琼脂糖凝胶4B
凝胶层析法
聚丙烯酰胺凝胶的性质
生物凝胶的编号反映出它的分离界限。 如Bio-Gel P-100。
42
四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ）
（一）琼脂糖凝胶
结构是由β-D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖以α-1，3和β-1，4-糖苷键相间连接而成的链状分子。
43
Sepharose
琼脂糖凝胶（agarose gel）可以分离葡聚糖凝
胶和生物胶所不能分离的大分子，使凝胶层析的分
离区间扩大到大分子和病毒颗粒，其最大范围可达 相对分子质量108，但是由于琼脂有强烈的吸附作用， 给使用造成了困难，后来，基；另一组分叫琼脂糖，它不含有带电基团，
其结构是有β-D-吡喃半乳糖和3，6脱水-L-吡喃半乳 糖相结合的链状多糖。
这种琼脂糖被用来进行凝胶层析，它既具有琼脂凝 胶相同的分离区间，又没有吸附作用。但其稳定性
远不如葡聚糖凝胶和生物胶P，强酸强碱能引起结构
破坏。最好使用条件控制在pH 4～9之间，温度0～ 40℃，超出此范围,可能被破坏。
（3）分离条件缓和。
（4）应用广泛。 （5）分辨率不高，分离操作较慢。
20
第二节 凝胶的结构和性质
一、葡聚糖凝胶 (Sephadex) 二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex) 三、聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-Gel P） 四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ） 五、多孔玻璃微球 (Bio-glas) 六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）
分离的目的。
（一）平衡排除理论
当溶质层流过一个填料颗料这段距离时，溶 质分子已多次进出于填料的孔，达到平衡。
琼脂糖凝胶
谢谢观看
琼脂糖 Agarose，缩写为AG，是琼脂中不带电荷的中性组成成份，也译为琼胶素或琼胶糖。琼脂糖化学结构 由β-D-吡喃半乳糖(1-4)连接3,6-脱水α-L-吡喃半乳糖基单位构成.
制作方法
把琼脂糖，即几乎不含硫酸根的主要成分为多糖的琼脂，溶于热水，冷却制成的凝胶。
作用
制成的小颗粒用于凝胶过滤。适于用sephadex不能分级分离的大分子的凝胶过滤，若使用5%以下浓度的凝胶， 也能够分级分离细胞颗粒、病毒等。利用其吸附性小的特点，有时用它代替琼脂、以作为免疫电泳或凝胶内沉降 反应的支持物。
琼脂糖凝胶
以琼脂糖为支持介质制备的凝胶
01 商品名称
03 制作方法
目录
02 基本结构 04 作用
琼脂糖凝胶是以琼脂糖为支持介质制备的凝胶。琼脂糖分为一般琼脂糖和经化学修饰后熔点降低的低熔点琼 脂糖，琼脂糖的熔点在62〜65°C之间，融化后在37°C下可维持液态数小时，30°C时凝固成胶。多用于对染色 体DNA在凝胶内进行原位酶切及DNA片段回收。琼脂糖凝胶由于孔径大常用于大分子蛋白质、DNA的分离。
商品名称
琼脂糖凝胶agarose gel 储藏温度:常温 商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）链如氢键来维持状结构，状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下， 它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化， 也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。
层析柱的一些总结
多数微生物碱性蛋白酶不耐热，碱土金属，特别是钙对碱性蛋白酶有明显的热稳定作用碱性蛋白酶是加酶洗涤剂的主要添加剂之一，在丝绸、制革工业中也有广泛用途热稳定性将酶液分别置于不同的温度条件下（30℃，40℃，50℃，60℃，70℃）保温10min 后，立即在0℃冰浴中冷却，然后在40℃下测碱性蛋白酶活力，以剩余的酶活性作为评价酶的热稳定性的指标。
测量三个重复求平均值，将最高的酶活力定义为100%，分别计算不同温度条件下蛋白酶的剩余酶活性与最高酶活性的比值。
以ph7的缓冲液为例,如果你的目标蛋白等电点小于7,呢就带负电荷,用阴离子交换的柱子,如果是大于7,那选择阳离子交换的柱子,如果等电点是7,那上样的缓冲液pH大于它的等电点用阴离子,小于7的用阳离子,如此类推就可以缓冲液的PH＝pI值＋1，上阴离子柱，＝pI值－1，上阳离子柱，一般缓冲液ph范围在6.5～8.5之间，与PI值相差1个PH是比较理想的。
