双萤光素酶报告基因检测 靶基因验证 实验报告
利用ChIPseq双荧光素酶报告基因技术验证PPAR2的靶向基因MYH7
利用ChIPseq双荧光素酶报告基因技术验证PPAR2的靶向基因MYH7一、本文概述本文旨在利用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和双荧光素酶报告基因技术（Dual-Luciferase Reporter Assay）来验证过氧化物酶体增殖物激活受体2（PPAR2）是否直接靶向调控肌球蛋白重链7（MYH7）基因。
PPAR2作为一种核受体，在多种生物学过程中发挥着关键作用，包括脂肪代谢、炎症反应和细胞分化等。
MYH7，作为肌球蛋白家族的一员，主要参与肌肉收缩和细胞骨架组成，其表达调控对于肌肉发育和功能至关重要。
因此，探究PPAR2是否通过直接结合MYH7基因启动子区域来调控其表达，对于理解PPAR2在肌肉生物学中的作用具有重要意义。
本文首先利用ChIP-seq技术，通过高通量的方法寻找PPAR2在体内结合的DNA序列，从而确定MYH7基因是否为其潜在的靶向基因。
在此基础上，通过构建包含MYH7基因启动子区域的双荧光素酶报告基因质粒，利用荧光素酶活性的变化来反映PPAR2对MYH7启动子的转录激活作用。
这种方法结合了染色质免疫沉淀的高特异性和荧光素酶报告基因技术的高灵敏度，为验证PPAR2对MYH7的靶向调控提供了强有力的实验手段。
通过本文的研究，我们期望能够明确PPAR2是否直接调控MYH7基因的表达，揭示这一调控过程的具体分子机制，并为进一步理解PPAR2在肌肉生物学中的功能提供新的线索。
二、材料与方法1 细胞系：使用人源细胞系，例如HEK293T细胞，用于后续的ChIP-seq和双荧光素酶报告基因实验。
2 ChIP-seq试剂：染色质免疫沉淀（ChIP）试剂盒、蛋白酶抑制剂、DNA纯化试剂盒、DNA片段化酶、测序引物等。
3 双荧光素酶报告基因系统：包含PPAR2反应元件（PPRE）的荧光素酶报告质粒，以及用于转染细胞的荧光素酶底物。
4 PPAR2特异性抗体：用于ChIP实验的PPAR2转录因子特异性抗体。
双荧光素酶报告基因分析promega
双荧光素酶报告基因分析promega双荧光素酶报告基因分析1. 介绍荧光素酶报告基因表达的转录调控常被用来研究培养细胞的生物学特性。
荧光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性荧光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的荧光素酶。
Dual-Luciferase?双荧光素酶报告基因检测系统中含有在同一细胞中同时表达的两种荧光素酶。
通常，报告基因实验中往往会受到各种实验条件的影响，共转染的“对照”报告基因会作为内对照，为试验提供一基准线。
实验报告基因经过内参照的处理可以减小细胞活性和转染效率对实验的影响，因此双报告系统减少了外部干扰，使得实验数据更可信。
实验中报告基因和对照基因的酶没有种源同源性，萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶对应不同的反应底物，反应中没有任何的交叉干扰。
萤火虫荧光素酶底物和海肾荧光素酶底物分别与检测试剂反应可以使灵敏度最大化。
由于超强的光信号和超高的信噪比，本系统被广泛用于制药和生物技术产业中。
双荧光素酶报告基因检测系统适配于各种培养哺乳细胞的培养基，如1640，MEM，DMEM，F12等。
这些试剂与被动裂解液所附带的试剂盒，可以从Promega试剂盒中分开，单独使用。
具有超高灵敏度和超宽线性范围的Veritas?微孔板发光检测仪特别适合DLR 报告基因检测系统，Veritas?软件中预装了DLR 的检测程序使得安装更为方便，内置自动加样器使得应用更为简单。
Veritas?微孔板发光检测仪使用荧光素酶检测试剂II (LAR II)最低可以检测到1X10-19 mol 荧光素酶分子，使用Stop & Glo?试剂可以检测到1X10-18 mol 海肾荧光素酶分子，检测线性范围分别为8 和6 个数量级。
