基因重排检测技术的建立及其在淋巴瘤诊断中的应用(一)
t细胞淋巴瘤tcrγ基因重排特征的分析及检测方法优化
Ｔ细胞淋巴瘤ＴＣＲＴ基Ｎ重排特征分析及检测方法的优化摘要研究背景与目的淋巴瘤在组织和细胞形态学方面与高度反应增生性淋巴组织的鉴别诊断十分困难，容易造成误诊。
淋巴瘤病理诊断是临床病理工作的难题之一。
目前国内主要依靠以形态学为主、免疫组化为辅的诊断手段。
随着分子生物学的发展，从基因水平研究和分析诊断疾病的技术不断出现并且日趋成熟，为淋巴瘤诊断提供了有效工具。
淋巴瘤是由单克隆淋巴细胞增生所致，而反应增生性淋巴组织则来自于多克隆淋巴细胞，这是二者的重要区别。
编码免疫球蛋白（Ｉｇ）或Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）的基因经过重排以后，不同克隆之间的重排基因互不相同，因此，基因重排对淋巴瘤的诊断具有特异性价值。
以ＰＣＲ技术为基础的方法以其简便、高效、廉价及适用面广而在淋巴瘤基因重排研究方面越来越受重视。
但不同研究文献中所采用的引物、ＰＣＲ条件、ＰＣＲ产物检测方法等都不尽相同，结果也有差异。
因此，难以找到适于常规临床病理诊断之用的标准程序。
Ｊｕｒｋａｔ细胞是Ｔ细胞淋巴瘤基因重排研究中常用的阳性对照细胞，但有关Ｊｕｒｋａｔ细胞基因重排的详细情况也未见报道。
假基因是Ｉｇ和ＴＣＲ胚系ＤＮＡ中常见的基因，有关假基因参与重排的情况以及在设计引物方面是否应将假基因包括在内也未见有关研究报道。
本实验以ＴＣＲ基因重排为研究对象，通过优化引物选择、ＰＣＲ条件及ＰＣＲ产物的检测方法等，分析Ｔ细胞淋巴瘤基因重排检测的最佳方法。
同时，分析ＴＣＲ基因重排的特点，为进一步研究ＴＣＲ基因重排提供理论和技术支持。
方法１以ＴＣＲｙ基因重排为研究对象，选用通用引物ＴＶＧ、ＶｖＩ及ＴＣＲ７家族特异性引物为工具。
用正交设计实验优化ⅥＩ引物的ＰＣＲ条件。
另选一对ＴＣＲ［ｊ通用引物作为ＴＣＲｙ引物的补充和比较。
２利用ＰＣＲ和测序研究Ｊｕｒｋａｔ细胞基因重排情况，分析ＴＣＲ基因重排的基本特点。
３ＰＣＲ产物检测方法①利用ＴＣＲ通用引物检测淋巴瘤克隆性基因重排阳性率，分别用琼脂糖电泳和ＳＳＣＰ分析ＰＣＲ产物；②将ＰＣＲ产物分别进行直接测序和克隆后测序，分析ＴＣＲ基因重排的特点及探索测序方法在基因重排检测中的应用；⑧分析ＰＣＲ产物中ＤＮＡ的克隆数与ＳＳＣＰ中条带数目的关系。
抗原受体基因重排克隆性分析淋巴瘤辅助诊断技术的发展和应用现状
Ａ Ｇ的种 系（ｅｍｉｅ 或称胚 胎 的（ｍｂ ｏｉ） 型均 由不连 续 的 Ｄ Ａ 片段 组成 ， 括 可变 区（ａｉ ｌ Ｒ ｇｒｌ ） ｎ ｅ ｒ ｎｃ 构 ｙ Ｎ 包 ｖｒ ｂ ａｅ
ｒｇ ｎ ， 、 ｅｉ ｓＶ） 变异 区（ ｉ ｒ ｔ， ） 连 接 区（ｏｎ ｇ Ｊ 和恒定 区（ ｏ ｓ ｎ， ， Ｊ Ｃ 区存在 于 各种 类 型 Ａ Ｇ ｏ ｄｖ ｓｙ Ｄ 、 ｅｉ ｊｉｉ ， ） ｎ ｃｎｔ ｔＣ） Ｖ、、 ａ Ｒ 中， Ｄ 区仅存在 于 ＩＨ 和 Ｔ Ｒ 及 ＾链基 因中。Ａ Ｇ基 因重排是 淋 巴细胞 完成发育分 化成 熟 的正常 生理 而 ｇ Ｃ１ ｙ ３ Ｒ
过 程， 早在 骨髓 淋 巴细胞 分化 阶段 ，Ｒ Ａ Ｇ基 因即发生重 排 ， 形成 Ｖ（ ） 连 续 Ｄ Ａ 片段 （ １ ， 而产生相 应 ＤＪ Ｎ 图 ）从
的抗 原 受体合 成。
基 因 Ｖ、 、 Ｄ Ｊ片段 的数 量愈 多， 产生 的组 合数也愈 多。该 步骤 可 产生许 多不 同的 Ｄ Ａ序 列， Ｎ 从而编 码 出 不 同的蛋 白质 ， 虽然 它们 的差别及 其微 小 ， 却具 有独立特 异性 。基 因重排 过程使种 系 中承载 的相对有 限的 但
李 挺 ， 幼立 祖
（ ． 京 大学 第 一 医 院 病理 科 ， 京 １北 北
Ｃ ｒｅ ｎｖ ｒ ｔ ， Ｓ ｏｎ ｌ Ｕ ｉ ｓ ｙ Ｕ Ａ） ｌ ｅｉ
１０ ３ ；． ｅａｔ ｅｔ ｆ ｅ ａ ｐｔ ｌｇ， ｅＭｅ ｏｉ ｏｐ ａ， ｉ ｄ ａ Ｃ ｌ ｇ ００ ４２ Ｄ ｐｒ ｎ ｍ ｔ ａ ｏｏｙ ｔ ｔ ｄｓ Ｈ ｓｉ ｌＷｅ ｌ ｉ ｌ ｏｌ ｅ ｍ ｏＨ ｏ ｈ ｈ ｈ ｔ ｔ ｌＭｅ ｃ ｅ
遗传 学信息 转变为大量 的基 因片段 ， 而再编码 为 Ｉ和 Ｔ Ｒ分子 的抗原结 合部位 。这 些不连接 片段 的重新 从 ｇ Ｃ 洗牌和连接从 统计学水 平上 阐释 了人体 免疫 系统 发 生的抗 原 受体 的多变性 。据估 计 ， 因重排机 制 可产 生 基