如果不清楚PI值，可以将蛋白溶到PH梯度的缓冲液里，然后分别试阳离子和阴离子填料（50ul左右得体积就够了），看那个PH下挂得好。
强离子交换剂: 在宽pH范围内载量稳定，所以他的优点是不同pH下载量恒定，可控性好，平衡过程快速、简单。
弱离子交换介质的缺点：适用的pH范围比较小，随着pH不同载量发生变化。
但是大部分蛋白等电点在5.5 ~ 7.5 。
因此强/弱离子交换介质都可以使用弱离子交换介质（DEAE、ANX、CM)优点在于：和强离子交换介质的选择性不同，因此我们一般先使用强离子交换，如果优化条件还是达不到理想的分离效果，可以尝试弱离子交换，用选择性不同的介质尝试一下。
因此弱离子交换与强离子交换由于选择性不同，可以说是对不同蛋白的结合力有差异。
S技术规格离子交换剂类型Q Sepharose FF 季氨基，强阴离子DEAE Sepharose FF 二乙基氨基乙基，弱阴离子ANX Sepharose 4FF 二乙基氨基丙基，弱阴离子SP Sepharose FF 磺丙基，强阳离子CM Sepharose FF 羟甲基，弱阳离子离子容量Q Sepharose FF 0.18-0.25mmol（Cl-）/mlDEAE Sepharose FF 0.11-0.16mmol（Cl-）/mlANX Sepharose 4 FF 0.13-0.18mmol（Cl-）/mlSP Sepharose FF 0.18-0.25mmol（H+）/mlCM Sepharose FF 0.09-0.13mmol（H+）/ml动态载量Q Sepharose FF 120mg HSA/ml 填料DEAE Sepharose FF 110mg HSA/ml 填料ANX Sepharose 4 FF 5mg 甲状腺球蛋白/ml 填料SP Sepharose FF 70mg RNAase/ml 填料CM Sepharose FF 50mg RNAase/ml 填料压力/流速Q Sepharose FF 400-700cm/h，100kpa，XK50/30层析柱，柱床高15cmDEAE Sepharose FF 300-600cm/h，100kpa，XK50/30层析柱，柱床高15cmANX Sepharose 4 FF 至少200cm/h，100kpa，XK50/60层析柱，柱床高25cmSP Sepharose FF 400-700cm/h，100kpa，XK50/30层析柱，柱床高15cmCM Sepharose FF 300-600cm/h，100kpa，XK50/30层析柱，柱床高15cm平均颗粒大小 90um（45-165um）基质Sepharose FF 高度交联琼脂糖，6%Sepharose 4 FF 高度交联琼脂糖，4%PH稳定性Q Sepharose FF 1-14（短期），2-12（长期）DEAE Sepharose FF 1-14（短期），2-13（长期）ANX Sepharose 4 FF 2-14（短期），3-13（长期）SP Sepharose FF 3-14（短期），4-13（长期）CM Sepharose FF 2-14（短期），4-13（长期）化学稳定性在所有常用的水溶液缓冲液中稳定：8M尿素、6M盐酸胍、70%乙醇、1M NaOH和1M醋酸20%乙醇（Q , DEAE,ANX,CM ）,含0.2M醋酸钠的20%乙醇（SP）保存保存温度4℃-30℃l 1M NaOH和醋酸仅在清洗时使用Phenyl-Sepharose HP产品名称：苯基-琼脂糖凝胶6FF性状：白色微球凝胶类型：疏水层析介质粒径：45-165µm工作PH值：3-13应用：疏水层析介质，快流速，适合生物大分子和疫苗的分离纯化等产品名称：苯基-琼脂糖凝胶H.P.性状：白色微球凝胶类型：疏水层析填料粒径：24-44µm工作PH值：3-13应用：疏水层析介质，高分辨率，适合生物大分子和疫苗的分离纯化等产品名称：苯基-琼脂糖凝胶CL-4B性状：白色微球凝胶类型：疏水层析填料粒径：45-165µm工作PH值：3-13应用：疏水层析介质，适合生物大分子和疫苗的分离纯化等。
谷胱甘肽-琼脂糖凝胶 4B（GST 标签纯化树脂）说明书
谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B （GST 标签纯化树脂）说明书货号：P2020规格：5mL/10mL/25mL/50mL保存：4℃保存，有效期至少一年。
