DNA重排的检测方法

四、分子生物学技术
1. Southern-blotting • 应用于基因重排检测是1981年Korsmeyer等 应用于基因重排检测是1981 Korsmeyer等 1981年 首先进行的。 首先进行的。 • 淋巴瘤DNA重排:将细胞DNA抽提出来,用限 淋巴瘤DNA重排:将细胞DNA抽提出来, DNA重排 DNA抽提出来 制 性内切酶进行酶切，胚系DNA DNA就会产生特征 性内切酶进行酶切，胚系DNA就会产生特征 性片段。但发生过基因重排的细胞DNA DNA的酶 性片段。但发生过基因重排的细胞DNA的酶 切位点有所改变，会产生有别于胚系的DNA 切位点有所改变，会产生有别于胚系的DNA 酶切片段。转膜后，与标记的DNA探针杂交， DNA探针杂交 酶切片段。转膜后，与标记的DNA探针杂交， 如有一定数量的克隆性增殖的淋巴细胞存 (>1 在 (> 1 ~ 5 % ） ， 克隆性的基因重排条带就 可显示出来。 可显示出来 。 对于正常或多克隆性的淋巴 细胞增生， 细胞增生 ， 由于重排片段大小各异而显弥 散带。 散带。
Figure 5._Southern blot analysis of the T-cell receptor -chain gene. Three specimens are shown, each digested with EcoRI, BamHI, and HindIII restriction enzymes, run in agarose gels, transferred to a nylon membrane, and hybridized with a radioactively labeled J probe. Two specimens, one (negative control) in lanes 2, 5, and 8, and the second in lanes 3, 6, and 9, reveal only germline bands and are polyclonal. The third specimen, in lanes 4, 7, and 10, has evidence of gene rearrangement in all 3 lanes and is monoclonal. Lane 1 shows the markers. Lane 11 is a 5% sensitivity control
4. 比较基因组杂交
Comparative Genomic Hybridization (CGH) 原理：在荧光原位杂交基础上， 原理：在荧光原位杂交基础上，结合消减杂 交技术而发展起来的技术， 交技术而发展起来的技术，主要用于 肿瘤的检测及其基因组分析 是由Kallioniemi等在 等在1992年首先提出的，是检 年首先提出的， 是由 等在 年首先提出的 测整个肿瘤基因组DNA增加或减少的强有力的 测整个肿瘤基因组 增加或减少的强有力的 工具
二、细胞遗传学
染色体核型分析、 染色体核型分析、染色体显带 一个物种的染色体核型及带型是稳定的 染色体核型分析：观察中期染色体， 1. 染色体核型分析：观察中期染色体，初步 分析染色体有无较大片段的缺失、断裂、 分析染色体有无较大片段的缺失、断裂、 易位、及附加 易位、 • 常规核型分析 • 荧光核型分析 • 光谱核型分析(Spectral karyotyping, SKY) 光谱核型分析(
• 肿瘤DNA和对照DNA 肿瘤DNA和对照DNA DNA和对照 在染色体上的相对结 合量取决于两种DNA 合量取决于两种DNA 标本中相应杂交序列 的多少 • 因此可根据不同荧 光強度的比率而定量 分析肿瘤基因組中 DNA的增加或丟失 DNA的增加或丟失
等比混合
比较基因组杂交原理示意
比较基因组杂交过程
人染色体光谱核型分析
乳腺癌细胞染色体复杂的畸变
2.染色体显带技术： 2.染色体显带技术： 染色体显带技术 • C-banding 主要染异染色质 • R-banding 与C-banding 相反，主要染 相反， 常 染色质区域 • G-banding 是Giemsa 染色结果，产生深 染色结果， 浅不同的条带 • Q-banding 是用喹丫因（quinacrine） 是用喹丫因（quinacrine） 染 色得到的荧光条带，带型与G 色得到的荧光条带，带型与G带相似
DAPI ,64’,6-二联脒-2,6 二联脒吲哚苯
FITC 异硫氰酸酯
TRITC 硫氰酸四甲基罗丹明
人染色体不同荧光素染色结果
数 字 化 图 像
FITC/TRITC 荧光强度比率分析图 Ratio image FITC/TRITC
应用： 应用： • 主要应用在检测肿瘤细胞的遗传变化 • 物种间染色体同源性比较 优势： 优势： • 可快捷检测中期、间期基因组 可快捷检测中期、 • 不需预先知道 不需预先知道DNA发生改变的部位 发生改变的部位 • 一次实验即可检出待测样本整个基因 组拷贝数的增减