TCR基因重排检测在T细胞淋巴瘤病理诊断中的作用
TCR Gene Rearrangement in the Pathologic Diagnosisof T-cell LymphomaDissertation Submitted toNorth China University of Science and Technology in partial fulfillment of the requirementfor the degree ofMaster of MedicinebyJia Wen(Pathology and Pathophysiology)Supervisor:Ph.D Ma XiaobingJune,2015独创性说明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得华北理工大学以外其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。
与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。
论文作者签名：日期：2015年6月10日关于论文使用授权的说明本人完全了解华北理工大学有关保留、使用学位论文的规定，即：已获学位的研究生必须按学校规定提交学位论文，学校有权保留、送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以将学位论文的全部或部分内容采用影印、缩印或编入有关数据库进行公开、检索和交流。
作者及导师同意论文公开及网上交流的时间：□自授予学位之日起；□自年月日起。
作者签名：导师签名：签字日期：2015年6月10日签字日期：2015年6月10日√摘要摘要目的探讨T细胞抗原受体（T cell receptor，TCR）基因重排在T细胞淋巴瘤中的特异性及其在病理诊断中的价值。
由于淋巴瘤在临床病理诊断中难度较大，仅凭HE和免疫组织化学特点得出的结论易造成误诊和漏诊。
在恶性淋巴瘤的分类中，T细胞淋巴瘤是一种临床上相对少见且异质性较高的肿瘤，准确做出诊断给病人的治疗和预后带来不可或缺的价值。
基因重排在淋巴瘤中的应用
基因重排在淋巴瘤中的应用好啦，今天咱们来聊一聊“基因重排”在淋巴瘤中的应用。
别被这几个词吓着了，听起来像是高大上的医学术语，但其实也没那么复杂。
想象一下，你拿起一块拼图，突然发现里面的几片图案不对劲了。
是的，基因重排就像是拼图里的那几片被换了位置，它们原本应该在一起的部分，被打乱了。
说到淋巴瘤，大家可能听说过一些，但不一定知道它是怎么回事。
淋巴瘤其实是一种癌症，它影响的是我们的淋巴系统。
我们身体的淋巴就像是一个高速公路网，帮助我们清除垃圾，保持身体健康。
当这个系统出了问题，细胞就开始不听话，变得疯狂生长，进而导致癌症。
你可能会问，基因重排在其中有什么作用？好，我们来细细讲讲。
基因重排其实是淋巴细胞在发育过程中自然发生的一种现象。
就像你去做衣服的剪裁，裁剪一块布料时，常常需要把布料拼接在一起，搞得又快又精确，才能做出合身的衣服。
而这些基因重排，就是在细胞制作“抗体”的过程中，不小心把一些基因片段给弄错了。
通常，这些错误不会导致大问题，但在某些情况下，这些“错误”会导致细胞发生变异，甚至发展成癌症。
所以基因重排不仅仅是个小小的错误，它可能会“助长”淋巴瘤的生长。
我们怎么样才能利用这些“基因小错”来帮我们诊断和治疗淋巴瘤呢？科学家早就发现了，基因重排在淋巴瘤中的出现往往是“特定”的，它像是一个密码，能帮助医生识别淋巴瘤的种类。
就好像你解一个谜题，如果你能抓住那个关键线索，后面的一切都能迎刃而解。
通过对这些基因重排的分析，医生能更好地判断癌症的类型、分期，甚至对症下药。
就像是给病人量身定做一个治疗计划，精准治疗，比那种笼统的“按常规来”效果要好得多。
说到这里，可能有些人会觉得，咦，基因重排这么神奇，难道它就是治愈淋巴瘤的“秘密武器”吗？答案并没有那么简单。
虽然基因重排可以帮助医生进行精准诊断，但它本身并不能直接治愈淋巴瘤。
它就像是我们手中的一张地图，能够让医生找到问题的根源，指导后续的治疗方向。
治疗的方法，还是得靠那些经典的手段：化疗、放疗，或者免疫疗法。
T细胞性淋巴瘤诊断中TCR基因重排检测的应用
T细胞性淋巴瘤诊断中TCR基因重排检测的应用潘鑫艳;杨长绍;黎贵芸;杨举伦;王丽【摘要】目的：探讨T细胞受体( T cell receptors, TCR)基因重排检测对T细胞性淋巴瘤诊断的价值。
