质粒转化大肠杆菌
质粒DNA的转化操作步骤
该实验主要有两个用途：
1．重组质粒的鉴定。当质粒的重组或其它载体重组后，通常会发生质粒的重组失败，包括质粒的自身环化。因而要求进行筛选，把重组成功的质粒找出来。在目前常用的质粒和其它载体中含有相应的抗生素抗性基因，一旦重组成功，质粒环化（包括自身环化），抗生素抗性基因表达，被转化的大肠杆菌便具备抗相应抗生素的能力，可以含该抗生素的培养基中生长传代，不然，重组失败，大肠杆菌便不能抵抗该抗生素而死亡。
2．为扩增质粒和其它载体作准备。由于大肠杆菌繁殖快，在适宜的条件下繁殖一代仅需要20~30分钟，而且常用质粒可以在大肠杆菌中达到几百个拷贝，因此，通过对转化成功的大肠杆菌培养，可以在短时内极大地扩增目的质粒。（作为分子生物学用大肠杆菌，是经过实验室改造过的工程菌。）
【原理】
转化是将外源DNA分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶(R-，
M-)。将对数生长期的细菌(受体细胞)经理化方法处理后，细胞膜、的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子(带有异源DNA分子的细胞)。
本实验采用CaCl2法制备感受态细胞。其原理是细胞处于0～4℃，CaCl2低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃90秒热激处理，促进细胞吸收DNA得合物。将细菌放置在非选择性培养基中（无抗LB培养液）于37℃振动培养一段时间，可使细菌复苏，表达质粒编码的抗生素抗性基因，在转化过程中获得的新的表型，提高转化效率。如氨苄青霉素耐药(Ampr)得到表达，然后将此细菌培养物涂在含Amp的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。
本实验是将[ 某]重组质粒转化DH5α扩增菌，转化后在含Amp的培养基上进行筛选，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。含[ 某]重组质粒的DH5α菌用于质粒DNA的扩增，获得的质粒将作为限制性内切酶的酶切底物DNA。
【实验步骤】
自-70℃冰箱中取出受感态大肠杆菌，插入湿冰中溶解约15分钟，轻轻混匀。吸取50ul移入1.5ml管，并立刻将细菌放回-70℃冰箱。
细菌50 ul
质粒1 ul
轻轻混匀，静置冰上30分钟。
于42℃水浴中热休克细菌90秒，迅速移入湿冰中，静置3分钟，加入700ul无抗LB 培养液，放入37℃恒温箱摇床，220rpm摇晃培养45min。取30-200ul涂于含氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上，待干燥后，倒置，存放于37℃的培养箱中过夜。
次日，检查各培养皿中是否出现菌落。
【试剂与器材】
1.LB液体培养基 10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl加水至1L，高压灭菌消毒
2.LB固体培养基在1升LB液体培养基中加15g琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手背时铺培养皿。
3.倒A+、K+平板时，应冷却到50℃以下加抗生素
LB培养基
细菌培养用胰化蛋白胨10g
细菌培养用酵母提取物5g
NaCl 10g
加800ml水，放入磁力搅拌棒，在磁力搅拌器上搅拌至彻底溶解，用5M NaOH
（约0.2 ml）调节pH值至7.0，加水定容至1000 ml。高压15 lbf/in2（1.034×
105pa）消毒30分钟，冷却后可加入氨苄青霉素（50mg/ml）500ul，视载体特性
而定，混匀，即为含抗生素的LB培养液。存放于避光处。
含有琼脂的培养基
即在以上1000ml培养基中加入15g细菌培养用琼脂。
抗生素琼脂平板
待含有琼脂的培养基冷却后，加入抗生素，倾入培养皿，约30~50 ml，用煤气
灯火焰掠过培养基表面，以消除气泡。冷却后，标记，封于塑料袋中，倒置，
于4℃冰箱内避光保存。
大肠杆菌DH5α
DH5α菌株是一种能够摄入外源DNA的受容菌，普通的大肠杆菌细胞内有一种“免疫”机制，即当外源DNA
侵入时，会产生诸如限制性内切酶类的物质，将外源的DNA剪切掉，而其自身DNA因被修饰（如甲基化）所以不被限制酶识别，不会被剪切。这样的菌是不能直接用于基因工程的，我们总不希望目的基因导入进去还来不及复制就被剪切掉。DH5α菌株是一种经诱变的菌株，其基本特性是：Rˉ、Mˉ、AMPˉ。Rˉ是指DH5α菌株缺乏DNA 修饰，即其自身DNA 不会被修饰。Mˉ是指其缺乏“免疫”机制，不会对导入的外源DNA切割。AMPˉ是指其对氨苄青霉素敏感。DH5α菌株可以用于制作基因库等，除此之外，因其特性，可用作基因工程的受体菌。
如长时间保存需加灭菌甘油，在-20摄氏度保存。
限制修饰系统缺陷的变异株
即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
质粒DNA提取方法与原理
质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA 发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 一、试剂准备 1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl (pH 8.0）1 2.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。 任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。50 mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。 NaOH也使DNA变性，但只是个副产物，在溶液3加入后其中的醋酸和NaOH中和，质粒DNA恢复活性 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。 这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS 也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS 呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。基因组 DNA 的断裂会带来麻烦。 3.溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。 溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往1%的 SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是
质粒提取总结