所有的检测均采用纯化的重组萤火虫荧光素酶(E1701)和纯化的重组海肾荧光素酶。
图 1－3 使用Promega 公司Dual-Luciferase?双荧光素酶报告基因检测系统，萤火虫荧光素酶(1x10-19 到1x10-11 mol)和海肾荧光素酶(1x10-14 mol)在Modulus?仪上测量结果。
双荧光实验报告
一、实验目的1. 了解荧光素酶和荧光素酶报告基因系统的基本原理。
2. 掌握双荧光素酶实验的操作方法。
3. 学习如何分析双荧光素酶实验结果。
二、实验原理荧光素酶（Luciferase）是一种能够催化荧光素（Luciferin）和氧气反应产生荧光的酶。
在生物化学和分子生物学研究中，荧光素酶报告基因系统被广泛应用于基因表达和信号转导的检测。
双荧光素酶实验是利用两种荧光素酶（荧光素酶和Renilla荧光素酶）的特性来检测细胞内基因表达和信号转导。
实验中，将荧光素酶和Renilla荧光素酶的编码基因分别构建在两个不同的载体上，共同转染细胞。
荧光素酶催化荧光素产生绿色荧光，而Renilla荧光素酶催化荧光素产生红色荧光。
通过比较两种荧光的强度，可以定量地分析细胞内基因表达和信号转导。
三、实验材料1. 细胞：HeLa细胞、293T细胞等。
2. 载体：荧光素酶报告基因载体、Renilla荧光素酶报告基因载体、质粒载体等。
3. 荧光素酶底物：荧光素、Renilla荧光素等。
4. 实验试剂：磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、DMSO、Trizol等。
5. 仪器：荧光显微镜、酶标仪、离心机等。
四、实验步骤1. 细胞培养：将HeLa细胞或293T细胞接种于培养皿中，置于培养箱中培养。
2. 载体构建：将荧光素酶报告基因载体和Renilla荧光素酶报告基因载体分别构建在质粒载体上。
3. 转染：将构建好的载体转染至细胞中，采用脂质体法或电穿孔法等。
4. 培养细胞：转染后，将细胞置于培养箱中培养。
5. 收集细胞：待细胞生长至一定密度后，收集细胞。
6. 提取细胞裂解物：将细胞裂解，提取细胞裂解物。
7. 添加底物：向细胞裂解物中加入荧光素酶底物和Renilla荧光素酶底物。
8. 酶标仪检测：将处理后的细胞裂解物置于酶标仪中，检测绿色荧光和红色荧光的强度。
9. 结果分析：比较绿色荧光和红色荧光的强度，分析细胞内基因表达和信号转导。
五、实验结果与讨论1. 实验结果在双荧光素酶实验中，通过比较绿色荧光和红色荧光的强度，可以定量地分析细胞内基因表达和信号转导。
双荧光素实验报告
一、实验目的1. 掌握双荧光素酶实验报告系统的基本原理和操作方法。
2. 学习利用双荧光素酶报告系统检测基因表达和调控。
3. 理解双报告基因在实验中的作用及其对实验结果的影响。
二、实验原理双荧光素酶实验报告系统是一种常用的分子生物学实验方法，用于检测基因表达和调控。
该系统利用两种荧光素酶——萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase, FLUC）和海肾荧光素酶（Renilla Luciferase, Rluc）——作为报告基因。
FLUC在生物发光反应中具有较高的光强度和较宽的线性范围，而Rluc则具有较长的发射波长，可以作为内对照，确保实验结果的准确性和可比性。
在双荧光素酶实验中，通常将带有实验报告基因的载体共转染带有Rluc的载体到细胞中。
通过检测两种荧光素酶的活性，可以评估实验组与对照组之间基因表达和调控的差异。
三、实验材料1. 细胞系：HEK293细胞2. 载体：带有实验报告基因的载体和带有Rluc的载体3. 转染试剂：脂质体转染试剂4. 检测试剂：荧光素酶底物和荧光素酶检测仪器四、实验步骤1. 细胞培养：将HEK293细胞接种于6孔板，培养至对数生长期。
2. 载体构建：将实验报告基因克隆到带有荧光素酶报告基因的载体中，构建双荧光素酶报告基因载体。
3. 转染：按照脂质体转染试剂说明书进行细胞转染，将双荧光素酶报告基因载体和带有Rluc的载体共转染到细胞中。
