第十章 新酶的发现与筛选
新酶获得过程中重要的技术流程
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1. 筛选和分离酶源：从天然或改造来源中筛选出表现出所需酶活性的微生物或细胞系。
酶学研究的最新进展
酶学研究的最新进展酶学是研究酶作用机理、性质以及酶的应用等方面的学科。
酶作为生物催化剂，参与了生命的各个领域，如代谢、信号传导、细胞分化、免疫反应等。
对于酶学的研究，不仅可以加深对生命基本规律的认识，还能为实现农业、医疗、工业等领域的经济增长和社会发展做出重要的贡献。
在现代生命科学的研究中，酶学一直是一个热门话题。
近年来，酶学研究在机制、结构、功能等方面都取得了一些新进展。
一、酶催化机制的新认识催化是酶最基本的功能之一。
酶能够加速化学反应的速率，使之不再受限于传统反应条件，如温度、pH等。
而酶作用机制，一直是酶学家们关注的焦点。
目前，关于酶催化机制的研究主要集中在以下几个方面。
1.催化机构的精细解析酶的催化机构通常包括吸附、取向、诱导、质子传递等多个环节。
目前，酶学家们在利用X射线晶体结构技术等手段，对许多重要酶的催化机构进行了精细解析。
例如，对乳酸脱氢酶、乙醇脱氢酶、GLUT1、P-gp等酶的结构研究，揭示了酶的催化机制，进一步深化了对酶的理解。
2.中间态的探究与研究在催化过程中，酶能够形成不同的中间态，这些中间态反映了催化机制的多个方面，如亚基配位、化学反应、质子转移等。
例如，针对α-淀粉酶、环氧酶、酯酶、乳酸催化剂等酶的研究，发现了不同的中间态，进一步揭示了其催化机制。
3.催化剂的创新发现酶的活性部位就是催化剂。
近来，对酶活性部位的理解得到了重要补充。
例如，发现了吡咯核酸的催化剂作用、金属离子的催化剂作用、催化剂协作的作用等重要发现。
这些新发现，可能在未来的研究中为制备更高效的催化剂提供借鉴。
二、酶结构与功能的研究酶的结构与功能是密不可分的。
如何发现和研究酶的结构与功能，一直是酶学家们努力的方向。
近些年来，关于酶结构与功能的研究进展主要集中在以下几个方面。
1.结构和功能之间的联系酶学家们一直在努力破解结构与功能之间的联系。
近来，研究人员采用多种方法来探究酶的结构和功能之间的关系，例如，利用定量质谱方法、表达遗传学方法等，可以发现结构上构象变化给酶的功能带来了重要影响。
微生物酶筛选的一般流程
微生物酶筛选的一般流程英文回答：Microbial enzyme screening typically involves several steps to identify and select enzymes with desired properties. Here is a general process that is commonly followed:1. Identification of target enzymes: The first step is to determine the specific enzyme activity that is of interest. This could be based on the desired function or the ability to catalyze a specific reaction.For example, let's say we are interested in finding enzymes that can degrade cellulose for biofuel production.2. Source selection: Once the target enzyme is identified, the next step is to select a suitable microbial source that is likely to produce the desired enzyme. Microbes such as bacteria, fungi, and yeast are commonlyused sources.Continuing with our example, we could choose to screen cellulose-degrading enzymes from a variety of fungi known for their ability to break down plant material.3. Isolation and cultivation: The selected microbial source is isolated and cultivated under controlled conditions to optimize enzyme production. This may involve growing the microbe on specific media or in specialized bioreactors.In our case, we would isolate the chosen fungi and cultivate them in a nutrient-rich medium that promotes cellulase production.4. Enzyme extraction: Once sufficient enzyme production is achieved, the next step is to extract the enzymes from the microbial culture. This can be done through various methods such as centrifugation, filtration, or precipitation.For example, we could use centrifugation to separatethe fungal cells from the culture broth, and then collectthe supernatant containing the secreted enzymes.5. Enzyme screening: The extracted enzymes are then screened for the desired activity. This can be done through various assays and tests that measure the enzyme's abilityto catalyze the desired