碱裂解法抽提质粒原理 溶液I，50 mM葡萄糖 /25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH ； （溶菌酶：使细胞壁裂解；RNase：将裂解完的RNA去除，防止RNA污染） 溶液II， N NaOH / 1% SDS； 溶液III，3M醋酸钾 / 2 M醋酸。 溶液I的作用： ①任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。 ②50mM葡萄糖：加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。 ③EDTA：EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。 如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。 溶液II： 这是用新鲜的 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。 要新从浓NaOH稀释制备的NaOH，是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。 事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。
大肠杆菌质粒转染实验-QIAGEN大提试剂盒
质粒抽提 一、溶液及培养基配制： 1、LB液体培养基 （1）配方: 酵母提取物（Yeast extract）5g/L 胰蛋白胨（Tryptone）10g/L （2）配制： A、称量：称取培养基各成分所需量，置于烧杯中。 B、溶化：加入所需水量2/3的蒸馏水于锥形瓶中，搅拌使药品全部溶化。 C、定容。 D、加塞、包扎。 F、高压灭菌121 C, 30min ,灭菌后室温保存备用。若要分装需要在超净台内。 G、培养基完全溶解，降至室温后，加氨苄霉素（AMP ）。先将AMP用三蒸水配制为 100mg/ml母液，而后每1ml母液加至1000ml培养基。（可以多配制一些，分装为1ml/管）2、LB固体培养基 （1）配方: 酵母提取物(Yeast extract)5g/L 氯化钠（NaCl）5g/L 胰蛋白胨（Tryptone）10g/L 氨苄青霉素溶液100^g/ml （终浓度）（即100mg溶于1ml超纯水或生理 盐水或PBS，再加入1000ml培养基） 琼脂粉15g/L （2）配制： A、称量：称取培养基各成分所需量，置于烧杯中。 B、溶化：加入所需水量2/3的蒸馏水于烧杯中，搅拌使药品全部溶化。 C、5mol/L NaOH 溶液调pH 到7.4。 D、定容。 E、分装、加塞、包扎。 F、高压灭菌121 C, 30min。 G、火菌后，将融化的LB固体培养基置与55 C的水浴中（或室温），待培养基温度降到55 C时（手可触摸）加入抗生素，（免温度过高导致抗生素失效），并充分摇匀。 （3）倒板： 一般20ml倒1块板，培养基倒入培养皿后，打开盖子，水分晾干后盖上盖子并用封口膜封口，4 C保存备用，使用前提前拿出，防止水蒸气滴入板中。 首要检查是否有足够的固体和液体LB培养基，基本上每个质粒需要一块固体培养基，小摇 的2ml和大摇的250ml LB培养基。小摇的可以在一个50ml离心管中预备着，每次直接取 用。转化所需L形玻璃棒需确认已灭菌摇菌器申请，张评浒老师，王雪师姐； 注意：考虑到多种东西需要灭菌，可以在转化之前或者小摇大摇那天一起灭菌。所有需要提前灭菌的东西有：足量液体LB培养基灭菌后加入AMP蓝黄白枪头至少个一盒，备用； 1.5ml doff 管；Beckman离心机专用离心管；锡箔纸；250ml锥形瓶，500或者1000ml锥形瓶；电动移液器所用移液管（可以考虑用5ml移液枪，则先灭菌5ml枪头）；超纯水和TE
质粒提取有关问题及注意点
质粒提取常见问题解析 涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？ 参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。 原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常? 参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。解决办法： 1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。 2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。 3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！ 【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常： 1、利用你的嗅觉。只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。 2、肉眼观察活化菌株。对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。】 未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？ 参考见解： 1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。 2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。 3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。 4、碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。 5、溶液使用不当：溶液2和3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。 6、吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB培养液体积。 7、质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。 8、乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。 9、洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。 10、洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。
大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化解析