4. 细胞培养：转染后继续培养细胞，收集细胞样品。
5. 荧光素酶活性检测：按照荧光素酶底物说明书进行荧光素酶活性检测，分别检测FLUC和Rluc的活性。
6. 数据分析：将FLUC和Rluc的活性进行比较，分析实验组与对照组之间基因表达和调控的差异。
五、实验结果1. 荧光素酶活性检测：通过荧光素酶底物检测，成功检测到FLUC和Rluc的活性。
2. 数据分析：实验组与对照组相比，FLUC活性显著提高，而Rluc活性无明显变化。
六、实验讨论1. 双荧光素酶实验报告系统是一种有效的基因表达和调控检测方法，可以用于研究基因功能、信号通路和细胞反应。
双荧光素酶报告基因
双荧光素酶报告基因启动子活性分析（双荧光素酶报告基因实验）一、实验目的：分析启动子活性二、实验原理：荧光素酶报告基因的活性用Dual-Luciferase?Reporter AssaySystem（Promega）试剂盒来检测。
利用单通道多标记荧光检测仪测定荧光素酶活性。
在双荧光素酶系统中，除了用于检测启动子活性的萤火虫荧光素酶外，另外一种组成型表达的Renilla荧光素酶质粒PRL-TK也被同时转染入细胞内作为内参。
三、实验材料：Dual-Luciferase?Reporter Assay System （Promega）试剂盒，PBS，细胞裂解液，96孔，四、实验设备：单通道多标记荧光检测仪五、实验方法及步骤：1）启动子萤光素酶报告载体与共转染质粒按照质量等比例、总量0.8μg的原则转染细胞，36h后收获细胞；2）96孔板吸弃细胞培养基，PBS冲洗细胞一次，加入1×PLB细胞裂解液20μl，置于室温震荡裂解20min；3）轻轻吹打细胞，取10μl细胞裂解液加入50μl Luciferase Assay Reagent，轻轻震荡混匀，立刻置于单通道多标记荧光检测仪中测定Firefly Luciferase活性；4）读数后立即加入50μl Stop & Glo?Reagent轻轻震荡混匀，读取Renilla Luciferase活性；5）所得的结果为各个实验样品的Firefly Luciferase活性与Renilla荧光素酶活性的比值。
每个实验组重复3-4孔，整个实验独立重复3次。
实验结果均为3次独立的实验结果的平均值。
所有的结果均以平均值±标准差(mean±S.D.)表示。
六、注意事项1.做好对照。
2.多做几个复孔，求平均值。
七、补充知识点双荧光素酶报告基因实验1.试剂盒：Dual-Glo TM Luciferase Aassy System（promega E2920）组成如下：? Dual-Glo?萤光素酶缓冲液Dual-Glo?萤光素酶底物（冻干粉）Dual-Glo?Stop-Glo?缓冲液Dual-Glo?Stop-Glo?底物2.报告基因的作用细胞信号转导途径启动子/增强子受体结合病毒/细胞相互作用转录因子药物诱导作用或“效果”3.原理–制备含有luc/ R luc的DNA–转染–提供刺激–测量荧光–用海肾萤光素酶作对照归一实验变化归一反应=实验的(萤火虫萤光素酶)/ 对照的（海肾萤光素酶)4.载体- 萤火虫萤光素酶载体pGL3 家族pGL3-BasicpGL3-ControlpGL3-EnhancerpGL3-Promoter海肾萤光素酶报告基因载体pRL-TK5.试剂制备–将Dual-Glo? 萤光素酶缓冲液倒入Dual-Glo? 萤光素酶底物中，Dual-Glo? 萤光素酶试剂，分装后-70℃保存，避免反复冻融–用Dual-Glo? S top &Glo? 缓冲液按1:100 稀释Dual-Glo? Stop &Glo? 底物（现用现配）–所有的缓冲液存于室温, 所有的底物存于–20°C两步加入试剂：加，读，加，读6.检测步骤：实验前，将Dual-Glo? 萤光素酶试剂平衡到室温1.确认使用的细胞板可以用于荧光检测2.测萤火虫荧光素酶活性：向待测细胞板每孔中加入与培养基等体积的Dual-Glo? 萤光素酶试剂，混匀。
双荧光素酶报告实验案例
双荧光素酶报告实验案例一、实验背景。
