（全文）荧光原位杂交（FISH）技术是基于碱基互补配对原则，利用荧光标记的核酸探针，对待测标本DNA序列进行定位、定性和定量分析的技术，是遗传学异常的主要检测手段之一。
相较于核型分析，FISH技术具有快速、灵敏度高及特异性强的优势，是血液肿瘤诊断和预后判定的重要手段。
为进一步规范FISH技术在血液肿瘤中的应用，中国抗癌协会血液病转化医学专业委员会、中国老年医学学会病理学分会及中华医学会血液学分会组织国内血液学、病理学和检验学专家，制定了FISH 在血液肿瘤中的应用规范。
1 FISH在血液肿瘤诊疗中的应用价值1.1 诊断分型遗传学改变是血液肿瘤诊断分型的主要依据。
急性白血病（AL）、慢性粒细胞白血病（CML）、伴嗜酸粒细胞增多和酪氨酸激酶基因融合的髓系/淋系肿瘤（MLN-TK）、骨髓增生异常综合征（MDS）、大B 细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤（FL）、套细胞淋巴瘤（MCL）、伯基特淋巴瘤（BL）、边缘区淋巴瘤（MZL）、间变大细胞淋巴瘤（ALCL）、T幼淋巴细胞白血病（T-PLL）等均需要借助FISH检测关键的遗传学异常才能精准分型。
1.2 预后分层目前针对急性髓系白血病（AML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）、MDS、慢性淋巴细胞白血病（CLL）、原发性骨髓纤维化（PMF）、多发性骨髓瘤（MM）等血液肿瘤，世界卫生组织（WHO）、美国国立综合癌症网络（NCCN）指南已提出了基于遗传学异常的预后分层/评分体系。
FISH检测在血液肿瘤的预后评估中发挥着不可替代的作用。
1.3 指导治疗CML患者中费城染色体（Ph染色体）或BCR：：ABL1融合基因的发现开启了酪氨酸激酶抑制剂（TKI）靶向治疗的新时代。
此外，针对PML：：RARA融合基因或其他RARA重排的全反式维甲酸和砷剂、ABL信号通路（ABL1、ABL2、PDGFRA、PDGFRB重排）的TKI药物、JAK-STAT信号通路（CRLF2、JAK1/2/3重排）的JAK抑制剂、FLT3重排的FLT3抑制剂、ALK重排的ALK抑制剂等均已正式应用于临床治疗或处于临床试验阶段。
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非放射性标记法
直接法
荧光素（fluorescein）或其他荧光染料
间接法
地高辛（digoxigenin） 生物素（biotin）
1. 随机引物法 2. 缺口平移法 3. PCR法 4. 寡核苷酸末端标记法 5. 直接在探针3’或5’端合成
1. 0.5ml离心管中加入1ug探针DNA,加水置体系为16ul
原位杂交操作步骤
一、准备载玻片和固定材料 二、染色体标本制备和预处理 三、探针制备及标记 四、染色体标本变性 五、杂交 六、杂交后洗脱 七、免疫细胞化学检测 八、荧光显微镜观察及显微摄影
染色体标本制备
预处理
1、RNA酶处理
1） 每张玻片加100 μl 100 μg/ml RNase A (in 2x SSC) 37℃处理1小时
NaCl, 0.05% Tween 20] 37℃洗1x5min
免疫细胞化学检测
1பைடு நூலகம் TNT buffer冲洗 2. TNB buffer[100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM
NaCl,0.5% blocking reagent] 3. Anti-DIG-荧光素(2 μg/ml, in TNB)37℃30min 4. TNT buffer冲洗3x5min 5. 乙醇系列脱水,气干 6. DAPI染色10min 7. 加Vectashield封片,荧光显微镜下观察并照相
5种荧光素联合标记人类24条染色体
荧光素 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
FITC ☆
☆☆ ☆
☆☆ ☆
☆☆☆ ☆
Cy3
△ △ △ △ △△
△
△
△△
Cy3.5
○
○○
○○ ○○
○○ ○ ○
Cy5
※※※※