reaction.In our case, we could perform assays to measure the ability of the extracted enzymes to break down celluloseinto glucose.6. Enzyme characterization: Enzymes that show promising activity are further characterized to determine their properties. This may include studying their optimal pH and temperature range, stability, substrate specificity, and kinetic parameters.For example, we could determine the optimum temperature and pH at which the cellulase enzyme functions best, aswell as its ability to degrade different types of cellulose.7. Optimization and engineering: If needed, the selected enzyme can be further optimized or engineered to improve its properties. This can be done through techniques such as protein engineering or directed evolution.In our case, we could use protein engineering to modify the cellulase enzyme to make it more efficient in breaking down cellulose.8. Scale-up and production: Once the desired enzyme is identified and optimized, it can be scaled up for large-scale production. This may involve transferring the enzyme-producing strain to industrial fermentation systems and optimizing the production process.For example, we could transfer the selected fungal strain to a large-scale bioreactor and optimize the fermentation conditions for maximum cellulase production.Overall, the process of microbial enzyme screening involves identifying the target enzyme, selecting asuitable microbial source, isolating and cultivating the microbe, extracting and screening the enzymes,characterizing and optimizing the selected enzyme, andfinally scaling up production.中文回答：微生物酶筛选通常包括几个步骤，以确定和选择具有所需特性的酶。
第十章 新酶的发现与筛选课件
淀粉酶：淀粉（底物）+ 碘液（指示剂） 氨基酰化酶：N-乙酰氨基酸（底物）+溴甲酚紫（指示剂） 溴甲酚紫，pH >6.2显紫色；pH <4.8显黄色
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（2）培养简便、繁殖快、发酵周期短， 能控制培养条件大幅度提高酶的产量。
（3）微生物易变异，可采用各种遗传变 异手段，培育出新的、更理想的菌株。
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二、 微生物新酶的获取途径
获取途径
购买商品化的酶 购买产酶微生物 从自然界筛选产酶微生物 从基因克隆库中筛选酶基因
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富集培养方法
（4）稀释培养法
长期生长在营养贫乏的环境中的微生物对过高 浓度的有机质敏感，生长受到抑制，可用稀释后 的培养基进行富集培养。
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四、 从自然界筛选产酶微生物
3、菌株分离纯化
富集培养获得具有生长优势的菌株，但其他菌 株依然存在，需要用合适的方法加以分离
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富集培养方法
（3）抑制不需要的菌类
通过高温、高压或加入抗生素等抑制剂减少非
目的微生物的数量
高温处理（80℃）筛选芽孢菌 抑制细菌：加入青霉素（G+）、链霉素（G-）、四环素、金霉素、
孟加拉红等
抑制放线菌：青霉素、卡那霉素，安普霉素，壮观霉素等 抑制真菌：纳他霉素、井冈霉素或者制霉菌素，或者两性霉素等
国内外主要菌种保藏机构：ATCC、DSMZ 、 CCTCC、CICC、CGMCC
特点： 方便易得，成本较低（600-800元/株） 需要进一步筛选
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第十章新农药研究与开发完整版PPT资料
类推合成
即对已经开发的活性先导化合物进行衍生合成，开 发新的农药品种或发现新的二次先导化合物，合成 “模仿分子”（me-toomolecules）。
磺酰脲类除草剂 三唑类杀菌剂 有机磷类杀虫剂 拟除虫菊酯类杀虫剂
③天然产物模型
• 即从天然存在的化学品中获得具有生物活性的先导 化合物。
• 沙蚕毒素：杀螟丹、杀虫双、杀虫丹、杀虫磺、杀 虫环等。
• 拟除虫菊酯类 • 毒扁豆碱：氨基甲酸酯类 • 嘧菌酯 • 溴虫腈
④生物合理设计
• 以靶标生物体生命过程中某个关键的生理生化作用机制作为 研究模型，设计合成干扰作用机制的化合物，从中筛选先导 化合物，进行结构优化开发.