想象一下，我们有一个超级神秘的基因A，科学家们都在猜测这个基因A可能会被另外一个基因B调控，但是一直没有确凿的证据。
这就像在黑暗中摸索，知道有东西在那里，但是看不清楚。
所以呢，我们就打算用双荧光素酶报告实验这个厉害的工具来揭开真相。
二、实验准备。
1. 构建报告质粒。
我们要构建两种报告质粒。
一种是把基因A的启动子区域（这个启动子就像是基因A的开关，控制着基因A什么时候工作）克隆到一个含有萤火虫荧光素酶基因（F Luc）的载体上。
这个萤火虫荧光素酶呢，就像是一个小信号灯，它发光的强度能告诉我们基因A启动子的活性有多强。
另一种报告质粒呢，是含有海肾荧光素酶基因（R Luc）的对照质粒。
这个海肾荧光素酶就像是一个小助手，它的作用是给我们一个稳定的参考信号，就像一个不变的灯塔，这样我们就可以根据它来比较其他信号的变化。
2. 细胞准备。
我们选择了一种合适的细胞系，比如说人类的细胞系HEK293细胞。
这些细胞就像是一个个小小的房子，我们要把构建好的质粒送进这些小房子里。
在把质粒送进去之前，得先把细胞养得壮壮的，就像照顾小宠物一样，给它们合适的温度（37°C）、湿度和营养丰富的培养基，让它们开开心心地生长。
三、实验过程。
1. 转染细胞。
我们用一种转染试剂（就像是一个小快递员）把构建好的两种质粒（含有基因A 启动子 F Luc的质粒和含有R Luc的对照质粒）一起送进HEK293细胞这个小房子里。
这里面就有个小技巧啦，如果转染的效率不高，那就像快递没送到一样，后面的实验结果可就不准了。
然后把转染后的细胞分成两组，一组是实验组，一组是对照组。
在实验组的细胞里，我们还要再把基因B这个可能的调控因子送进去，就像是在这个小房子里加入一个新的成员，看看它会对原来的居民（基因A启动子和荧光素酶）有什么影响。
2. 培养和检测。
转染后的细胞继续在培养箱里快乐地生长一段时间，这个时间就像等待种子发芽一样，要恰到好处。
双荧光素酶报告基因实验
双荧光素酶报告基因实验双荧光素酶报告基因实验是一种常用的生物学实验方法，用于研究基因的表达情况和调控机制。
该实验利用双荧光素酶作为报告基因，通过测定其荧光强度来反映目标基因的表达水平。
以下是双荧光素酶报告基因实验的详细步骤及注意事项。
实验步骤：1. 转染细胞，首先，将目标基因的启动子区域和报告基因的编码区域克隆到适当的表达载体中，然后将该表达载体转染至目标细胞中。
2. 处理细胞，在转染后的细胞中，根据实验设计的需要，可以给予不同的处理，如药物处理、基因敲除等。
3. 提取蛋白，收集处理后的细胞，进行蛋白提取，并测定蛋白的浓度。
4. 测定荧光强度，将提取的蛋白加入相应的底物，利用荧光分光光度计测定双荧光素酶的荧光强度。
5. 数据分析，根据测定的荧光强度数据，分析目标基因的表达水平及其受到处理的影响。
注意事项：1. 转染条件的优化，不同细胞对转染条件的要求不同，需要进行转染条件的优化实验，以确保转染效率和细胞存活率。
2. 底物的选择，选择适合双荧光素酶的底物，并根据实验需要选择合适的检测波长。
3. 控制实验的设计，在实验中应设置适当的对照组，以确保实验结果的可靠性和准确性。
4. 数据的统计分析，对实验数据进行统计分析，包括均值、标准差等指标的计算，以确保实验结果的可靠性。
总结：双荧光素酶报告基因实验是一种重要的分子生物学实验方法，可以用于研究基因的表达调控机制。
在进行该实验时，需要严格控制实验步骤，注意实验细节，以确保实验结果的准确性和可靠性。
希望本文提供的实验步骤和注意事项对您进行双荧光素酶报告基因实验有所帮助。
双荧光素酶报告实验
双荧光素酶报告实验实验名称：双荧光素酶报告实验实验基础知识：荧光素酶（英文名称：Luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的是一种学名为Photinus pyralis的萤火虫体内的荧光素酶。
在相应化学反应中，荧光的产生是来自于萤光素的氧化，有些情况下反应体系中也包括三磷酸腺苷（ATP）。
没有荧光素酶的情况下，萤光素与氧气反应的速率非常慢，而钙离子的存在常常可以进一步加速反应（与肌肉收缩的情况相似）。