2. 常规PCR技术 常规 技术
DNA发生重排后，其扩增产物条带与正常的有差异， DNA发生重排后，其扩增产物条带与正常的有差异， 发生重排后 由此可以检测DNA DNA重排 由此可以检测DNA重排 • 淋巴瘤诊断 ： 淋巴瘤是细胞克隆性增生的结果 ， 淋巴瘤诊断： 淋巴瘤是细胞克隆性增生的结果， 其特殊的基因重排形式占一定的数量优势， 其特殊的基因重排形式占一定的数量优势 ， 从而成 为细胞克隆性的检测指标。选取IgH与TCR（T细胞受 为细胞克隆性的检测指标。选取IgH与TCR（ IgH 区基因编码中20 体）的V、D、J、C区基因编码中20 个左右的保守核 苷酸序列， 人工合成一对或多对（ 家族基因） 引物， 苷酸序列 ， 人工合成一对或多对 （ 家族基因 ） 引物 ， 以待测样品DNA为模板， 扩增目的DNA序列片段。 DNA为模板 DNA序列片段 以待测样品 DNA 为模板 ， 扩增目的 DNA 序列片段 。 如 果是淋巴瘤则扩增产物电泳出现单克隆性单带。 果是淋巴瘤则扩增产物电泳出现单克隆性单带 。 而 良性增生性淋巴组织或正常组织则出现弥漫涂片状， 良性增生性淋巴组织或正常组织则出现弥漫涂片状 ， 不形成单带。 不形成单带。
G-带 c. 正常染色体 a. 末端缺失 ห้องสมุดไป่ตู้. 末端倒位 b. 末端单向易位 e. 着丝粒周倒位
G－带显示人急性骨髓白血病异常染色体 10、11染色体间易位 染色体间易位， 9、10、11染色体间易位，右为异常染色体
三、分子细胞遗传学
1. 原位杂交（In situ hybridisation） 原位杂交（ ） 标记的核酸探针变性后与已变性的靶核 酸在退火温度下复性， 酸在退火温度下复性，在不改变被分析 对象， 对象，即维持其原位的前提下对靶核酸 进行分析。 进行分析。 2. 荧光原位杂交
Fluorescent in situ hybridisation (FISH)
核酸探针用荧光染料标记， 核酸探针用荧光染料标记，荧光信号通 过显微镜观察。 过显微镜观察。
染色体涂染(Chromosome 3. 染色体涂染(Chromosome painting)
又称为多重荧光原位杂交(multiplex又称为多重荧光原位杂交(multiplexfluorescence in situ hybridisation, M-FISH) • 可同时检测多个染色体，一次杂交即可检 可同时检测多个染色体， 测人的24条染色体 测人的 条染色体 • 可检测简单及复杂的染色体重排
荧光原位杂交原理示意
荧光原位杂交过程
急性骨髓白血病 10、11号染色体间易位 、 号染色体间易位
10、11号染色体易发生 、 号染色体易发生 断裂的基因(MLL)位点 断裂的基因 位点
小麦－簇毛麦F1 小麦－簇毛麦 代染色体间易位
染色体涂染显示人染色体组
荧光标记探针
• 不对环境构成污染 • 灵敏度能得到保障 • 可进行多色观察分析，可同时使用多个 可进行多色观察分析， 探针， 探针，缩短因单个探针分开使用导致的 周期过长和技术障碍。 周期过长和技术障碍。
• 优势：Southern分析已被应用于IgH、 Igk、 优势：Southern分析已被应用于IgH、 Igk、 分析已被应用于IgH Igl及各种TCR(T-细胞受体)克隆性重排的检测， 及各种TCR(T Igl及各种TCR(T-细胞受体)克隆性重排的检测， 并以其令人满意的灵敏度和可靠性被视为基因 重排检测的“金标准” 重排检测的“金标准”。 局限：需要较大量（10mg）新鲜或冰冻组织， • 局限：需要较大量（10mg）新鲜或冰冻组织， 操作复杂，若用放射性同位素标记，时间过长 操作复杂，若用放射性同位素标记， 约两周），易污染等缺点， ），易污染等缺点 （约两周），易污染等缺点，仅适用于科研而不 适用于临床诊断。 适用于临床诊断。 • 改进：荧光素标记IgH、 Igk、Igl及各种TCR探 改进：荧光素标记IgH Igk、Igl及各种TCR探 IgH、 及各种TCR 针化学发光试剂盒克服了上述缺点， 针化学发光试剂盒克服了上述缺点，以荧光素 取代了同位素作为标记；缩短了曝光时间(5~10 取代了同位素作为标记；缩短了曝光时间(5 分钟) 并且敏感性不降低， 分钟)，并且敏感性不降低，非常有利于在临床 诊断中推广、应用。 诊断中推广、应用。
转基因材料外源基因的检测
转基因黑麦草PCR检测外源Ubi启动子 转基因黑麦草PCR检测外源Ubi启动子 PCR检测外源Ubi
• 上个世纪 年代科学家B．McClintock 上个世纪40年代科学家 ． 年代科学家 观察研究玉米籽粒和叶子时发现有颜色 变化。 变化。 这种颜色变化是由遗传结构的基 本改变引起的，从而导致转座子的发现。 本改变引起的，从而导致转座子的发现。 • 肿瘤细胞与正常细胞 肿瘤细胞中基因重排现象非常普遍， 肿瘤细胞中基因重排现象非常普遍，遗 传结构的改变引起表型的改变。 传结构的改变引起表型的改变。因此从 形态学上可以鉴定肿瘤。 形态学上可以鉴定肿瘤。