抗体重排rearrangement
抗体
mIgM
mIgD
未成熟B细胞
成熟B细胞
活化或记忆B细胞
5）IgE；含量少/寿命断/热敏感/亲细胞/进化 最晚/含量最低/与超敏反应/寄生虫免疫有关
五、抗体的编码基因
抗体的胚系基因（germline genes）
重链：V基因片段（variable segment）
D基因片段（diversity segment） J基因片段（joining segment）
1、基本结构 2、辅助结构 3、结构域(Domain)
1、基本结构
1）四肽链通过链间二硫键组成H2L2
重链：450aa, Mr.5X104,五类(a、g、m、d、e) 轻链：214aa, Mr.2.5X104 ,两型(k、l) 2）分三个功能区： 可变区(Variable region, VH/VL, Fv)：结合抗原 恒定区(Constant region, CH/CL)：次级反应、抗原性 绞链区(Hinge region)CH1-CH2间, 30aa,2-5链间二硫键
3）蛋白酶可酶解
木瓜蛋白酶(papain)：Fab、 Fc
胃蛋白酶(pepsin)：
F(ab’)2 →2XFab’、pFc’
2、辅助结构
1）J链(Joining chain)：
20KD、10%糖、Cys、二硫键连接IgH
2）分泌片(Secretory piece,SP)：
70KD、6％糖、上皮细胞合成
抗体的特异性和类型的不同，称为异质性 (heterogeneity ）
不同抗原表位刺激机体所产生的免疫球蛋白分子重链类别和轻链型别不 同
不同抗原表位刺激机体所产生的免疫球蛋白分子识别抗原的特异性不同
不同抗原表位诱导的同一类型的免疫球蛋白（IgG），其识别抗原的特 异性不同
免疫课本名词解释
自然免疫：先天性免疫或固有性免疫，是个体出生是就具有的天然免疫，可通过遗传获得，是机体在长期进化过程中逐渐建立起来的主要针对入侵病原体的天然防御功能。
获得免疫：适应性免疫，是个体出生后，接触到生活环境中的多种异物抗原，并在不断刺激中逐渐建立起来的后天免疫，也称获得性免疫。
体液免疫：是指由B细胞介导的免疫应答。
B细胞在抗原刺激下分化增殖为浆细胞，合成分泌抗体，形成特异性体液免疫应答。
具有中和毒素、激活补体、调理吞噬等作用。
细胞免疫：是指由T细胞介导的免疫应答。
Td抗原刺激T细胞，T 细胞增殖分化为致敏T 细胞，通过Tc细胞的细胞毒作用以及Th1细胞释放淋巴因子的作用，从而表现出抗细胞内寄生的微生物、抗肿瘤、抗寄生虫和迟发型变态反应。
克隆选择：克隆选择学说，或称无性繁殖系选择学说，克隆选择学说的核心论点是:①带有各种受体的免疫活性细胞克隆早已存在,抗原的作用只是选择并激活相应的克隆；②细胞受体和该细胞后代所分泌的产物（抗体）具有相同的特异性。
抗原：抗原是一类能够诱导机体免疫应答并能与相应抗体或T细胞受体发生特异反应的物质。
半抗原与载体：能与相应的抗体结合而具有免疫反应性，但不能诱导免疫应答的物质。
载体：赋予半抗原以免疫原性的蛋白质。
半抗原+ 蛋白质→完全抗原三．抗原表位：抗原决定簇，又称表位，是抗原物质中能与其相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的结构(免疫应答的特异性基础)。
超抗原：一类可直接结合抗原受体，激活大量（2%—20%）T细胞或B细胞克隆，并诱导强烈免疫应答的物质，主要包括细菌和病毒的成分及其产物等。
五．抗原组学：是建立在基因组学和蛋白组学基础上的新兴领域，它正在成长为继基因组学和蛋白组学后的学科重点。
抗原组学：抗原组学是建立在基因组学和蛋白质组学基础上的新兴领域。
利用抗原组学可以鉴定疫苗的候选抗原。
Ig：即免疫球蛋白，指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。
Fab：免疫球蛋白（Ig）的抗原结合片断(Fab)。
霍夫曼重排（HofmannRearrangement）
霍夫曼重排（HofmannRearrangement）概要
是指⼀级酰胺在卤素(溴活氯)和碱的作⽤下产⽣异氰酸酯后重排转变为少⼀个碳原⼦的伯胺的反应。