方法收集T细胞性淋巴瘤30例和淋巴反应性增生组织30例,提取DNA,应用BIOMED-2引物系统中的56条引物进行PCR扩增,核酸分子异源双链凝胶电泳分析结果。
结果30例T细胞性淋巴瘤标本中TCRβ、TCRγ、TCRδ的检出率分别为83．3%(25/30)、93．3%(28/30)、13．3%(4/30),三者联合检测的检出率为96．7%(29/30),30例淋巴反应性增生组织中均未检测出TCR 基因重排。
结论利用BIOMED-2引物系统检测TCR 基因重排可作为T细胞性淋巴瘤的辅助诊断工具。
%Purpose To discuss the TCR gene rearrangements in the diagnosis of T-cell lymphomas. Methods Formalin-fixed and paraffin-embedded samples including 30 cases of T-cell lymphomas and 30 cases of reactive lymphoid hyperplasia were chosen for ex-tracting genomic DNA and PCR amplification using 56 BIOMED-2 primers. PCR products were analyzed by heteroduplex and polyacryl-amide gel electrophoresis. Results In all 30 cases of T-cell lymphomas, 25 cases (83. 3%) showed TCRβ gene monoclonal rear-ran gements, 28 cases (93. 3%) of TCRγ gene monoclonal rearrangements, 4 cases (13. 3%) of TCRδ gene monoclonal rearrange-ments. 29 cases (96. 7%) with TCRβ+TCRγ+TCRδ gene monoclonal rearrangements were detected. but no clonal TCR gene rear-rangements were found in 30 cases of reactive lymphoid hyperplasia. Conclusions The detection of TCR gene rearrangements using BIOMED-2 primers is a useful assistant method for the diagnosis of T-cell lymphomas.【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2015(000)004【总页数】4页(P400-403)【关键词】T细胞性淋巴瘤;基因重排;BIOMED-2;TCR基因【作者】潘鑫艳;杨长绍;黎贵芸;杨举伦;王丽【作者单位】成都军区昆明总医院病理科，昆明 650032;成都军区昆明总医院病理科，昆明 650032;成都军区昆明总医院病理科，昆明 650032;成都军区昆明总医院病理科，昆明 650032;成都军区昆明总医院病理科，昆明 650032【正文语种】中文【中图分类】R733.4非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)包括B细胞性淋巴瘤(B-cell lymphoma)和T细胞性淋巴瘤(T-cell lymphoma)，因T细胞性淋巴瘤种类繁多，分类复杂，病理诊断较难。
基因组重测序技术及其应用
基因组重测序技术及其应用随着科技的快速发展，基因组重测序技术逐渐走进我们的生活，这项技术可以通过高通量方法获取DNA序列信息，对于基因组学研究、医学诊断和疾病防治等领域都具有重要价值。
本文将从技术原理、数据分析和应用领域等方面介绍基因组重测序技术及其应用。
一、基因组重测序技术的原理基因组重测序技术是一种将目标DNA样本分解为小片段、进行高通量测序的技术。
传统测序方法需要使用琼脂糖凝胶或者聚丙烯酰胺凝胶等凝胶材料对DNA进行分离和分析，而基因组重测序技术则可以同时处理数百万个小DNA片段。
该技术主要分为两种：全基因组重测序，即对整个基因组进行测序；和外显子组重测序，即只对外显子区域进行测序。