一、目的 1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。 2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。 二、原理 （一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理 所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子 的感受态细胞。在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。 目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。主要有两种假说： 1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。证据有： （1）发芽的芽孢杆菌容易转化； （2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化； （3）适量的溶菌酶能提高转化率。 2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；
（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。 目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。有人根据pBR322 质粒DNA对E?coli K――12X1776菌株的转化结果，认为： 近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。 （二）重组DNA 的转化原理 我们已经制备好大肠杆菌感受态细胞，接下的实验是把重组的DNA 引入受体细胞，使受体菌具有新的遗传特性，并从中选出转化子。作为受体的大肠杆菌C600 或DH5α，必须不同外来DNA分子发生遗传重组，通常是rec基因缺陷型的突变体，同时它们必须是限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株。这样外来的DNA分子不会受其限制酶的降解。保持外来DNA 分子在受体细胞中的稳定性。制备的大肠杆菌细胞就具有这三种缺陷（rk- mk- rec-）同时此受体细胞还是氨苄青霉素敏感（Ap）。 在体外构建好的重组分子上具有分解氨苄青霉素（Ap）基因存在，当它导入受体细胞后，就赋于这些受体细胞新的特性，即Ap 抗性。同时载体质粒上具有乳糖操纵的β一半乳糖苷酶基因(lacZ，我们可以利用外源基因插入载体β一半乳糖苷酶基因(lacZ，使其失去β一半乳糖苷酶活性的原理来选择新构建的重组子。
质粒提取
1.菌液接种到500ml培养基中，加抗生素至工作浓度，37℃，300rpm过夜 2.4000rpm，15min离心菌液收集菌体。 3.用20ml solutionⅠ溶解菌团，充分打散混合均匀。 4.称取0.1g溶菌酶加入菌液，室温放置5min。 5.加入40ml solution Ⅱ，轻轻混合至澄清,冰上放置5min。 6.加30ml solution Ⅲ，轻轻混匀，冰浴10min。 7.4000rpm，20min，离心后将上清液倒到200ml量筒里面。 8.加入0.6倍体积的异丙醇混匀并室温放置10min。10000rpm离心15min。 9.用6.5ml的TE重悬沉淀，转移到4个EP管中，13000rpm 离心5min。 10.上清转移到15ml的离心管中，加7.2gCsCl和 200ul的10mg/ml的EB，混匀。 11.在超速离心管中加样并封口。60000rpm 10℃离心16h。 12.用一个注射器在超速离心管中上面戳一个孔，留下针头，并用另外一个注射 器从红色质粒带旁边管壁戳进去，吸取1-1.5ml，装入新的离心管中。 13.加5ml TE饱和丁醇，混匀后静置各相分离后去掉上层桃红色丁醇，重复这一 步，直到下层水相中没有桃红色。转移下层水相到EP管中。 14.加入1/10体积5M的Nacl和2倍体积的无水乙醇。在-20℃下放置20min。 15.13000rpm，10min离心后去上清，重悬沉淀于1ml的TE然后转移至EP管。 16.用1倍体积的25/24/1的酚/氯仿/异戊醇抽提两次。 17.每管加1/10体积的2.5M的乙酸钠和2倍体积的乙醇， -20℃下放置20min。 13000rpm离心10min，然后用70%的乙醇轻轻润洗并晾干EP管。 18.重悬于1ml TE中，并在OD260下测量浓度。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化（原理） 感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。 1、感受态细胞的概念 所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。 制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。 2、转化的概念及原理 在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA 导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。 等化学试剂法）处理受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl 2 后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 法），该法最先是由Cohen于1972大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl 2 的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球年发现的。其原理是细菌处于0℃，CaCl 2
质粒提取操作步骤
操作步骤： 本实验方法适用于从1-10ml过夜培养的大肠杆菌菌液中提取质粒。提取量受菌株、质粒拷贝数、菌液体积和培养时间、培养基类型等因素的综合影响。 1.收菌：将过夜培养（37℃，12-16小时）的菌液于室温≧10,000g 离心1-2分钟，彻底弃除上清。 注意：高拷贝质粒建议使用≦5ml菌液；菌液用量过大不仅不能增加质粒产量，反而会因裂解不完全或杂质封闭硅胶膜而降低产量；培养时间不宜过长，否则会增加开环结构质粒的比例。。 2.重悬：加入250μl含RNase A的细胞悬浮液（S1），充分混悬震荡 或用枪头反复抽打使细菌彻底分散悬浮。 3.裂解：加入250μl细胞裂解液（S2），轻轻上下颠倒混合5次，室 温静置1-5分钟，待细菌充分裂解，溶液变半透明。 注意：避免剧烈震荡导致基因组DNA裂解，裂解时间不能超过5分钟。 4.中和：加入350μl中和缓冲液（S3），轻轻上下颠倒混合5次，充 分混匀，避免剧烈震荡。室温下≧12,000g离心10分钟。 5.DNA结合：小心吸取上清，转移到插入收集管的离心吸附柱内，室 温下≧12,000g离心1分钟，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中。 6.清洗：加入500μl漂洗液（WB,请确认已加入乙醇！）于离心吸附 柱中，室温下≧12,000g离心30秒，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中。 7.再次清洗：加入500μl漂洗液（WB）于离心吸附柱中，室温下≧ 12,000g离心30秒，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插