该反应的⼩缺点是必须使⽤强碱。
四⼄酸铅或者⾼价碘试剂作为改良条件经常被应⽤于该反应。
⽽且后者的话可以根据加⼊的醇不同⽣成各种酰基保护产物。
反应机理
反应实例
(-)-Epibatidine的合成[1] ：重排位点的⽴体构型保持不变。
达菲的合成[2] ：
实验步骤
改良型Hofmann重排[3]
在装有Dimroth冷凝器与搅拌⼦的1L圆底烧瓶中加⼊p-甲氧基苯甲酰胺(10g, 66mmol), NBS (11.9g, 66mmol)、DBU (22mL, 150mmol)、甲醇(300mL)。
回流加热15分钟，再缓慢加⼊NBS (11.9g, 66mmol)后，持续加热30分钟。
旋转蒸发除去甲醇，残渣⽤500ml的⼄酸⼄酯稀释。
有机层⽤分别⽤6N盐酸(2×100mL)、1N氢氧化钠(2×100mL)、饱和⾷盐⽔萃取后，⽆⽔硫酸镁⼲燥。
抽滤除去硫酸镁、溶剂⽤旋转蒸发除去、上柱⼦(硅胶50g, ⼄酸⼄酯/正⼰烷(1/1))分离纯化得到淡黄⾊固体。
最后⽤正⼰烷重结晶得到纯品(8.8g, 73%)。
第二章 免疫分子 1 2 Ig和补体系统
第五章 免疫分子第一节 免疫球蛋白( Immunoglobulin, Ig )免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)包括成熟B 细胞的膜表面Ig(SmIg)和某个B 细胞克隆受抗原刺激、激活、分化、转化为浆细胞后分泌的Ig 。
由于Ig 具有与相应抗原发生特异结合的功能，故称为抗体(antibody,Ab)。
在人体内约有1×１07个B 细胞克隆，各个B 细胞克隆的SmIg 分子的VL 、VH 结构都不一样，能识别差异极其微小的各种抗原决定簇，产生相应的Ig 分子。
分泌于血清中的Ig 分子结构极不均一，与抗原结合的特异性千差万别，Ig 自身表现的抗原性(血清型)也多种多样。
关于Ig 产生的遗传控制及多样性的起源，遗传学家们一直在进行研究，并存在分歧，提出的学说主要有胚系学说、体细胞突变学说和基因重排学说。
随着分子生物学技术的发展，基因重排学说不断被实验证实和完善，受到普遍赞同。
一、免疫球蛋白分子的基本结构Ig 分子的基本结构为，两条相同的轻链(light chain, L 链)在两条相同的重链(heavy chain, H 链)外侧，L 链和H 链之间，H 链与H 链之间，由二硫键连接成一个“Y ”字型。
每条L 链由210～230氨基酸组成，分子量约23ku ，每条H 链由420～446个氨基酸组成，分子量50～70ku 。
所有Ig 的L 链和H 链从氨基端起的100多个氨基酸的组成和顺序多变，称为可变区(variable region, V 区)，L 链的V 区(VL)由108个氨基酸组成，H 链的V 区(VH)由107～130个氨基酸组成，VL 和VH 共同组成与相应抗原决定簇结合的部位。
在VL 和VH 中氨基酸组成的变化仅集中3个区域(占氨基酸总量的15%~20%),称为超变区(hypervariable region, HV)。
超变区是Ig 与抗原结定簇结合的互补决定区(complementarity-determining region,CDR)。
第3章 免疫球蛋白
三、免疫球蛋白的水解片断
1、水解作用
Ig 木瓜蛋白酶 2Fab＋Fc Ig 胃蛋白酶 F(ab´)2+pFc´
2、 水解意义
阐明Ig的结构和生物活性， 指导生物制品的生产和临床应用
第二节 五类免疫球蛋白 的特点和功能
一、Ig分类 1、类：根据同种系所有个体的Ig重链C区的抗原性 分为五类 IgM()、IgG()、IgA()、IgD()、IgE() 2、亚类：同一类Ig内的aa序列及二硫键的数目和位 置 IgG—IgG1、IgG2、IgG3和IgG4 ； IgA—IgA1和IgA2； IgM—IgM1和IgM2。 3、型：根据Ig轻链C区的抗原性分为链和链。 ：约2：1. 4、亚型： 链有多种亚型。（轻链抗原决定簇在CL区， 分κ 和λ 。1个Ig分子轻链只有一个型，不是κ 型就 是λ 型。）
10,530