其中，外显子组重测序通常用于检测某些突变位点和基因变异，具有高度的实用性。
二、数据分析基因组重测序技术会产生大量的数据，其中包含了数百万条片段的序列信息。
因此，在进行数据分析时需要进行预处理、比对、拼接和注释等多个步骤。
在预处理中，需要去除低质量序列、提取有用的信息等。
比对步骤则是将测序数据与参考基因组相对比，找到测序数据中的对应片段。
拼接步骤就是将这些对应片段拼接成完整的DNA序列，并对其进行修复。
最后，注释工作则是将数据翻译成具有生物学意义的信息，如基因结构、编码和非编码序列等。
三、基因组重测序技术的应用领域基因组重测序技术可以广泛应用于医学研究、育种、环境污染监测等多个领域。
其中，在医学领域中，该技术通常用于寻找患病基因和识别病原微生物。
在育种领域，基因组重测序技术可以用于鉴定优良品种、筛选育种材料，以及深入分析某些种类的基因组结构和功能。
在环境污染监测方面，该技术则可以帮助研究人员监测水体、土壤、大气等环境中的污染物，对于环境保护和生态平衡的维护具有重要意义。
四、未来展望基因组重测序技术的发展趋势将从单样本到多样本，从低深度到高深度，从全基因组到全转录组、全基因组外显子和全基因组甲基化等多个方面不断拓展。
高通量测序分析B细胞非霍奇金淋巴瘤IGH基因克隆性重排特点及临床应用价值
高通量测序分析B细胞非霍奇金淋巴瘤IGH基因克隆性重排特点及临床应用价值马强;邹东梅;郭轶先;赵弘;常晓丽;胡蓉华;孙婉玲【期刊名称】《肿瘤防治研究》【年(卷),期】2024(51)5【摘要】目的探讨B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)IGH基因克隆性重排特点及临床应用价值。
方法收集接受NGS检测,且存在IGH基因存在克隆性重排的55例B-NHL患者的人口学资料、临床资料及IGH基因NGS检测结果,分析IGH基因克隆性重排特点、IGHV基因取用频率,以及NGS检测IGH基因重排在临床中的应用价值。
结果55例患者中,以单个优势克隆为主(85.45%,47/55),少数患者可检测到2个(12.73%,7/55)和3个优势克隆(1.82%,1/55);在IGHV基因取用偏好方面,IGHV3基因在B-NHL中取用频率最高,其次为IGHV4基因;在IGHV亚型中,IGHV3-23在慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)中出现频率最高,IGHV4-34在原发中枢神经系统弥漫大B细胞淋巴瘤(PCNSL-DLBCL)及弥漫大B细胞淋巴瘤非特指型(DLBCL-NOS)中出现频率最高。
结论不同病理类型的B-NHL患者IGH基因克隆性重排中IGHV基因片段取用频率存在偏好,使用NGS检测IGH重排可以识别亚克隆,鉴定克隆相关性,辅助疾病诊断。
【总页数】5页(P368-372)【作者】马强;邹东梅;郭轶先;赵弘;常晓丽;胡蓉华;孙婉玲【作者单位】首都医科大学宣武医院血液内科【正文语种】中文【中图分类】R551.2【相关文献】1.IgH基因单克隆重排检测及其在B细胞性非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用2.血浆游离DNA IgH和TCRγ基因重排在非霍奇金淋巴瘤患者微小残留病中的应用及临床意义3.高通量测序结合捕获技术检测非霍奇金B细胞淋巴瘤中重链基因重排VDJ 区的临床研究4.血浆游离DNA IgH和TCRγ基因克隆性重排在非霍奇金淋巴瘤诊断中的意义5.实时定量PCR检测B细胞非霍奇金淋巴瘤患者外周血和骨髓IgH基因重排及临床意义因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
淋巴瘤的分子生物学诊断知识点
淋巴瘤的分子生物学诊断知识点淋巴瘤是一种以淋巴细胞增生异常为特征的恶性肿瘤，包括多种亚型，具有不同的生物学特征和临床表现。
分子生物学诊断技术在淋巴瘤的分类、预后评估和治疗选择等方面起到了重要的作用。
本文将介绍淋巴瘤分子生物学诊断的一些重要知识点。
一、免疫组织化学检测（IHC）免疫组织化学检测通过检测肿瘤细胞表面或细胞内的特定分子标志物，帮助确定淋巴瘤的亚型和对应的治疗策略。
例如，CD20和CD79a是B细胞标志物，CD3是T细胞标志物，CD30是霍奇金淋巴瘤的标志物等。
免疫组织化学检测可以通过染色的强度和分布情况来判断特定标志物的阳性率，并结合其他临床和病理学特征进行综合分析。