回收集管中。将离心吸附柱开盖再次离心2分钟，彻底除去残余漂洗液。 8.洗脱：小心取出离心吸附柱，将其套入一个新的1.5ml灭菌离心 管中。向硅胶吸附膜的中央加入100μl洗脱缓冲液（EB），室温放置1分钟后，≧12,000g离心1分钟收集质粒DNA。 注意：为提高质粒浓度，最低可使用30μl的EB溶液，离心收集后壳将洗脱的质粒溶液再次加入离心吸附柱中重复洗脱；使用100μlEB溶液则无需二次洗脱；对6kb以上的质粒，可使用预先加热至55℃的EB溶液洗脱以提高产量；EB溶液不含EDTA，故不会影响荧光测序等后续反应；如必须使用无菌去离子水洗脱，需注意其pH值是否接近中性，否则应使用NaOH溶液将pH值调节至7.0-8.5之间。 9.储存：弃除离心吸附柱，纯化的质粒可直接用于后续反应或于 -20℃长期保存。 注意：经检测，本试剂盒从endAˉ菌株（如DH5α，TOP10，XL1-blue等）中提取的质粒反复冻融20次无降解；如需在4℃长期保存或者保存从endA+菌株（如JM109，HB101，BL21等）中提取的质粒，可向每100μl质粒溶液中加入11μl的10×TE溶液，但含EDTA的质粒溶液不可用作荧光测序模板。
大肠杆菌质粒DNA的提取_百替生物
一、大肠杆菌质粒DNA的提取 质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法： 碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下： 1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。 2、37℃振荡培养过夜。 3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。 4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。 5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管 8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。 9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。 10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。 11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中 煮沸法 1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。 2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。 3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。 4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。 5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。 6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。 7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。 8、取20ml进行电泳检查。 [注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。 2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶菌。 3. 提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚克隆及连接反应等。 质粒DNA的大量提取和纯化 在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。 （一）、碱法 1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250ml，4℃下5000g离心15分钟,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。 2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml用冰预冷的STE中（此步可省略）。 3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞。 4、将细菌沉淀物重新悬浮于5ml溶液I中,充分悬浮菌体细胞。 5、加入12ml新配制的溶液II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴10分钟。 6、加9ml用冰预冷的溶液III, 摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置15分钟,此时应形成白色絮状沉淀。
质粒DNA转化感受态大肠杆菌 protocol
质粒DNA转化感受态大肠杆菌 一、实验原理 转化（transformation）是将一种生物（供体）的遗传物质（通常为DNA）转入另一种生物（受体）并使其在受体中得以保存和繁殖的过程。大肠杆菌不是天然感受菌，在低温（0~5℃）环境下经CaCl2处理，细胞壁变松变软后能摄入外源DNA，这种状态称为感受态细胞（competent cell）。质粒DNA或重组DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。 二、实验材料准备 1. 器材 微量移液取样器，移液器吸头，恒温水浴锅，制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，1.5 ml Eppendorf管，50 ml离心管，乳胶手套，恒温培养箱 2. 试剂 LB液体培养基、LB固体培养基、100mg/ml 氨苄青霉素(或卡拉霉素) 、感受态细胞 3. 材料处理 转化之前超净台紫外照射15-20min； 枪头、50ml离心管需提前灭菌，烘箱烘干； 液体LB培养基灭菌后放到冷库，防止长菌； 三、转化 1．从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,置冰上解冻1-2 min。 2．加入质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟。