320 X 10,530 = 3,369,600
The potential diversity generated by V(D)J recombination is virtually infinite. >Total lymphocytes in a human ~1012 >Genome size ~3X109 bp
四、选择性传递
（主要借助胎盘滋养层细胞表面的FcR进行的。 ）
五、具有免疫原性
1、同种型（isotype）
2、同种异型（allotype）
3、独特型（idiotype）
将Ig作为抗原在异种、同种异体或自身体 内进行免疫，均能诱导机体发生免疫应答， 产生相应的抗体，这些抗体可用血清学方 法进行检测，因此称为Ig的血清型
（二）重链类型转换 （成熟B细胞，抗原刺激后） 即class switch，又称S-S转换。
第二军医大学免疫教程二：基因工程Ig
免疫球蛋白CDR和FR结构示意图
(二)Ig的水解片段
1.木瓜酶水解Ig 2个相同的抗原结合片段 (fragment of antigen-binding, Fab) 1个可结晶片段 (fragment crystallizable, Fc) 2.胃蛋白酶水解Ig 1个F(ab’)2 和1个pFc’
实验研究。
(二)杂交-杂交瘤方法
(hybrid-hybridoma) 四源杂交瘤(quadroma)： 使两株各自分泌不同特异性单抗的 杂交瘤细胞再融合 三源杂交瘤(trioma)： 用一株杂交瘤细胞与 免疫后的脾细胞融合
杂交-杂交瘤方法的主要缺点：
①由于两套重链和轻链之间可重新随机组合，而目 的BsAb仅占20％左右，所以必须从大量相似的 Ig中费时费力地筛选出目的BsAb；
3.二聚化结构域融合法
4.构建双特异性双链抗体 (bispecific diabody) 将抗体A的VH和抗体B的VL用一短的接头连 接成一条杂合ScFv，同理将抗体A的VL和 抗体B的VH连接成另一条杂 合ScFv，构建含有这两条链 的双顺反子表达载体，当两 A A 者同时表达时，由于短接头 B 的限制，使两个不同特异性 B 抗体的轻链可变区和重链可 变区交叉组合。
单区抗体的优越性：
①穿透力强，有利于实际应用；
②不需将VH和VL基因分别克隆和进行正确 配对，制备时操作简便；
③只有VH而不需与VL相互作用，稳定性较 Fv和ScFv更好； ④其抗原结合部位的构象较为特殊，VH抗 体CDR襻插入抗原表面的凹陷中，这对 于制备酶抑制性抗体有重要意义。
MRU的优越性：
(一)Fab
Fab
由重链Fd段和完整的轻链通过一个链间二硫 键连接形成的异二聚体，只有一个抗原结合部位。
免疫球蛋白
七、免疫球蛋白基因
七、免疫球蛋白基因：基因重排
重组信号序列 (recombination signal sequence， RSS)是由寡核苷酸组成的七聚体(heptamer) [5‘CACAGTG3’]、九聚体(nonamer) [5‘ACAAAAACC3’]，以及两者之间较少保守 性的间隔序列(spacer)所组成。
Susumu Tonegawa（利川根进）
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1987
"for his discovery of the genetic principle for generation of antibody diversity"
高）、唾液、泪液中 ＊ 功能: 对机体的局部粘膜(如呼吸道、消化道粘膜)的抗
感染免疫有重要作用。 ＊ 新生儿通过母乳喂养，可获得被动免疫。
IgD
＊单体结构；
＊血清含量低，占Ig总量的0.2％；半衰期极短，仅3天 （铰链区长）
＊ B细胞表面的IgD（SmIgD）是成熟B细胞的重要表面标 志：未成熟B细胞仅表达mIgM，成熟B细胞（初始型） 表达mIgM和mIgD，活化或记忆性B细胞mIgD逐渐消失。
二、免疫球蛋白的功能区
结构域：Ig的多肽链分子中约110个氨基酸可 折叠成由链内二硫键连接的具有特定功能的球 形结构。称为免疫球蛋白的功能区或结构域 （domain）.