二、基因重排检测淋巴瘤的发生和发展与基因重排异常密切相关。
通过检测重排的免疫球蛋白（Ig）和T细胞受体（TCR）基因，可以帮助确定淋巴瘤的亚型和起源。
例如，典型的霍奇金淋巴瘤患者常存在免疫球蛋白基因的重排。
PCR和Southern blot是常用的基因重排检测方法，可以通过扩增和分析特定基因区域的DNA序列来判断重排情况。
三、染色体异常检测淋巴瘤中常伴随着染色体异常，如染色体重排、整倍体性改变和部分染色体缺失等。
通过检测染色体异常，可以帮助确定淋巴瘤的亚型、预后风险和治疗选择。
常用的染色体异常检测方法包括常规染色体核型分析、荧光原位杂交（FISH）和比较基因组杂交（CGH）等。
FISH 可以通过探针标记的染色体特定区域来检测染色体重排和缺失。
而CGH则可以全基因组范围内分析基因拷贝数变异。
四、新一代测序技术随着新一代测序技术的发展，淋巴瘤分子生物学诊断也得到了进一步的提升。
新一代测序技术可以高效地获得淋巴瘤患者的全基因组、外显子组、转录组和甲基化组等信息。
这些信息可以帮助识别新的突变驱动基因和疾病相关的生物学过程，为个体化治疗提供重要依据。
总结：以上介绍了淋巴瘤分子生物学诊断的一些重要知识点，包括免疫组织化学检测、基因重排检测、染色体异常检测和新一代测序技术。
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基因重排检测技术的建立及其在淋巴瘤诊断中的应用(一)
作者：朱少君，李艳红，张伟，王旭霞，巩丽，李爱宁,兰淼
【关键词】淋巴瘤Detectionandclinicalsignificanceofgenerearrangementsindiagnosisoflymph omas
【Abstract】AIM:ToestablishawaytodetectthegenerearrangementsofIgHandTCRandtoas sesstheapplicationofthedetectiontechniqueinthediagnosisofmalignantlym phoma.METHODS:Fiftythreecasesofmalignantlymphomaand20casesofreac tivelymphoidhyperplasiawerechosenformakingtissuesections.GenomicDN Awasextracted,andamplifiedviaPCR.Theproductswereresolvedondenaturin gpolyacrylamidegelsandvisualizedthroughsilverstaining.RESULTS:Generearr angementsofIgHandTCRwerenegativein20casesofreactivelymphoidhyperpl asia.Inallof18casesofTcellnonHodgkinslymphoma(TNHL),generearrangeme ntofTCRγwasfoundin12casesandthatofTCRβwasfoundin3cases,andIgHgene rearrangementwasnotfound.IgHgenerearrangementwasfoundin28casesou tof32casesofBcellNHL(BNHL),in2casesofwhichgenerearrangementsofTCRγa ndIgHwerebothfound.TherewasIgHgenerearrangementin3casesofsuspecte dlymphomas.TherewasaremarkabledifferencebetweenNHLgroupandbenig ngroupingenerearrangment(P0.05).CONCLUSION:Thedetectionofgenerearr angementsofIgHandTCRbyPCRcanbeakindofsubsidiarymeanstodiagnoseth
elymphoproliferativedisease.Particularly,theclonalityshowedintheformalinf ixedandparaffinembeddedsamplesmaybeusefulintheretrospectiveresearch es.