产品简介：pGEX 载体表达的外源蛋白与谷胱甘肽S-转移酶融合，因此可以通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析进行纯化。
GSTs 是一类以谷胱甘肽（γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸）作为底物，通过形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。
由于GST 对底物的亲和力是亚毫摩尔级的，因此谷胱甘肽固化于琼脂糖形成的亲和层析树脂对GST 及其融合蛋白的纯化效率很高。
可以用含游离谷胱甘肽的缓冲液洗脱结合GST 融合蛋白。
树脂用3mol/L NaCl 的缓冲液再生。
谷胱甘肽琼脂糖对GST 融合蛋白的结合能力很强（每毫升柱床体积的树脂能结合8毫克融合蛋白）。
特性:粒度：45-165µm流速：75cm/h 工作PH ：4-10耐压：0.3Mpa载量：＞5mg 谷胱甘肽S-转移酶使用说明：谷胱甘肽树脂的处理:1.轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆。
2.取部分匀浆放入15mL 聚丙烯管（每100mL 细菌培养物大约需要2mL 匀浆）。
3.4℃500g 离心5分钟，小心去掉上清。
4.在树脂中加入10倍柱床体积预冷的PBS ，颠倒数次混匀，4℃500g 离心5分钟，小心去掉上清。
5.每毫升树脂加入1毫升冷的PBS ，制成50%匀浆，颠倒数次，混合均匀，悬液冰上放置待用。
制备细胞抽提物：6.每100毫升培养物的细胞沉淀重悬于4mL PBS 缓冲液中。
7.加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL,冰上放置30分钟。
8.用针筒将10mL 浓度为0.2%的TritonX-100强行注入黏稠的细胞裂解物中，剧烈振动数次混匀。
加入DNase 和RNase 至终浓度5ug/mL,4℃振动温育10分钟，4℃3000g 离心30分钟，去除不溶性细胞碎片，上清转移到一只新管中，加入DTT 至终浓度1mmol/L 。
第7章 亲和层析
二、配体的选择
理想的配体应具有以下一些性质： 1) 配体与待分离的物质有适当的亲和力。亲和力太弱，待分 离物质不易与配体结合，造成亲和层析吸附效率很低。而且 吸附洗脱过程中易受非特异性吸附的影响，引起分辨率下降。 但如果亲和力太强，待分离物质很难与配体分离，这又会造 成洗脱的困难。总之，配体和待分离物质的亲和力过弱或过 强都不利于亲和层析的分离。应根据实验要求尽量选择与待 分离物质具有适当的亲和力的配体。
4) 配体自身应具有较好的稳定性，在实验中能够 耐受偶联以及洗脱时可能的的较剧烈的条件，可以 多次重复使用。
根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为 两类：特异性配体（specific ligand）和通用性配体 （general ligand）。 特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生 物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶 和它的抑制剂、激素－受体等，它们结合都具有很高的特异 性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。配体的特异性 是保证亲和层析高分辨率的重要因素，但寻找特异性配体一 般是比较困难的，尤其对于一些性质不很了解的生物大分子， 要找到合适的特异性配体通常需要大量的实验。
例如胰蛋白酶的天然蛋白质类抑制剂有胰脏蛋白酶 抑制剂（pancreatic trypsin inhibitor，PTI），卵粘蛋白 （ovomucoid）和大豆胰蛋白酶抑制剂（soybean trypsin inhibitor，STI）等，小分子抑制剂有苄脒 （benzamidine）、精氨酸和赖氨酸。这些抑制剂均可作 为亲和纯化胰蛋白酶的配基，但与酶的结合常数各不相同。 例如，STI与胰蛋白酶的结合常数达109L/mol以上，而对 氨基苄脒（p-aminobenzamidine）与胰蛋白酶的结合数约 为4×104L/mol（25℃）。
琼脂糖凝胶4B
琼脂糖凝胶4B琼脂糖凝胶4B是用4%浓度琼脂糖制备成的球型颗粒，作为凝胶层析介质使用。
1.外观本品为乳白色球状凝胶，无嗅、无味、无肉眼可见杂质。