双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测，通常一个报告基因作为内对照, 使另一个报告基因的检测均一化。
检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。
通常实验报告基因偶联到调控的启动子, 研究调控基因的结构和生理基础。
报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照, 使测试不被实验条件变化所干扰。
通过这种方法, 可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性, 比如, 培养细胞的数目和活力的差别,细胞转染和裂解的效率。
理想的双报告基因方法应该使用户能够以萤火虫荧光素酶所具有的速度,灵敏和线性范围对同一样品中的两个报告基因同时测定。
这在传统的报告基因, 如CAT, β-Gal和GUS是不可能的, 由于它们测试化学,处理要求所固有的局限。
相反, 结合萤火虫( Photinus pyralis ) 和海洋腔肠( Renilla reniformis ) 双荧光素酶的系统可满足这些要求，在单管中完成这些测试。
实验原理：将目的基因3’UTR区域或者lncRNA序列构建至载体中报告基因Luciferase的后面，构建荧光素酶质粒。
然后转染至细胞中，通过比较过表达或者干扰miRNA后，检测报告基因表达的改变（以萤火虫荧光素酶为报告基因，以海肾荧光素酶为内参基因）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用。
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合同号：HY-XXXX 双萤光素酶报告基因检测
（miRNA靶基因验证）实验
和元生物技术（上海）有限公司，2013年4月21日
摘要：本实验使用双萤光素酶报告基因检测系统验证hsa-mir-21对目的基因Tropomyosin 1（TPM1）的抑制作用；通过检测带有TPM1的3’UTR的luciferase在hsa-mir-21过表达时的表达情况，同时结合带有突变预测结合位点的3’UTR的luciferase的表达，进一步确定了hsa-mir-21与TPM1靶基因3’UTR的作用位点。
关键词：hsa-mir-21，3’UTR，Tropomyosin 1（TPM1），Dual-Reporter Assay
1.实验原理:
萤光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性萤光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的萤光素酶。
单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响，而双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供一基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。
Dual-Luciferase双萤光素酶报告基因检测系统在细胞中同时表达萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶，两者没有种源同源性并对应不同的反应底物，故而没有交叉干扰。
得益于超强的光信号和超高的信噪比，本系统被广泛用于miRNA靶基因验证。
由于miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用，可以将目的基因3’UTR区域构建至载体中报告基因luciferase的后面，通过比较过表达或者干扰miRNA后，报告基因表达的改变（监测萤光素酶的活性变化）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用；结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。
