纤维素酶活的测定
纤维素酶酶活的测定方法
检测分析纤维素酶酶活的测定方法河南省科学院生物研究所 刘德海 杨玉华 安明理河南省饲料产品质量监督检验站 陈小鸽 饲用纤维素酶在饲料工业中已普及应用,对其质量检测显得日益重要。
纤维素酶是一种复合酶,按作用底物的能力划分为两部分,一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶,称为C1酶;另一部分是对羧甲基纤维素钠(Na-CMC)起水解作用的酶,称为C x酶。
据此,一般采用两种测定方法,一种是适用于C X酶的CMC法,另一种是适用于C1酶的滤纸法。
下面就此两种方法作一介绍。
1 C MC(羧甲基纤维素)法1.1 材料1.1.1 饲用纤维素酶 由河南省科学院生物研究所提供。
1.1.2 试剂 磷酸氢二钠、柠檬酸、羧甲基纤维素、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。
1.1.3 仪器 721型分光光度计、恒温水浴锅、PHS-2酸度计、秒表。
1.1.4 试剂配制1.1.4.1 pH5.0柠檬酸缓冲液 制取0.2mol/L 磷酸氢二钠液(称取7.16g磷酸氢二钠溶解于蒸馏水中,定容至100mL)和0.1mol/L的柠檬酸液(称取2.1g柠檬酸溶解于蒸馏水中,定容至100 mL),取磷酸氢二钠液24.3mL、柠檬酸液25.7mL 混匀,用精密酸度计测至pH值为5.0。
1.1.4.2 羧甲基纤维素溶液 准确称取2.0g羧甲基纤维素钠盐溶于200mL水中,沸水浴中加热至溶化,过滤,取滤液100mL,加柠檬酸缓冲液20 mL、蒸馏水40mL,混匀,贮存于冰箱中备用。
1.1.4.3 3,5-二硝基水杨酸显色液 准确称取6.3g3,5-二硝基水杨酸置于2mol/L氢氧化钠262mL溶液中,然后加酒石酸钾钠的热溶液(182.0g酒石酸钾钠溶于500mL水中),再加5.0 g苯酚和5.0g亚硫酸钠,搅拌至溶解,冷却后定容至1000mL,贮于棕色瓶中置冰箱中备用。
1.1.4.4 0.1%标准葡萄糖溶液 准确称取经105℃烘至恒重的无水葡萄糖250.000mg,溶于蒸馏水中,定容至250mL。
纤维素酶活力的测定
纤维素酶活力的测定（CMC糖化力法）1、定义：1克固体酶粉（或1毫升液体酶），在40℃pH﹦4.6条件下，每分钟水解羧甲基纤维素钠（CMC-Na），产生1.0ug的葡萄糖，即为1个酶活单位，以u/g（u/ml）表示。
2、原理：CMC-Na在纤维素酶的作用下,水解产生纤维寡糖、纤维二糖、葡萄糖等还原糖，还原糖能将3，5﹣二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，在540nm波长下测定吸光度值A，吸光度与酶活成正比。
CMC-Na糖化力主要代表内切β-1.4-葡聚糖的活力和外切酶活力总和。
3、试剂：3.1 0.1mol/LpH﹦4.6醋酸﹣醋酸钠缓冲溶液：将49.0ml0.2mol/L醋酸钠溶液和51.0ml0.2mol/L醋酸溶液混合后加100ml蒸馏水。
注意：0.2mol／L醋酸钠溶液：称取27.22g结晶乙酸钠（AR）定容至1000ml。
0.2mol／L醋酸溶液：称取冰乙酸（AR）11.5ml定容至1000ml。
3.2 3，5二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.3克3,5-二硝基水杨酸用水溶解，加入21.0克NaOH，182克酒石酸钾钠，加500ml水，加热溶解后再加入5.0克重蒸酚和5.0克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却，定容至1000ml，存于棕色瓶中，放置7天后使用。
3.3 葡萄糖标准溶液（1.0mg /ml）：称取1.000克葡萄糖（AR）(105℃干燥至恒重)用蒸馏水溶解后定容至1000ml，冰箱保存备用。
3.4 羧甲基纤维素钠溶液：称2.0gCMC-Na溶于200 ml蒸馏水中，加醋酸缓冲溶液100 ml,混匀后存于冰箱内备用。
配后隔天使用。
4、仪器4.1 分光光度计4.2 恒温水浴，50℃4.3 25 ml具塞刻度试管5、分析步骤：5.1标准曲线绘制：取25ml具塞刻度试管6支，加入1.0 mg /ml的葡萄糖标准溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸馏水2.0、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS试剂1.5 ml，混匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却，用水定容至25 ml，摇匀，测吸光度A，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。