＊ VL和VH: 抗原结合部位 ＊ CL和CH1:同种异型的遗传标记所在处 ＊ CH2和CH3：
① IgG的CH2和IgM的CH3: 补体C1q结合点； ② 母体的IgG借助CH2通过胎盘进入胎儿体内 ＊ CH3、CH4: 与细胞Fc受体结合的部位 IgG的CH3可结合细胞表面的FcR，IgE的CH2和CH3 可与肥大细胞和嗜碱性粒细胞的IgE Fc受体结合。
基因重排名词解释
基因重排名词解释
基因重排（Gene Rearrangement）是指在某些生物体的基因组中，由于基因片段的移动、插入、删除或倒位等现象，导致基因在DNA分子上的排列顺序发生改变。
基因重排是基因组进化中的一个重要机制，可以增加基因组的多样性和复杂度，同时也可能对生物体的适应性和健康产生影响。
下面是一些与基因重排相关的名词解释：
1. 基因片段（Gene Segment）：指编码蛋白质的DNA序列中的一段区域，通常具有特定的功能和序列特征。
2. 重组酶（Recombinase）：一类催化基因重排的酶，能够切割DNA链并促使基因片段的互相重组。
3. V(D)J重排（V(D)J Rearrangement）：在脊椎动物免疫系统中，负责生成抗体和T细胞受体的基因由不同的V、D和J基因片段
组成，通过V(D)J重排来产生不同的抗原识别结构，以应对不同的病原体。
4. 染色体易位（Chromosome Translocation）：指两个染色体之间的基因重排，通常发生在染色体的两端或中间，可能影响基因的表达和功能。
5. 基因分化（Gene Divergence）：由于基因重排等机制，在不
同物种或个体之间，基因片段序列和组合会发生变化，导致基因的结构和功能差异增加，称为基因分化。
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人免疫球蛋白胚系基因图
l轻链基因位于22号染色体上，k轻链基因位于2号染色体上， 重链基因位于14号染色体上。
V区基因和C区基因。V、D、J基因片段。 信号肽L(leader)将各条肽链导入内质网腔后被切去。
小结： • 抗体或BCR的多样性是由它们的可变区决定的 • 引起抗体多样性的基因重排假说和体细胞突变假说 • 基因重排假说的证实 • J和D基因片段的发现 • 胚系免疫球蛋白的基因结构
淋巴细胞抗原识别受体的编码基因 及
受体多样性的产生
淋巴细胞抗原识别特点：
1. TB细胞都用其抗原识别受体识别抗原
B细胞：B cell receptor (BCR) T细胞：T cell receptor (TCR)
2. 一种淋巴细胞仅表达一种抗原受体
究竟什么样的病原微生物能够突破机体 的天然免疫屏障并不能预料。为了能够防御 所有可能的病原微生物的感染，特异性免疫 应答系统必须能够识别所有可能的外来抗原 物质，因此BCR和TCR必须形成一个巨大的抗 原受体库。
人可以表达的抗原受体约为1012个， 人的基因总数仅为3－5万个。
问题： 为什么人产生的抗体比他自身携带
的总的基因数还要多？
内容： 一、BCR重排的发现及BCR胚系基因结构 二、产生BCR多样性的机制 三、BCR基因表达的一些特点 四、TCR的基因结构和多样性的产生
一、 BCR重排的发现及其胚系基因结构
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1987 “For his discovery of the genetic principle for generation of antibody diversity"
Massachusetts Institute of Technology (MIT) Cambridge, MA, USA
二、产生BCR多样性的机制
(1) 多样性机制之一：基因片段的重排
每条编码轻链和重链可 变区的基因都由数个基 因片段组成。