2.理化指标项目指标基质4%琼脂糖凝胶排阻极限60000~20×106(球蛋白)形状球型粒径45~165μm最高流速70-140cm/h*耐压0.03MPa耐热pH7水中45℃24hpH适用范围4~9(长时间)，3~11(短时间，在位清洗)化学稳定性可耐8mol/L尿素、6mol/L盐酸胍*检测条件：层析柱10mm×300mm*柱床高15cm，25℃，流动相为0.1mol/LNaCl。
3包装产品以聚胺酯瓶密封包装，外贴标签，注明“品名、体积、颗粒大小”等内容。
4贮存产品应密封贮存在4℃~25℃（保存溶液为20%乙醇），通风、干燥、清洁的地方。
不能冷冻。
用过的柱子贮存在4℃（20%乙醇）。
5注意事项本品应避免与氧化剂接触，避免长时间暴露在空气中6.运输运输中应避免日晒、雨淋、重压，严禁与有毒、有害物品混运。
7保质期5年。
8应用本产品为传统的琼脂糖介质，非特异性吸附低，回收率高，可多次重复使用等特点，用于分子量差异大、对分辨率要求不高的样品的凝胶层析纯化。
下面简要介绍介质的使用过程。
8.1装柱凝胶过滤介质的使用对装柱的要求较高，为了保证分离效果，一般通过柱子上加一个装柱器来使分离柱装满凝胶，或采用带有轴向加压装置的柱子。
凝胶柱床一般高于60cm。
装柱效果可用染料或丙酮-水溶液进行检验。
以下过程为通用介质装填过程。
若为带有轴向加压装置的柱子，可在柱床稳定后将柱床压紧，接好管路。
（1）让所有的材料和试剂达到室温。
配制缓冲液。
凝胶层析上样、平衡和洗脱只用一种低盐浓度的缓冲液。
（2）选择一根一定直径的柱子，长约30~60cm,根据柱子大小取所需量的凝胶（约为柱床体积的1.15倍），清洗掉20%乙醇，抽干，用缓冲液（按凝胶：缓冲液=3：1的比例）配成匀浆。
葡聚糖凝胶操作方法
【实验目的】1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。
2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。
【实验原理】凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。
层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。
葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。
凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。
可分离的分子量范围从几百到几十万不等。
葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。
分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。
若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。
本实验以葡聚糖凝胶G—25作为固定相载体，来分离蓝色葡聚糖—2000和溴酚蓝。
蓝色葡聚糖—2000分子量接近2×106，而溴酚蓝分子量为670，二者分子量相差较大，前者完全排阻，而后者则可完全进入凝胶颗粒网孔内，二者通过层析柱的时间不同而分开。
【实验材料】1.实验器材层析柱(1×20cm)附有一小段乳胶管及螺旋夹；洗脱液瓶(带下口的三角瓶，250m1)；试管及试管架；量筒10m1；721型分光光度计2.实验试剂(1) Tris—醋酸缓冲液(pH7.0):取0.0lmol/L Tris溶液(含0.1mol/L KCl)900ml，用浓醋酸调pH至7.0，加蒸馏水至1000m1。
ConA -琼脂糖凝胶 4B使用说明
ConA-琼脂糖凝胶4B使用说明货号：S8871规格：25ml一、简介ConA-琼脂糖凝胶4B将伴刀豆球蛋白（Con A）偶联到交联及活化的琼脂糖凝胶上，该填料具有很高的化学稳定性。
Con A能和各类带甘露醇及葡萄糖残基的糖、糖蛋白、糖脂，所以Con A琼脂糖凝胶可以用于这类物质的分离纯化。
本产品稳定性好，基团脱落少，使用寿命长，使用方便，应用广泛。
二、亲和填料特性特点基团脱落少，结合特异性强基质4%的交联琼脂糖凝胶配基Con A配基密度5-10mg/ml载量10-25mg甲状腺球蛋白亲和填料的颗粒大小45-165μm最大流速100cm/hpH范围4-9使用温度4℃~常温保存温度+4~8℃保存液体20%乙醇三、适用范围Con A琼脂糖凝胶用于各种带甘露醇及葡萄糖残基的糖、糖蛋白、糖脂的分离纯化。
四、操作说明（1）该凝胶从冷室或冰箱中取出后最好在室温下缓慢振摇恢复到室温，然后再装柱，以免产生气泡影响柱效。
（2）吸附：10-30Tris-HCl缓冲液，pH7.5，其中含有0.2M NaCl，2mM MnCl2，2mM CaCl2。