纤维素酶活测定
【实验目的】1、学会并掌握用3、5—二硝基水杨酸法测定酶活力方法2、巩固使用分光光度计【实验材料】1、3、5—二硝基水杨酸显色液；2、0．5%羧甲基纤维素钠水溶液（CMC）：用0.1mol/LPH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置；3、标准葡萄糖溶液（1mg/mL）。
【实验步骤】1、标准曲线的绘制：分别吸取0.2、0.4、0.6 、0.8、1.0mL的葡萄糖于5支试管中,均用蒸馏水稀释至1mL,加3.5-二硝基水杨酸显色剂3mL,在沸水浴中煮沸显色10分钟,冷却,定容至25ml.以1毫升蒸馏水代替糖作空白管,同样定容至25ml。
在550nm 处比色。
以光密度为纵坐标，以葡萄糖微克数为横坐标，绘出标准曲线（见表一）。
2、空白管的测定：取1毫升酶液,沸水浴5分钟，冷却加3毫升0.5%CMC，与样品管同时放入50度水浴30分钟。
其它操作同样品管。
3、样品的测定：取0.5%羧甲基纤维素钠溶液3毫升，酶液1毫升,于50度水浴中糖化30分钟,取出,立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活,得糖化液，冷却加入3毫升显色液，再沸水浴10分钟，冷却后加水定容至25毫升，混匀，550nm测OD值（见表二）。
实验结果：见表一、表二：表一标准曲线的测定表二样品的测定图一：标准葡萄糖光吸收曲线结果分析：拟合所得的标准曲线为：Y=7.439×10-4X-0.00243。
拟合度为0.99917。
由样品的A值，可得三份溶液的葡萄糖含量分别为：652.5ug，648.5ug，653.9ug。
所以平均含量：651.6ug。
纤维素酶活力单位=651.6/0.01×30=2172 ug/mg×min【思考与讨论】1、在测定时为使各样品和空白管处理一致，应同时加入试剂，同时放入水浴中，同时取出水浴，以使反应得进行程度一致。
2、在测溶液的OD值之前，应将溶液摇匀，摇匀的方法是用保鲜膜蒙住试管口，然后来回震荡试管。
纤维素酶酶活测定可编辑全文
纤维素酶酶活测定纤维素酶活测定方法一、原理纤维素酶能将纤维素降解成纤维二糖和葡萄糖，具有还原性末端的纤维二糖糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应。
反应颜色强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖量又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。
酶活定义纤维素酶活力单位是指55℃、pH5.0的条件下，以每分钟催化羧甲基纤维素钠水解生成1μmol还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位U。
二、实验试剂羧甲基纤维素钠（聚合度1700-2000），内切纤维素酶（苏柯汉）50mmol NaAC-HAC、DNS试剂三、实验仪器容量瓶（1000ml ×2、500 ml×3、100 ml ×4、50ml×4 ml）、移液器、烧杯（500ml×3、50ml×3）、具塞试管、电热套、水浴锅、分光光度计、pH计、电子天平四、标准曲线的绘制五、酶活测定由于苏柯汉给定的pH范围为4.8-5.2，故选用pH 5.0的50mmol NaAC-HAC缓冲液测定纤维素酶酶活。
1、样品的制备CMC-Na溶液的制备：用pH 5.0的50mmol NaAC-HAC缓冲液配置0.5%的CMC-Na （羧甲基纤维素钠）溶液，准确称量CMC-Na0.05g，精确至0.001g，溶于蒸馏水中，45℃水浴锅中搅拌溶解，冷却后定容至100ml。
纤维素酶液的制备：准确称取纤维素酶，精确到0.001g。
用50mmol NaAC-HAC pH5.0的缓冲液配置成适当的浓度10000倍，保证吸光度在0.2-0.6之间。
2、DNS法测酶活：取1.8ml 0.5% CMC-Na的溶液于25ml 具塞刻度试管中，55℃预热10min左右，加入0.2ml 适当稀释的酶液，于55℃水浴锅中保温30min后，然后加2ml DNS，混匀，沸水浴5min，冷却至室温，定容到25ml。
混匀测OD540nm。
DNS法测定纤维素酶活实验方法总结及优化方案
DNS法测定酶活实验方法总结及优化方案
目前纤维素酶没有统一的测定方法,诸多因素影响纤维素酶酶活测定大小的比较。
选择适宜的酶活测定条件，提高测定结果的准确性，可根据有关资料中采用的测定条件，以及通过控制变量法对酶活力测定中的主要影响因素进行研究。
目前实验室采用测酶活方法：
1、葡萄糖标准曲线制作：
530nm比色。
2、酶活测定方法：
考虑到酶液中培养基成分会对吸光值造成一定的影响，所以空白管0还是采用先将酶高温灭活的方法，后面保持实验条件一致，显色时间与标准曲线的显色时间保持一致.