※※
※※※※
对，结合成专一的核酸杂交分子，再经一定的检测手段将待测核酸在染色体、细 胞或组织上的位置显示出来的一项技术。
该技术最早是Pardue and Gall (1969)和John et al. (1969)分别独立建 立起来的。当时使用的放射性标记探针，利用放射自显影检测一些高度重复序列 DNA在染色体上的定位，此后原位杂交技术日益成为生物医学领域的一种十分 重要的技术手段。尽管放射性标记探针灵敏度很高，能够检测小至几百个碱基对 的DNA序列，但是由于同位素的安全问题、半衰期、信号统计等限制了此项技 术的广泛应用，后来逐渐发展出了非放射性标记探针原位杂交技术。
4. 混匀离心，置于37℃温育1小时~20小时
5. 65 ℃处理10min终止反应
染色体标本变性
共变性
杂交液加到标本上封片，置80 ℃烘箱中10分钟
分别变性
70%甲酰胺，2xSSC 70 ℃处理2分钟 70%，85%，100%冷乙醇系列脱水，空气干燥
杂交
1. 杂交液(50% 去离子甲酰胺, 2x SSC, 10% 硫酸葡聚 糖, 50 mM 磷酸钠; pH 7)中加入标记的探针，每 10ul杂交液含50ng探针
影响杂交的因素
一、影响杂交的主要因素
温度、pH、单价阳离子浓度、甲酰胺
二、其他因素
探针长度、探针浓度、硫酸葡聚糖、洗脱严谨度
三、标准杂交条件
FISH技术的应用
基因定位 染色体结构变异(异位、缺失、重复)研究 染色体物理作图 疾病及产前诊断 外源基因检测 多倍体起源进化研究 分子核型研究 染色体（质）空间结构研究
2. 探针95 ℃变性5分钟，置冰水中10分钟 3. 10ul杂交液加到标本上，盖盖玻片并封片 4. 湿盒中37℃杂交过夜
杂交后洗脱
1. 2x SSC, 50%甲酰胺45 ℃洗3x5min 2. 2x SSC 37℃洗2x5min 3. TNT buffer [100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM
2）用2x SSC洗3×5min 3）70%，80%，100%乙醇系列脱水，每级5分钟
2、胃蛋白酶处理
1） 0.005-0.02% pepsin（10 mM HCl） 37℃处理10 min 2） 1×PBS洗2×5min 3） 1×PBS，50 mM MgCl2处理5min 4） 1×PBS，50 mM MgCl2,1%甲醛固定10min 5） PBS洗涤并脱水,气干
Cy7
◆
◆
◆
◆◆◆◆ ◆ ◆ ◆
Chromosome Lab
荧光原位杂交技术
荧光原位杂交技术
第一节 原位杂交技术简介 第二节 荧光原位杂交技术的应用 第三节 原位杂交操作步骤 第四节 影响杂交的因素 第五节 荧光原位杂交技术的新进展
原位杂交技术简介 in situ hybridization
原位杂交技术的基本原理是根据核酸分子碱基互补配对的原则， 将有放射性或非放射性标记的外源核酸（探针）与经过变性后的单链DNA互补配
2. 沸水浴中变性10min, 马上置于冰水中
3. 加入4ul DIG-High Prime(5x buffer; 50% glycerol;1 U/μl Klenow enzyme; 5x
random primer mix; 1 mM each of dATP, dCTP, and dGTP; 0.65 mM dTTP; and 0.35 mM DIG-11-dUTP)
荧光原位杂交技术新进展
M-FISH，armFISH(42-color M-FISH), SKY BAC-FISH, YAC-FISH Fiber-FISH PRINS ( Primed in situ DNA synthesis)引物原位DNA 合成技术 IS-PCR (in situ polymerase chain reaction) 原位PCR GISH(Genome in situ Hybridization)基因组原位杂交 Immuno-FISH 3D-FISH Q-FISH（Quantitative-FISH），Flow-FISH T-FISH（Tissue-FISH）or (Telomere-FISH) RNA-FISH