• 以杀虫剂为例： • 第一步：研究目标昆虫的某一生化途径； • 第二步：研究如何干扰上述的那个环节，即研究干扰的机制； • 第三步：根据研究清楚的靶标，人为地设计这种酶的抑制剂，
广告内容应与农药登记证和农药登记公告相符；
⑻中试技术及中间评价。
⑼基础设计与最终评价。
二、生物筛选与作用机理
• 1、生物筛选的意义 • 2、筛选生物材料 • 3、筛选方法 • 4、作用方式和作用机理研究
1、生物筛选的意义
• （1）生物筛选biological screening概念：
• 采取一定的可重复的方法和步骤，用一定剂量的候选化合物 处理供试生物材料，根据供试生物材料的反应并经过特定的 统计分析后，选出有效化合物供进一步商品化开发，或作为 先导化合物进一步研究。
（1）了解主要作用方式的意义： 选用正确的生物筛选方法
包亚括急9性0毒d的⑶性经试主口验实对要验动；物设的染备毒时材间一质般选为14择~2和8d。设备选型。 急21性d或经2口8⑷毒d吸性入较LD试5长验0试；周验：期急性稳经皮定毒性和LD连50试续验；运转。
高中生物必备知识点：新陈代谢与酶
▁▂▃▄▅▆▇█▉▊▋▌精诚凝聚 =^_^= 成就梦想▁▂▃▄▅▆▇█▉▊▋▌新陈代谢与酶知识点新陈代谢与酶名词：1、酶：是活细胞(来源)所产生的具有催化作用(功能)的一类有机物。
大多数酶的化学本质是蛋白质（合成酶的场所主要是核糖体，水解酶的酶是蛋白酶），也有的是RNA。
2、酶促反应：酶所催化的反应。
3、底物：酶催化作用中的反应物叫做底物。
语句：1、酶的发现：①、1783年，意大利科学家斯巴兰让尼用实验证明：胃具有化学性消化的作用；②、1836年，德国科学家施旺从胃液中提取了胃蛋白酶；③、1926年，美国科学家萨姆纳通过化学实验证明脲酶是一种蛋白质；④20世纪80年代，美国科学家切赫和奥特曼发现少数RNA也具有生物催化作用。
2、酶的特点：在一定条件下，能使生物体内复杂的化学反应迅速地进行，而反应前后酶的性质和质量并不发生变化。
3、酶的特性：①高效性：催化效率比无机催化剂高许多。
②专一性：每种酶只能催化一种或一类化合物的化学反应。
③酶需要适宜的温度和pH值等条件：在最适宜的温度和pH下，酶的活性最高。
温度和pH偏高和偏低，酶的活性都会明显降低。
原因是过酸、过碱和高温，都能使酶分子结构遭到破坏而失去活性。
4、酶是活细胞产生的，在细胞内外都起作用，如消化酶就是在细胞外消化道内起作用的；酶对生物体内的化学反应起催化作用与调节人体新陈代谢的激素不同；虽然酶的催化效率很高，但它并不被消耗；酶大多数是蛋白质，它的合成受到遗传物质的控制，所以酶的决定因素是核酸。
5、既要除去细胞壁的同时不损伤细胞内部结构，正确的思路是：细胞壁的主要成分是纤维素、酶具有专一性，去除细胞壁选用纤维素酶使其分解。
血液凝固是一系列酶促反应过程，温度、酸碱度都能影响酶的催化效率，对于动物体内酶催化的最适温度是动物的体温，动物的体温大都在35℃左右。
6、通常酶的化学本质是蛋白质，主要在适宜条件下才有活性。
胃蛋白酶是在胃中对蛋白质的水解起催化作用的。
酶的定向进化方法
酶的定向进化方法一、随机突变与筛选/选择随机突变和筛选/选择是传统的酶优化方法之一、通过实验手段引入突变体库，其中每个突变体都带有一个或多个氨基酸的突变，从而改变了酶的催化性能和特性。
然后通过筛选/选择酶的突变体库，选出具有更好性能的突变体。
随机突变是通过不同的方法引入突变体库，如辐射突变、化学突变和PCR突变等。
这些突变能导致氨基酸序列上的单个或多个碱基的突变，进而改变酶的蛋白质结构和功能。
筛选/选择是通过其中一种策略或实验步骤，将突变体库中具有更好性能的突变体选出。
这种方法可以通过酶活性检测、底物特异性筛选、抗体亲和性或酶稳定性等筛选/选择技术来实现。
二、衍生物的进化衍生物的进化是一种利用酶的天然亲和力进行定向进化的方法。
酶可以选择结合和催化一些化合物，例如酶底物或抑制剂。
利用这些底物或抑制剂的结构特征，可以设计出一系列的衍生物。
这些衍生物能与酶结合和催化，但其结合或催化性能可能比天然的底物或抑制剂更好。
通过衍生物进化，可以得到具有更高催化活性、更高底物特异性、更好稳定性或更高抑制剂亲和性的酶。
为了实现衍生物进化，需要结合合理的设计和筛选技术，如重组DNA技术、高通量筛选技术和计算模拟等。
三、DNA重组技术DNA重组技术是酶定向进化的重要手段之一，通过改变酶的基因序列，可以产生新的突变体库。
DNA重组技术通常包括酶的突变、重组和筛选等步骤。
酶的突变可以通过随机突变、有限突变或定向突变等方法实现。
随机突变通过PCR反应引入突变体库；有限突变通过合成含有特定突变位点的寡核苷酸引入突变体库；定向突变利用镊刀酶等限制修饰酶切剪酶切剪、回收酶片段并用酶反应体外合成而成的、含有特定突变位点的DNA片段。
酶的重组是将不同的突变体的DNA片段进行拼接，形成新的DNA片段，从而得到含有多个突变位点的突变体。
可以通过拼接PCR、敏感蛋白酶切剪、局部重组/突变或基因片段替换等方法进行酶的重组。
酶的筛选是通过一系列实验和检测步骤，对突变体库进行筛选，选出具有更好性能和特性的酶。
(第九章)第十章体细胞无性系变异及突变体筛选详解
第一节 体细胞无性系变异
六、体细胞无性系变异的特点