【Keywords】lymphoma;generearrangement;polymerasechainreaction;neoplasm
【摘要】目的：建立基于克隆性分析技术的B和T淋巴细胞产生的抗原受体分子基因重排检测技术，探讨B淋巴细胞免疫球蛋白及T淋巴细胞受体基因重排在恶性淋巴瘤临床诊断中的应用.方法：从组织蜡块中切取组织片5~10张，提取基因组DNA，PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染显示基因重排结果.结果：20例良性淋巴组织反应性增生病例中,淋巴细胞IgH及TCR基因重排均为阴性；18例T细胞非何杰金氏淋巴瘤中TCRγ基因重排12例,TCRβ基因重排3例，未见有IgH基因重排；32例B细胞性非何杰金氏淋巴瘤标本中有28例IgH基因重排阳性,有2例TCRγ和IgH基因重排均阳性；3例未确诊的疑难病例均为IgH 基因重排；IgH及TCR基因重排检出率在淋巴瘤组与良性组之间，差异有显著意义(P0.05).结论：应用PCR法检测B淋巴细胞IgH和T淋巴细胞TCR基因重排可作为淋巴细胞来源的良、恶性病变的一种辅助诊断手段，且适用于石蜡标本以进行回顾性研究.
【关键词】淋巴瘤；基因重排；聚合酶链反应；肿瘤
0引言
恶性淋巴瘤(malignantlymphoma)是免疫系统的原发性恶性肿瘤,主要发
生于淋巴器官和淋巴组织.根据肿瘤的组织结构及细胞学特征可分为何杰金氏病（Hodgkinsdisease,HD）及非何杰金恶性淋巴瘤（nonHodgkinsmalignantlymphoma,NHL），淋巴瘤的诊断一直是病理诊断中的难点，部分淋巴组织增生性病变单纯通过HE和免疫组化很难明确性质，另外NHL由于种类繁多，分类复杂，给临床病理工作者带来了一定的困难.
淋巴细胞从原始的胚系构型到分化成熟,其抗原受体(Ig和TCR)基因通过基因重排而形成有功能的基因.一个T，B细胞或其克隆性后代，均只含一种独特的分子遗传学标记.一旦某一克隆的淋巴细胞发生恶性变化,即可呈现特异的基因重排〔1〕.因此,对基因重排类型进行检测可用于对淋巴细胞增殖性疾病的诊断.此研究拟应用这一手段，探讨淋巴组织增生性病变的性质，并对该技术在恶性淋巴瘤中的诊断价值进行探讨. 1材料和方法
1.1材料53例恶性淋巴瘤标本均来自第四军医大学唐都医院病理科（1995~2005）.其中男性29例（55%），女性24例（45%）；年龄12~76岁，平均年龄44.2岁.所有标本均为福尔马林固定、石蜡包埋组织.其中B细胞非何杰金淋巴瘤32例，T细胞非何杰金淋巴瘤18例，未能定性的淋巴组织增生性病变3例.20例良性淋巴组织反应性增生病例作为阴性对照.所有淋巴瘤病例均在取PCR模板前经临床病理HE和免疫组化标记（B细胞:CD20,CD79α;T细胞:CD3,CD45RO）证实，以确定为相应病例且所取部位确为病变部位，包含有需检测的部分.3例未能定性的淋
巴组织增生性病变怀疑为BNHL(免疫组化标记CD79α阳性),但诊断仍未明确.