3．42℃水浴中热击90秒, 然后迅速置冰上2min，整个过程不要振荡菌液。 4．向管中加入200μl LB液体培养基(不含抗生素),混匀后37℃振荡培养（225 rpm）1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因。 5. 将上述菌液摇匀后涂布于含Amp（或kna）的LB琼脂平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后,37℃倒置培养12-16小时。 四、注意事项 1.加液体LB培养基之前观察其是否长菌 2.玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂 3.提前打开水浴锅，将温度调到42度 4.实验目的是表达蛋白，可热击完直接涂平板；目的是质粒扩增或后续要PCR，需在热击 后37℃振荡培养复苏1小时 5.实验室常用的用于质粒扩增的感受态菌是Top10，用于质粒表达的感受态菌是BL21 Star (DE3)
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项 1、感受态细胞的概念 重组DNA分子体外构建完成后必须导入特定的宿主（受体细胞）使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。所谓的感受态：即指受体或者宿主最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，是由受体菌的遗传性状所决定的同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。制备出的感受态细胞暂时不用时可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存有效期6个月 。 2、转化的概念及原理 在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。受体细胞经过一些特殊方法 ，如电击法、CaCl2等化学试剂法处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。大肠杆菌的转化常用化学法CaCl2法该法最先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上可选出所需的转化子。Ca2+处理的感受态细胞其转化率一般能达到5× 106~2×107转化子/ug质粒DNA可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上联合其它的二价金属离子如Mn2+、Co2+、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高 100~1000倍。化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便愈来愈为人们所接受。 3、感受态细胞制备及转化中的影响因素
大肠杆菌质粒提取
质粒小提试剂盒 （离心柱型） 使用前在漂洗液PW中加无水乙醇 1.柱平衡：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入平衡液BL，12000rpm、 离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱放回收集管中。（使用当天处理过的柱子） 2.取1-5ml过夜培养的菌液，12000rpm、离心1min（EP管收集3次）尽量吸 除上清 3.向留有沉淀的离心管中加250μl溶液P1（检查是否已加入RNaseA），涡旋 彻底悬浮菌体沉淀（不要留有菌块，会影响裂解）。 4.向离心管中加250μl溶液P2，温和的上下翻转6~8次使菌体充分裂解，室 温放置3~5min（温和翻转，不要剧烈震荡。此时菌液变得清亮粘稠，时间应不超过5min，以免质粒受破坏）。 5.向离心管中加350μl溶液P3，立即温和的上下翻转6~8次，充分混匀，此 时出现白色絮状沉淀。12000rpm、离心10min。（P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀，如有微小沉淀可再次离心后取上清）。（此时可做胶，以备检测用） 6.取上清转移到吸附柱CP3中，不要吸出沉淀。12000rpm、离心1min，倒掉 收集管中的废液，吸附柱放回收集管中。 7.向吸附柱CP3中加600μl漂洗液PW（检查是否加入无水乙醇），12000rpm、 离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱放回收集管中。 8.重复操作步骤7。 9.将吸附柱CP3放回收集管中，12000rpm、离心2min，将吸附柱中残余漂洗 液除去（可将吸附柱CP3开盖放置数分钟，以彻底晾干残余漂洗液）。 10.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加100μl ddH2O/EB，室温放置2min，12000rpm、离心2min，将质粒溶液收集到离心管中，-20℃保存。 注意：使用前检查平衡液BL、溶液P2、溶液P3是否出现浑浊，如有浑浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清
第三章 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 第一节概述 在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。 转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和 RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。 为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA 的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。 本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。 本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。 第二节材料、设备及试剂 一. 材料 E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA: 购买或实验室自制，eppendorf管。 二. 设备 恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光 光度计,微量移液枪。 三. 试剂 1.LB固体和液体培养基：配方见第一章。 2.Amp母液：配方见第一章。 3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