3、能基本保持原品种特性 因为体细胞无性系变异大部为单一性状变异，做 能基本保持原品种的特性。 4、潜在隐性性状活化 在体细胞无性系后代中，常见一些原供体植株所 没有的隐性性状变异，象雄性不育性、矮杆、叶绿 体突变等，有些隐性特性对育种实践具有重大利用 价值。 由于体细胞无性系变异具有上述4个特点，因此， 在育种上的应用日益受到重视。
第一节 体细胞无性系变异
三、体细胞无性变异的表现及类型
2、育性上的变异 变异表现为全不育或半不育，如水稻、番茄等。 3、生长势上的变异 （1）抽穗期：早于或迟于原供体植株，如水稻， 玉米。 （2）花期：早于或迟于原供体植株 （3）成熟期：早于或迟于原供体植株 （4）杂种优势：生长势强于原供体植株，如玉米。
第一节 体细胞无性系变异
七、影响体细胞无性系变异的因素
影响体细胞无性系变异频率的因素很多，主 要有： 1、植物的繁殖类型： 2、外植体的来源部位： 3、植物再生的方式： 4、继代培养次数和培养时间： 5、生长调节剂浓度的影响：
第一节 体细胞无性系变异
七、影响体细胞无性系变异的因素
第一节 体细胞无性系变异
三、体细胞无性变异的表现及类型
1、植株外部形态的变异
（1）株高：高于或矮于原供体植株，如水稻、小麦，烟草等； （2）叶形：1）大于或小于原供体植株； 2）形状不同于原供体植株，如烟草； （3）叶色：1）有叶片条纹，如燕麦； 2）叶片缺绿（白化苗），如玉米 （4）茎色：茎有条纹，如甘蔗，茎有黄色条纹（呈黄绿相间）， 像一种竹（斑竹）。 （5）穗型：1）大于或小于原供体植株； 2）密于或疏于原供体植株。 （6）粒型：1）大于或小于原供体植株； 2）大于或短于原供体植株。 （7）粒色：不同于原供体植株。 （8）芒性：1）芒有无；2）芒长短。
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微生物作为酶源的优点
（ 2 ）培养简便、繁殖快、发酵周期短， 能控制培养条件大幅度提高酶的产量。 （ 3 ）微生物易变异，可采用各种遗传变 异手段，培育出新的、更理想的菌株。
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第10章 新酶的发现与筛选
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二、 微生物新酶的获取途径
购买商品化的酶
购买产酶微生物
获取途径 从自然界筛选产酶微生物
第10章 新酶的发现与筛选
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示例1 基因组序列搜索
查找基因组序列：Kluyveromyces lactis 搜索基因组序列中的还原酶 reductase
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第10章 新酶的发现与筛选
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2、 基因挖掘法
基因组狩猎原理
以已知酶为探针，与整个数据库的酶进行比 对，获得中等相似度（ 50%~70% ）的酶进行克 隆表达，通过功能筛选并获得所需要的酶。
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第10章 新酶的发现与筛选
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示例2 数据库比对寻找相似酶序列
酶探针的氨基酸序列
NADPH-dependent alpha-keto amide reductase [Kluyveromyces marxianus]
GenBank: BAP73216.1
1 61 121 181 241 301 MTNQKFFTLS AETYKTYPEL IHSPFFDKDL FSPFLQNQTP QVLLLWVYKR YTKYNSEAQK NGNKIPAVAV GAALKETKKP NIDLETAWKQ GIVEFSQKND GILPVTTSAK VGTGTKWYKA REEIFITDKF LEELYKSGKA ILLEAYSPLG IERIKQAQDI EETDATFSQE SSLHKISEDP KNIGVSNFTV PLQKKPADAD FSFDLTEEEV LTDIVKLSLD KSALETALKK EDLKKVLAIA QQPFYQYLKE KKITDLGLQH TVPGIVHIDA LGVDYVDLYL EIKPQVNQIE LSEKYNKTEA EPVRLYWVDF
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第10章 新酶的发现与筛选
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3、高通量筛选法
基于荧光发生的高通量筛选
采用荧光底物，经酶水解后释放荧光基团，用
高通量荧光计测定
伞形酮（无色）
伞形酮阴离子（蓝色荧光）
伞形酮筛选水解酶，如脂肪酶 ，磷酸酶 ，糖苷酶等
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第10章 新酶的发现与筛选
（1）种类繁多、分布广
微生物“无孔不入，随遇而安” 微生物具有多样性