平衡10个柱子床体积。
（3）洗脱：可以用pH4.5-6的缓冲液洗脱，也可以用100-500mM糖类竞争线性或阶段洗脱，例如用甲基葡萄糖等甲基吡喃糖，其中缓冲液可以是10-30Tris-HCl缓冲液，pH7.5，含有0.2M NaCl.洗脱最多可以到10个柱床体积。
（4）上样样品必须与平衡柱子的缓冲液pH、电导相同。
（5）Con A琼脂糖凝胶FF亲和填料的再生处理方法：先用0.1M Tris-HCl pH8.5缓冲液洗含0.2M NaCl洗10个柱床体积，然后用20mM醋酸缓冲液，pH 4.5洗3个床体积,最后用20%乙醇洗3个床体积即可。
（6）对于吸附力强的物质可以用0.1M硼酸盐缓冲液，pH6.5低流速洗3-5个柱床体积。
也可以用乙醇线性洗脱20-50%。
（7）该亲和填料保存条件为20%乙醇，+4~8℃。
凝胶过滤层析法
第12页/共82页
Sephadex经改性后比其母体具有更广泛的用途，适用于脂类、甾类、脂肪酸、激素、维生素及其他小分子的分级分离。
10
15-20
72
5
150
5000-400000
1000-150000
15
20-30
72
5
200
5000-800000
1000-200000
20
30-40
72
5
第10页/共82页
Sephadex的型号及性能
第11页/共82页
3、主要用途：孔径较小的凝胶主要用于脱盐、肽与其他小分子的分离；孔径较大的凝胶用于蛋白质与其他大分子的分离。DNA级的Sephadex适用于DNA或低聚核苷酸的分离。
峰宽：峰的基线宽度，通过层析峰两侧拐点作切线交于基线上的距离。
标准差：样品组分被带出层析柱的分散度，用σ表示。两侧拐点之间的距离为2个标准差。
Wb=4 σ=1.699W1/2
W1/2=2.354 σ
第46页/共82页
保留值：表示样品中各组分在层析柱中停留时间的长短或组分流出时所需流动相体积的大小。
第26页/共82页
第27页/共82页
Sephacryl系列产品性能
第28页/共82页
(五)、Superdex系列产品 是最新的凝胶过滤介质，属BioProcess介质中的一种。是将葡聚糖以共价键方式结合到高交联的多孔琼脂糖珠体上形成的复合凝胶。是将交联葡聚糖优良的过滤选择性及高交联的琼脂糖的物理化学稳定性集于一身的具有优良选择性和高分辨率的产品。可在0.1mol/LHCl或1mol/LNaOH溶液中40℃处理400小时而分辨率保持不变。
葡聚糖分离范围
凝胶过滤填料的分离范围表SephadexG-10葡聚糖凝胶G-10 分离范围<700 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sephadex G-15 葡聚糖凝胶G-15 分离范围<1500 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sephadex G-15 葡聚糖凝胶G-15 分离范围<1500 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sepharose 6B 琼脂糖凝胶6B 分离范围：1000-5000，适用于脱盐、肽与其它小分子的分离ConA-Sepharose ConA琼脂糖凝胶分离范围：1000-5000，适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sephadex G-25 Medium 葡聚糖凝胶G-25 中分离范围1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sephadex G-25 Medium 葡聚糖凝胶G-25 中分离范围1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sephadex G-25 Fine 葡聚糖凝胶G-25 细分离范围1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sephadex G-25 Fine 葡聚糖凝胶G-25 细分离范围1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离SephadexG-50 Medium 葡聚糖凝胶G-50 中分离范围1500-30000Sephadex G-50 Medium 葡聚糖凝胶G-50 中分离范围1500-30000Sephadex G-75 葡聚糖凝胶G-75 分离范围3000-80000 Sephadex G-75 葡聚糖凝胶G-75 分离范围3000-80000 DEAE