单位酶活的计算:
n：稀释倍数；
K:曲线斜率；
T：反应时间，min；
1000：mg换算成ug.
以下是近期所做的实验结果：
葡萄糖标准曲线
两种产纤维素酶细菌不同测试结果
测定结果
实验结论：从以上几种对酶液的处理方法来看，183的酶活要比R2高，两种菌都是以胞外酶为主。
目前尚没找到有关于加缓冲溶液并且超声破碎的文献，所得测量结果与前面三种方法均不符，这一步需另外探索。
根据《纤维素酶活力测定条件研究》(夏服宝等，《饲料工业》2005年第26卷第16期）和《影响纤维素酶活力测定的几个因素》(刘妙莲等，中国食品发酵
工业研究所)这两篇文献，实验室可先从底物浓度、温度、DNS用量、显色时间以及对菌体的超声破碎时间这几方面进行探索,进而优化实验方法.。
纤维素酶的三种活力测定方法
纤维素酶的三种活力测定方法
纤维素酶是一种重要的酶类，具有分解纤维素的作用。
为了评估纤维素酶的活力，人们研究出了多种测定方法，其中较为常用的有以下三种：
1. 滴定法：将一定量的纤维素酶加入含有纤维素的溶液中，反应一定时间后，使用酸碱滴定法测定反应液的酸碱度变化，从而得出纤维素酶的活力。
2. 电泳法：将一定量的纤维素酶加入蛋白质凝胶中，进行电泳分离，然后在凝胶中添加含纤维素的溶液，观察纤维素的降解情况，从而得出纤维素酶的活力。
3. 显色法：将一定量的纤维素酶加入含有纤维素的溶液中，反应一定时间后，使用显色剂对反应液中的产物进行染色，然后利用分光光度计测定反应液的吸光度变化，从而得出纤维素酶的活力。
这三种测定方法各有优劣，研究者应根据实际需要选择合适的方法进行测定。
- 1 -。
两种常用纤维素酶活力测定方法滤纸酶活-CMC酶活
检测纤维素酶酶活力—滤纸酶活力(F PA)滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
采用3，5一二硝基水杨酸法测定酶活：(简称DNS法)1、原理：纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物，即：3一氨基一5二硝基水杨酸，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，据此可以推算出纤维素酶的活力。
2、采用的滤纸酶活单位定义：滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力。
是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。
代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
在此滤纸酶活单位定义为：以滤纸为底物，在一定反应条件(pH4.8，50℃，恒温lh)下，以水解反应中，1ml纤维素酶液1mi n催化纤维素生成lu g葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。
3、滤纸酶活力(F PA)的测定：①取0．5ml适当稀释的酶液，加入PH值为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液l ml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml；②再加入50±0.5mg滤纸(1cmx6c m)一条，于50℃保温酶解反应1小时，(先预热5分钟)；③加入DNS显色液3ml(标准曲线用量是1.5ml)，放入已沸腾的水中沸水浴l Omin，流水冷却后在540nm下测吸光度；④同时用100℃煮沸lOmi n后失活的酶液做对照，扣除本底；⑤根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。
滤纸酶活按下面公式计算：X=（WxNxlO OO）／（TxM）X:为滤纸酶酶活力，单位U／mL。
纤维素酶活力的测定
目的本检测方法是用来确定本公司纤维素酶类的催化活性。
本方法适用于各种固体和液体纤维素酶制剂。
说明本方法适合于纤维素类酶的质量分析和质量控制领域。
但不是本公司产品及其它公司产品的绝对活力的预测，而各种酶制剂的最终的酶活力在良好的实验操作下仍可发挥出更好的催化活力。
原理纤维素被纤维素酶水解最终降解生成β-葡萄糖。
鉴于纤维素结构的复杂性，没有任何一种酶能将纤维素彻底水解。
1950 年Reese提出了C1-Cx概念。
C1是一水解因子，作用于纤维素的结晶区（如棉花纤维即为高度结晶性纤维），使氢键破裂，呈无定形可溶态，成为长链纤维素分子。
再由Cx最终催化形成还原性单糖。
而Cx通常包括：（1）内切葡萄糖苷酶(endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4，简称EG)。
这类酶随机水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子（羧甲基纤维素钠（CMC）即为人工合成的一种线形纤维素钠盐）截短。
（2）外切葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.91），又称纤维二糖水解酶（cellobiohydrolase，简称CBH）。
这类酶作用于β-1,4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子。
（3）β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.1.21，简称BG），这类酶将纤维二糖（水杨素即为葡萄糖苷键连接的纤维二糖）水解成葡萄糖分子。
据上述理论，分别设计以滤纸（filter paper）、棉球、CMC、水杨素为底物，分别衡量纤维素的总体酶活性（FPA）、C1、Cx、Cb酶活性。
将底物水解后释放还原性糖（以葡萄糖计）与3,5-二硝基水杨酸(DNS)反应产生颜色变化,这种颜色变化与葡萄糖的量成正比关系,即与酶样品中的酶活性成正比。