① 物种多样性：据估计总类别在50万至600万之间 ② 生理代谢类型多样性：有机物和有毒物质分解、转化
③ 遗传基因多样性：已完成测序细菌1214种、古细菌93种、
真菌17种（2010年数据）
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第10章 新酶的发现与筛选
美国国立生物技术信息中心 网址：https:///
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第10章 新酶的发现与筛选
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1、 基因组狩猎法
基因组狩猎原理
对某一已经测序的微生物进行全基因组搜索
和分析，从而获得候选酶基因。
主要包括以下步骤： ① 分析全基因组序列，获得还原酶基因序列； ② 克隆所有基因并表达， 构建酶表达库；
淀粉酶：淀粉（底物）+ 碘液（指示剂） 氨基酰化酶：N-乙酰氨基酸（底物）+溴甲酚紫（指示剂） 溴甲酚紫，pH >6.2显紫色；pH <4.8显黄色
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第10章 新酶的发现与筛选
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1、平板筛选法
（2）透明圈法
在固体培养基中掺入溶解性差、可被特定菌 利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养 基背景，在产特定酶菌种菌落周围会形成透 明圈。
菌株依然存在，需要用合适的方法加以分离 分离纯化方法：稀释涂布或划线分离
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第10章 新酶的发现与筛选
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四、 从自然界筛选产酶微生物
4、初筛
平板筛选法 薄层层析法 高通量筛选法
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第10章 新酶的发现与筛选源自231、平板筛选法
（1）变色圈法
将指示剂掺入固体培养基中进行待选菌悬液 的单菌落培养，或将指示剂喷洒在平板单菌 落表面，指示剂与底物或产物反应，在菌落 周围形成变色圈。
从基因克隆库中筛选酶基因
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第10章 新酶的发现与筛选
5
1、 购买商品化的酶
向酶制剂供应商购买商品化的酶
世界主要酶制剂供应商：Sigma、Novo Nordisk、 ThermoGen、Roche Molecular Biochemicals 等
特点：
方便易得，可大量供应 种类少、成本高、知识产权问题
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3、高通量筛选法
基于荧光发生的高通量筛选
不发荧光的试卤灵前体物质经过催化后 , 生成
了发荧光的试卤灵
3-苯基丁酸试卤灵
试卤灵（荧光）
试卤灵筛选酯酶
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第10章 新酶的发现与筛选
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四、 从自然界筛选产酶微生物
5、复筛
精确测定菌株产酶能力和催化活力，确认符 合生产要求的菌株。方法：HPLC、GC等
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第10章 新酶的发现与筛选
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2、 购买产酶微生物
从菌种保藏库购买酶来源微生物
国内外主要菌种保藏机构： ATCC 、 DSMZ 、 CCTCC、CICC、CGMCC
特点：
方便易得，成本较低（600-800元/株） 需要进一步筛选
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第10章 新酶的发现与筛选
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基于颜色变化的高通量筛选
反应生成有颜色的产物或有色的底物经反应后生成无色 的产物，或底物/产物与其他物质反应生成有色络合物
2,4-二硝基苯肼筛选还原酶
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第10章 新酶的发现与筛选
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3、高通量筛选法
基于颜色变化的高通量筛选
对硝基苯酚醚 （无色）
酚盐（黄色）
对硝基苯酚醚筛选水解酶
3、筛选方法
（2）高通量筛选法
方法：多孔板培养微生物，并用酶标仪进行 光谱分析。 原理：反应产物具有吸收峰值，发光或产生 荧光。
第10章 新酶的发现与筛选