质粒转化大肠杆菌
质粒DNA的转化操作步骤 该实验主要有两个用途： 1．重组质粒的鉴定。当质粒的重组或其它载体重组后，通常会发生质粒的重组失败，包括质粒的自身环化。因而要求进行筛选，把重组成功的质粒找出来。在目前常用的质粒和其它载体中含有相应的抗生素抗性基因，一旦重组成功，质粒环化（包括自身环化），抗生素抗性基因表达，被转化的大肠杆菌便具备抗相应抗生素的能力，可以含该抗生素的培养基中生长传代，不然，重组失败，大肠杆菌便不能抵抗该抗生素而死亡。 2．为扩增质粒和其它载体作准备。由于大肠杆菌繁殖快，在适宜的条件下繁殖一代仅需要20~30分钟，而且常用质粒可以在大肠杆菌中达到几百个拷贝，因此，通过对转化成功的大肠杆菌培养，可以在短时内极大地扩增目的质粒。（作为分子生物学用大肠杆菌，是经过实验室改造过的工程菌。） 【原理】 转化是将外源DNA分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶(R-， M-)。将对数生长期的细菌(受体细胞)经理化方法处理后，细胞膜、的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子(带有异源DNA分子的细胞)。 本实验采用CaCl2法制备感受态细胞。其原理是细胞处于0～4℃，CaCl2低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃90秒热激处理，促进细胞吸收DNA得合物。将细菌放置在非选择性培养基中（无抗LB培养液）于37℃振动培养一段时间，可使细菌复苏，表达质粒编码的抗生素抗性基因，在转化过程中获得的新的表型，提高转化效率。如氨苄青霉素耐药(Ampr)得到表达，然后将此细菌培养物涂在含Amp的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。 本实验是将[ 某]重组质粒转化DH5α扩增菌，转化后在含Amp的培养基上进行筛选，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。含[ 某]重组质粒的DH5α菌用于质粒DNA的扩增，获得的质粒将作为限制性内切酶的酶切底物DNA。 【实验步骤】 自-70℃冰箱中取出受感态大肠杆菌，插入湿冰中溶解约15分钟，轻轻混匀。吸取50ul移入1.5ml管，并立刻将细菌放回-70℃冰箱。 细菌50 ul 质粒1 ul 轻轻混匀，静置冰上30分钟。 于42℃水浴中热休克细菌90秒，迅速移入湿冰中，静置3分钟，加入700ul无抗LB 培养液，放入37℃恒温箱摇床，220rpm摇晃培养45min。取30-200ul涂于含氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上，待干燥后，倒置，存放于37℃的培养箱中过夜。 次日，检查各培养皿中是否出现菌落。
质粒转化大肠杆菌实习报告--附实验图片
细胞转基因技术研究进展 1实验内容：原核细胞转基因:大肠杆菌感受态细胞的制备, 转化和鉴定 2实验原理及技术介绍： 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。但是在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。 所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。目前对感受态细胞能接受外来DNA分子的本质看法不一。主要有两种假说:一种是局部原生质体化假说——细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过质膜进细胞。另一种是酶受体假说——感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点，使DNA分子能进入细胞。 本实验通过CaCl2对特定的大肠杆菌处理，制备感受态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA，如一些插入目的DNA片段的重组质粒，产生5×106~2×107个转化的菌落。当质粒与这些大肠杆菌混合后，质粒粘附在大肠杆菌的表面，在42℃的温度时，大肠杆菌出现热休克，质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随后，加入LB培养液，于37℃振动培养可使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因，提高转化效率。转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代，形成菌落。 本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与质粒共保温,实现转化。由于质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Amp)，可通过Amp抗性来 1
常见大肠杆菌菌株的基因型
常见大肠杆菌菌株的基因型 1：DH5a菌株 常用于质粒克隆的菌株。使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk )，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株 用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS ，Camr 4：JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株 基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB ，lacIq，lacZΔM15] 5：TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU ，galK ，rps，(Strr) endA1，nupG 6：HB101菌株 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验 基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1 7：Top10F'菌株 带lacIq，需加IPTG诱导表达克隆于lac启动子后的外源基因，用于蓝白斑筛选时，需加入IPTG和X-Gal。 基因型：F'{lacIq,Tn10(TetR)}mcrA△(mrr-hsdRMS-mcrBC), ψ80 ，lacZ△M15, △lacX74, deoR, recA1, araD139, △(ara-leu), 7679, gal, λ- rpsL(strR)endA1, nupG