2.实验目的:
验证hsa-mir-21与靶基因Tropomyosin 1 3’UTR是否发生作用并进一步确定hsa-mir-21与靶基因Tropomyosin 1 3’UTR的作用位点。
1.质粒与细胞株
pMIR-对照质粒（和元生物）；pMIR-TPM1-WT野生型3‘UTR实验质粒（和元生物）；pMIR-TPM1-MUT突变型3‘UTR实验质粒（和元生物）；pRL-CMV（E2261，Promega）；293T细胞株来源于ATCC，细胞培养条件为DMEM+10% FBS+5% CO2。
2.实验试剂
lipofectamine 2000（11668-019, invitrogen）; 胎牛血清(FBS)（SV30087.02，Hyclone）；DMEM（12800-017，GIBCO）；胰酶（Trypsin-EDTA）（11668-500，Invitrogen）；24孔板（3524，Corning）; miR-X mimics（和元生物）；Dual-Luciferase Reporter Assay System（E1910，Promega）；Opti-MEM（31985-062, invitrogen）。
3.仪器设备
荧光显微镜（IX71，奥林帕斯）；CO2培养箱（3111，Thermo）；生物安全柜（BSC -Ⅱ-A2，上海净化）；低速离心机（TDZ4-WS，上海湘仪）；血球计数板（REICHERT，Bright-Line）；
水浴锅（HWS12，上海一恒）；酶标仪（Infinite M1000，TECAN）
4.统计学处理
GraphPad Prism（Ver5，GraphPad Software）作图，并进行双侧t检验。
实验共分以下3个主要步骤：
1.质粒转染细胞；
2. 双报告基因检测；
3. 统计学分析。
1.质粒转染细胞：
(1)细胞铺板：将细胞按70%的汇合度接种到96孔板。
(2)转染：16小时后转染萤光素酶报告基因质粒和RNA，每个样品设置6个复孔
1)配制DNA和转染试剂: 96孔板转染质粒时每孔比例为Firefly：
Renilla：转染试剂=0.1μg：0.01μg：0.25μl
2)配制RNA和转染试剂稀释液，RNA的终浓度为100nM，转染试
剂每孔0.25μL
3)稀释好的DNA和RNA及转染试剂，常温孵育5min
4)将稀释好的DNA和RNA分别和转染试剂混匀，常温孵育20min
5)每孔弃去50ul培养基，将25μL DNA转染混合液和25uL RNA转
染混合液分别添加到每孔细胞样品中，
6)转染6小时后，换新鲜完全培养基
2.双报告基因检测
(1)质粒共转染48小时后，弃去培养基，用100μl 1XPBS洗1遍
(2)倾斜96孔板，吸干剩余的PBS
(3)去离子水将5XPLB稀释成1XPLB，使用前放到常温
(4)每孔加50μl稀释好的1X PLB，摇床常温条件下摇15min，进行裂
解
(5)白色不透光的96孔酶标板中每孔加步骤4的上清液10μl，加入100
μl预先混好的LAR II，2s后测数据
(6)每孔添加100μl预先混好的Stop&Glo Reagent，静止2s后，测数
据
注意：进行Luciferase活性检测时，需在避光条件下进行。
5.实验结果：
表1. 空白校准后的数据：
图1.hsa-mir-21与TPM1验证结果
**表示p<0.01
从图1的结果可以看到，hsa-mir-21可以调控带有TPM1的3‘UTR的luciferase的表达（p<0.01）。
在结合位点突变后，这种调控关系消失，由此证实了hsa-mir-21是通过该结合位点调控luciferase的表达。
6.参考文献：
Zhu S, Si ML, Wu H, Mo YY. MicroRNA-21 targets the tumor suppressor gene tropomyosin 1 (TPM1). J Biol Chem. 2007;282(19):14328-14336.。