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四、 从自然界筛选产酶微生物
筛选流程
调查研究 查阅资料 采样 富集培养 分离纯化
性能鉴定
生产性能、毒性、菌种鉴定
扎紧，标明时间、地点、天气和周围环境等
信息。
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第10章 新酶的发现与筛选
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四、 从自然界筛选产酶微生物
2、富集培养
目的：使目的菌株大量繁殖，成为优势菌株 原理：根据微生物的特点，“投其所好”或 “取其所抗”，在培养基中投放或添加特殊
养分或抗菌物质，使天然环境中劣势菌转变
为人工环境中的优势菌。
淀粉→淀粉酶 酪素→蛋白酶 纤维素粉→纤维素酶
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几丁质→几丁质酶 吐温→脂肪酶 α-葡聚糖酶→1,3- α-葡聚糖
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第10章 新酶的发现与筛选
2、薄层层析法（TLC）
薄层层析
混合样品由于样本被点在薄片后，展开剂会 因为毛细现象而向上移动。不同的分析物因为极 性差异会以不同的速度向 TLC片上端爬升，因而 达到分离目的。
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第10章 新酶的发现与筛选
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生物化学 第6章 生物氧化
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高通量筛选采用的设备
96孔板
384孔板
1536孔板
深孔培养板
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多通道移液器
第10章 新酶的发现与筛选
酶标仪
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高通量筛选采用的设备
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第10章 新酶的发现与筛选
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3、高通量筛选法
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第10章 新酶的发现与筛选
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富集培养方法
（1）控制培养基的营养成分
在培养基中加入一定量底物，筛选生长优势菌株
加入底物作为唯一碳源或氮源
逐步提高底物添加浓度，连续富集培养 用不同的培养基筛选不同类型的微生物
细菌：牛肉膏蛋白胨培养基 放线菌：高氏一号培养基 霉菌：察氏培养基 酵母：豆芽汁培养基
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第10章 新酶的发现与筛选
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3、高通量筛选法
高通量筛选法的概念
以分子水平或细胞水平的实验方法为基础， 以多孔板形式为实验工具载体，以自动化操作系 统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实 验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理， 同一时间对成百上千的样品进行检测分析。
特点：准确 、微量 、灵敏 、快速和廉价
3、 从自然界筛选产酶微生物
从土壤、水体中筛选产酶微生物
广泛采用，盲目，工作量大
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第10章 新酶的发现与筛选
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3、 从自然界筛选产酶微生物
从基因克隆库筛选
克隆库构建方法：
基因组狩猎
基因挖掘
宏基因组筛选
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第10章 新酶的发现与筛选
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三、 新酶筛选的策略
第10章 新酶的发现与筛选
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三、 新酶筛选的策略
3、筛选方法
（1）分级筛选法
初筛：迅速定性或粗略定量鉴别，除去大多
数不符合要求的菌种或酶。平板筛选法、多
孔板法等
复筛：精确测定酶活，筛选出需要的酶或产 酶微生物。常采用HPLC或GC
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