k链：40（Vk）x 5（Jk）= 200个Vk l链：30（Vl）x 4（Jl）= 120个Vl 重链：65（VH）x 27（DH）x 6（JH）= 11000个VH
基因片段重排方式：
（3）多样性机制之三：基因片段结合处的变化
仅仅通过基因重排和随机组合，理论上只能产生 3.5x106个不同抗原特异性的抗体，实际上抗体的数目 要远远多于这个数字。
抗体多样性主要由CDR体现，其中CDR3在三个高变区 中的变化最大。CDR1和CDR2由V区基因编码，CDR3在轻 链中是由V基因片段和J基因片段的连接处编码的，在重 链中是由D基因编码的。
重排和高突变的发育控制
重排：抗体基因片段在 与抗原无关的情况下装 配起来，这样的抗体对 抗原具有低亲和力。
体细胞突变：一旦抗原 被找到了，对该抗原具 有低亲和力的B细胞就 会发生体细胞突变，形 成高亲和力的B细胞。
问题： 为什么免疫系统要用两种机制改变
为什么CDR3高变区变化最大呢？
对重排后的基因和胚系基因的核苷酸序列进行测定， 发现V（D）J不是准确地连在一起的，在连接时增加和减 少数个核苷酸，连接多样性(junction diversity)。
核苷酸在连接处的增加或者减少常常导致DNA的读框 受到破坏，产生没有功能的抗体。
（4）多样性机制之四： 体细胞高突变（Somatic Hypermutation, SHM)
（2) 多样性机制之二：重链轻链随机组合
k链：40（Vk）x 5（Jk）= 200个Vk l链：30（Vl）x 4（Jl）= 120个Vl 重链：65（VH）x 27（DH）x 6（JH）= 11000个VH
理 论 上 将 产 生 11000x(200 ＋ 120)=3.5x106 个 不 同 抗原特异性的抗体，实际上要少一些。因为并不是 所有的V基因都以同样频率使用，并不是所有的轻链 重链配对都能成功。
BCR或抗体由可变区和恒定区组成，其多样性是 由可变区决定的。
可变区多样性是怎样产生的?
抗体多样性的两种假说：
体细胞突变假说
B细胞发育过程中发生了突变，导致生成的BCR或者抗 体变成许多种
基因片段重排假说 ？
Dreyer和Bennett于1965年提出，即两个基因一条多 肽链理论。他们认为BCR由两类基因片段组成，一类编 码BCR的V区，一类编码BCR的C区。V区基因含有多个基 因片段，只有其中一个片段与C区形成抗体。
纯系三组BALB/c小鼠免疫 抗原后对特异性抗体可变 区的序列分析
抗体的亲和力成熟 (affinity maturation)
SHM在抗体的可变区发生
小鼠和人类的SHM的频率是10-5至10-3，比其他 基因的自发突变高1百万倍。
需要AID （Activation-induced cytidine deaminase）
SHM的机制
AIDcytosine源自uracildC:dG形成 dU:dG错配
uracil-N-glycosylase（UNG)除去dU， Mismatch repair (MMR)蛋白识别错配碱基， Error-prone DNA polymerases修复，导致突变 （在胞嘧啶位置或相邻位置）
SHM的发生
Tonegawa的设想：
BCR胚系基因
X
经过重排的基因 X
XX X
X 限制性内切酶酶切位点
重排现象的实验证明
对小鼠胚系DNA和骨髓瘤细胞V和C基因的DNA 做序列分析，发现在重排后的V区和C区基因不 是直接拼接在一起的，由此发现了J (joining) 基因片段和D（diversity）基因片段。
12/23规则(12/23 rule) 重组信号序列(recombination signal sequence, RSS):
七核苷酸－12/23核苷酸的随机序列－九核苷酸
V区基因的重组由几种V(D)J重组酶协调完成， 负责剪切和连接工作。
包括RAG－1和RAG－2异二聚体组成的内切酶、 TdT、DNA连接酶IV，DNA－PK、Ku。