通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。
纤维素酶类活性的定义Ⅰ 1g酶粉（1ml酶液）于50℃pH4.8条件下，每分钟水解1×6cm的滤纸（FPA）产生1μg还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1个FPA酶活力单位。
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纤维素酶活的测定
一纤维素酶活力单位定义
在37℃、pH值为5.50的条件下，每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。
二测定原理
纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖。
具有还原性末端的寡糖和有还原集团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应，反应颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。
因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中的纤维素酶的活力。
三试剂与溶液
除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。
3.1 葡萄糖溶液，c（C6H12O6）=10.0mg/ml
称取无水葡萄糖1.000g，加水溶解，定容至100ml。
3.2 乙酸溶液，c(CH3COOH)=0.1mol/L
吸取冰乙酸0.60ml，加水溶解，定容至100ml。
3.3 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）=0.1 mol/L
称取三水乙酸钠1.36g，加水溶解，定容至100ml。
3.4 氢氧化钠溶液，c（NaOH）=200g/L
称取氢氧化钠20.0g，加水溶解，定容至100ml。
3.5 乙酸-乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOH-CH3COONa）
称取三水乙酸钠11.57g，加入冰醋酸0.85ml，加水溶解，定容至1000ml，测定溶液的pH值，如果pH偏离5.50，用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调至5.50.
3.6 羧甲基纤维素钠溶液，0.8%（w/v）
称取羧甲基纤维素钠（Sigma C5678）0.40g，加入到盛有30ml3.5缓冲溶液的烧杯中，磁力搅拌，同时缓慢加热，直至羧甲基纤维素钠完全溶解（在搅拌加热过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过50ml），停止搅拌，用3.5缓溶将其定容至50ml，羧甲基纤维素钠溶液能立即使用，使用前适当摇匀。
4℃避光保存，有效期为3天。
3.7 DNS试剂
称取3，5-二硝基水杨酸（化学纯）3.15g，加水500ml，搅拌5min，水浴至45℃，然后逐步加入100ml 氢氧化钠溶液（3.4），同时不断搅拌，知道溶液清澈透明（在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃）.再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g，继续45℃水浴加热，同时补加水300ml，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解，停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000ml，用烧结玻璃过滤器过滤。
取滤液，储存在棕色试剂瓶中，避光保存，室温下可以存放7天后可以使用，有效期为6个月。
四仪器与设备
4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵。
4.2分样筛：口径为0.25mm（60目）。
4.3分析天平：精确至0.001g。
4.4 pH计：精确至0.01.
4.5磁力搅拌器：附加热功能。
4.6振荡器
4.7烧结玻璃过滤器：孔径为0.45nm。
4.8离心机：2000r/min以上。
4.9恒温水浴锅：温度控制范围在30-60℃之间，精度为0.1℃.
五标准曲线的绘制
标准空白样：吸取3.5缓冲液4.0ml，加入DNS试剂5.0ml，震荡后沸水浴加热5min，然后迅速用冷水冷却至室温，用水定容至25.00ml，震荡摇匀。
葡萄糖：分别吸取葡萄糖溶液（3.1）1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00ml，分别用3.5缓溶定容至100ml，配制成浓度为0.10-0.70mg/ml的葡萄糖标准溶液。
分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00ml（分别做2个平行），分别加入到7个试管中，再分别加入2ml蒸馏水和5mlDNS试剂，震荡均匀后沸水浴加热5min，然后迅速用冷水冷却至室温，用水定容至25.00ml，震荡摇匀。
以标准空白样作为对照调零，在540nm处测定吸光值。
以葡萄糖浓度为Y轴，吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线，每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。
六测定步骤
1
2．样品测定
在分光光度计550nm波长处测定样品空白吸光值A0和样品溶液吸光值A1、A2。
3．酶活的计算
U= [（A1+A2)/2- A0]*K+C0× F*1000
30*180.2 m
样品总稀释倍数= 样品预测酶活
0.04～0.08。