Sepharose FF DEAE琼脂糖凝胶FF 分离范围：3000-80,000Sephadex G-100 葡聚糖凝胶G-100 分离范围4000-150000Sephadex G-100 葡聚糖凝胶G-100 分离范围4000-150000Sephadex G-150 葡聚糖凝胶G-150 分离范围5000-300000DEAE Sepharose CI-6B 琼脂糖凝胶CI-6B 分离范围：5000-300,000Sephadex G-150 葡聚糖凝胶G-150 分离范围5000-300000Sephadex G-200 葡聚糖凝胶G-200 分离范围5000-600000Sephadex G-200 葡聚糖凝胶G-200 分离范围5000-600000Sephadex G-200 葡聚糖凝胶G-200 分离范围5000-600000DEAE Sephadex A-25 DEAE葡聚糖凝胶A-25 颗粒大小：40-120μm 分离大小：小蛋白及巨大分子DEAE Sephadex A-25 DEAE葡聚糖凝胶A-25 颗粒大小：40-120μm 分离大小：小蛋白及巨大分子DEAE Sephades A-50 DEAE DEAE葡聚糖凝胶A-50 颗粒大小：40-120μm，分离范围：小蛋白及巨大分子做纯化的人可能经常接触到sephadex，BIO-Gel，sephacryl s-,sepharos e BIo-Gel等几种填料，有时会混淆在一起，看到一个贴子较好的介绍了这些填料的区别，希望对大家有用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
琼脂糖凝胶4B
货号：S8711
规格：100mL/500mL
保存：产品应密封贮存在4℃~25℃（保存溶液为20%乙醇），通风、干燥、清洁的地方。
不能冷冻。
用过的柱子贮存在4℃（20%乙醇）。
保质期：5年。
产品说明：
琼脂糖凝胶4B是用4%浓度琼脂糖制备成的球型颗粒，作为凝胶层析介质使用。
1理化指标
项目指标
基质4%琼脂糖凝胶
分离范围70000~20×106(球蛋白)
形状球型
粒径45~165μm
推荐流速11cm/h*
耐压0.018MPa
pH适用范围4~9
化学稳定性可耐8mol/L尿素、6mol/L盐酸胍
*检测条件：层析柱10mm×300mm*柱床高5cm，25℃，流动相为0.1mol/LNaCl。
2应用
本产品为传统的琼脂糖介质，非特异性吸附低，回收率高，可多次重复使用等特点，用于分子量差异大、对分辨率要求不高的样品的凝胶层析纯化。
3.1装柱
（1）让所有的材料和试剂达到室温。
配制缓冲液。
（2）根据柱子大小取所需量的凝胶，用去离子水清洗掉20%乙醇，用缓冲液（按凝胶：缓冲液=3：1的比例）配成匀浆。
（3）将柱内及柱子底端用水或缓冲液润湿并保持一小段液位，务必使底端无气泡。
（4）用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内，注意勿使产生气泡。
打开柱子出液口，使凝胶在柱内自由沉降，连结好柱子顶端柱头。
（5）打开蠕动泵，让缓冲液用使用时流速的1.33倍的流速流过，使柱床稳定（注意压力不要超过填料最大耐压）。
3.2平衡
让缓冲液以一定流速流过柱子，到流出液电导和pH不变。
建议使用离子强度为0.15或更大的缓冲液，以避免溶质分子和基质之间的任何不需要的离子相互作用。
对于各Sepharose凝胶的推荐流速，请参考推荐流速越低，分离度越高。
3.3上样
（1）样品用平衡液配制，样品一定要离心或过滤后上样。
（2）推荐的样品体积为总床体积的2-5%。
3.4洗脱
用缓冲液洗脱，洗脱中保持流速、缓冲液组成不变。
3.5再生
一般用缓冲液洗到平衡，可再次使用。
在一些应用中，诸如变性蛋白质或脂质的物质在再生过程中洗脱不掉。
这些可以使用下述步骤清除。
出现下面这些情况，是必须需要清洗再生的：
（1）背压增加；
（2）色谱柱顶部的颜色变化；
（3）分辨率降低；
（4）转换接头和凝胶表面之间出现空隙。
如果观察到增加的背压，在开始柱清洁程序之前先检查管路中的各个过滤阀、过滤膜是否被污染；
通过用0.1M NaOH以推荐线性流速洗涤柱子，除去沉淀的蛋白质，非特异性结合的蛋白质和脂蛋白。
3.6注意
在装柱、使用和保存柱子的时候，始终要避免柱子流干气泡进入。
注意事项：
1.上样之前，样品必须经过膜过滤及去除色素，否则杂质及色素会被吸附到填料上，影响填料的正常使用。
2.在使用过程中，避免使用高浓度的强酸强碱，酸和碱的浓度应低于0.15摩尔。
碱会使流速变慢。
3.不同的样品，吸附和洗脱方法不相同，可以根据相关的文献进行。