1.2方法
1.2.1石蜡包埋组织DNA的提取每例标本制备厚度为4μm的切片6张，贴于载玻片上，常规烤片、二甲苯脱蜡、乙醇冲洗，切片自然干燥.用无菌双面刀片将组织刮入1.5mL的离心管中，按以前的方法〔2-3〕提取基因组DNA.
1.2.2引物合成引物序列由上海生工生物工程技术公司合成.引物序列为:β球蛋白基因内对照PC03：ACACAACTGTGTTCACTAGC，PC04：CAACTTCATCCACGTTCACC；免疫球蛋白基因重排(IgH)FR3A：ACACGGCTGTGTATTACTGT，LJH：TGAGGAGACGGTGACC，VLJH：GTGACCAGGGTACCTTGGCCCCAG；T细胞受体基因重排(TCRβ链和γ链)Db1:CAAAGCTGTAACATTGTGGGGAC，Jb2:AGCACTGTGAGCCTGGTGCC，TVG:AGGGTTGTGTTGGAATCAGG，TJX:CGTCGACAACAAGTGTTGTTCCAC，Vγ11:TCTGGAGTCTATTACTGTGC，Vγ101:CTCACACTCTCACTTC，Jγ12:CAAGTGTTGTTCCACTGCC，Jp12:GTTACTATGAGCTAGTCC.
1.2.3PCR扩增及循环条件PCR扩增在PT200型热循环仪（MJResearch）上进行.反应体系为25μL，含10mmol/LdNTP（GibcoBRL）2μL，10×缓冲液2.5μL，50mmol/LMgCl20.75μL，TaqDNA聚合酶（GibcoBRL）1U，20pmol/L引物1μL，DNA样品1~5μL.IgH基因采用半巢氏PCR扩增:第一轮引物为FR3A和LJH,95℃预变性3min,然后94℃变性40s,62℃退火
50s,72℃延伸40s,共30个循环;最后72℃延伸10min.扩增产物经1∶100稀释后取1μL进行第二轮扩增,引物为FR3A和VLJH,95℃预变性3min,然后94℃变性40s,60℃退火50s,72℃延伸40s,共30个循环;最后72℃延伸10min.FR3A与VLJH扩增产物为100～120bp.
TCRβ和TCRγ采用40个循环,其中TCRγ引物为Vγ11，Vγ101和Jγ12或Vγ11，Vγ101和Jp12的混合物.95℃预变性3min,然后94℃变性40s,56℃退火50s,72℃延伸40s；最后72℃延伸10min.TCRβ扩增产物为65～85bp.TCRγ各组扩增产物在70～200bp不等.
β球蛋白基因引物作为内对照进行扩赠,共40个循环.95℃预变性3min，然后94℃变性40s,60℃退火50s,72℃延伸40s；最后72℃延伸10min.产物长度为110bp.
1.2.4电泳及结果观察琼脂糖凝胶（20g/L）电泳评价扩增效果后，将3μL 产物和等体积的上样缓冲液〔4〕（990mL/L甲酰胺，1g/L溴酚蓝，1g/L 二甲苯青）混匀后加到厚度为0.8mm的聚丙烯酰胺凝胶（100g/L，含尿素8mol/L），应用miniVE系统（AmershamPharmaciaBiotech）泳动8h（80V）.取出后按以前的方法〔2〕银染，分别用UVP凝胶分析系统（UVP,Cambridge，UK）和光学照相记录数据，根据IgH及TCR相应阳性位置判断结果.
1.2.5结果判定阳性结果判定标准：①PCR扩增电泳条带清晰，宽度不大于1mm，边缘锐利；②片段大小与预计范围相符,与期望值相差不超过5bp；③若出现期望值大小之外的其他条带或期望值内出现两条
或以上可接受的条带，应判定为重排阴性.
统计学处理：采用SPSS10.0统计分析软件对组间率的差别进行χ2检验,以P0.05为有统计学意义.。