动物寄生虫病PCR诊断技术
PCR技术在食品药品检测中的应用
PCR技术在食品药品检测中的应用PCR技术（聚合酶链反应技术）是一种基于DNA分子复制的技术。
它可以在短时间内扩增极微小的DNA片段，甚至只有几个分子。
由于这种技术的高灵敏度和高效性，它在食品药品检测中得到广泛应用。
PCR技术可用于检测食品中的病原微生物（例如细菌、病毒和寄生虫等）。
PCR方法可以很快、准确地检测到病原体，并且可以扩增微小的DNA片段以便于检测。
例如，PCR技术可用于检测肉类、海产品和饮用水中的沙门氏菌、大肠杆菌、弓形虫等病原微生物。
PCR技术可用于检测食品中的添加物。
使用PCR技术可以检测到添加到食品中的基因引导的检测系统，这些系统可以为食品中的添加物提供快速、准确和定量的检测。
例如，PCR技术可以用于检测转基因植物中的特定基因，以检测食品中是否含有转基因成分。
此外，PCR技术还可以用于检测合成色素、防腐剂、糖和脂肪等常见的食品添加物。
例如，PCR技术可以用于检测肉类中的瘦肉精等违禁药物残留。
此外，PCR技术还可以用于检测基因工程技术中使用的致癌物质，从而检测食品中是否存在致癌物质的残留。
PCR技术可以用于食品中的品种鉴定。
利用基因引导的高度特异性PCR技术，可以确定食品中的动物或植物物种。
PCR技术的高度特异性和灵敏性使得它可以检测特定物种的DNA序列。
例如，PCR技术可用于检测鱼类、花卉和果蔬中的不同种类。
这种技术提供了一种无损检测方法，有效地检测食品中非法或不合格的品种。
最后，PCR技术是一种灵活而多功能的技术，已经被广泛应用于食品、药品和生物技术领域。
通过检测食品中的病原体、添加物、药物残留和品种鉴定，PCR技术为保障食品安全提供了有效的手段。
在未来，PCR技术还将继续在食品药品检测中发挥重要作用。
多重PCR技术在寄生虫病诊断上的应用及其建立方法的浅析
虫瘿中的虫态通常是幼虫 ， 而这 ３ 种线虫的幼虫形 态非常相 似 ， 以根据 其特征对 它们进行 快速准 确 难 的种类 鉴定 。马 以桂 等［ 根 据 这 ３种 线 虫 的 ｒ Ｊ Ｄ—
ＮＡ—Ｉ 区域 序列 ， Ｓ Ｔ 设计 ３对 特异性 引 物 ， 立 了 建
化酶亚基 Ｉ 因建立 了鉴别诊 断 牛带 绦虫 、 基 亚洲 带 绦虫 、 国 ／Ｅ 美 ： 洲和亚 洲 的猪 带绦虫 的多重 Ｐ Ｒ诊 － Ｉ Ｃ 断方法 ， 增 片 段 分别 为 ８ ７ｐ ６ｂ 、２ ｂ 扩 ２ ｂ 、２ ９ｐ ７０ ｐ和
体 Ｄ Ａ 序列 建 立支 睾 吸虫 和后 睾 吸虫 的二 重 Ｎ
Ｐ Ｒ鉴别 诊断技术 ， Ｃ 扩增 片段 的大小 分 别为 ６２ ｐ １ｂ 和 １５ｂ ， ３７ｐ 敏感 性试 验 表 明该 技 术 的最 低 检 出 量 为 ０７ ｎ 。成 虫 、 蚴 、 卵 的 ＤＮ 都 可 以进 行 ．８ ｇ 尾 虫 Ａ 检 测 ， 以用来鉴 别检测 鱼 中支 睾 吸虫 的囊 蚴或是 可 人体 中感染 的成虫 和虫 卵 。
９ ４ ｐ 该方 法 只需 要 ３ ～５ ｍｇ的样 品 量 就 可 以 ８ｂ ， ０ ０ 进行 检测 ， 不仅适 用 于 绦虫 病 和囊 虫病 的检 测 ， 也 适 用于这 几种病 的分子 流行病 学调查 。
多重 Ｐ Ｒ检 测体系 ， Ｃ 获得 ３ 种线 虫 的特异性 片 段 ，
大小 分别为 ４ ９ ｐ ６ ７ ｐ和 ３ ７ ｐ ９ｂ 、１ｂ ７ｂ 。
滋病患 者 腹 泻 的重 要 病 原 体 。２ ０ ０ ４年 Ｖｅｗｅ ｒ ｉ ｊ
建立 了能够 同时检 测 粪便 中拜 氏微 孢 子虫 和脑 炎
微孢子 虫属 的多 重 实 时 Ｐ Ｒ 诊 断技 术 ， Ｃ 以溶 组 织 内阿米 巴 、 司帕 阿米 巴、 氏贾第 鞭毛虫 、 迪 蓝 小球 隐
分子生物学技术在检验检疫中的应用
分子生物学技术在检验检疫中的应用分子生物学技术是指利用分子生物学原理和技术手段对生物体或其成分进行检测、鉴定和分析的一种高效、快速、准确的方法。
在检验检疫中，分子生物学技术已经成为一种重要的检测方法，可以用于动植物病原检测、检测进口食品中的激素、抗生素、病菌等。
一、动植物病原检测1. PCR技术PCR技术是利用酶的催化作用，在体外选取一段目标DNA序列进行扩增，从而高度敏感、准确、快速地检测细菌、病毒、真菌等。
在动植物病原检测中，PCR技术已经广泛应用，如检测病毒性疾病、细菌性疾病、寄生虫病等。
例如，动植物检疫部门可以利用PCR 技术对入境的活禽、活猪、动物产品进行病原检测，即便在动物体内病菌数量很少的情况下，也可以准确地检测出来。
2. ELISA技术ELISA技术是一种基于免疫学原理的检测方法。
通过特异性抗体和反应物构建酶免疫检测体系，在检测样本中特异性地识别目标物质，从而进行检测。
在动植物病原检测中，ELISA技术通常用于检测免疫抗原、病毒抗原、细菌抗原等。
二、食品中污染物检测PCR技术已经广泛用于检测进口食品中的激素、抗生素、病菌等。
例如，对于进口肉类及其制品，可利用PCR技术检测是否存在激素等非法添加物。
对于进口水果及其制品，可利用PCR技术检测是否存在转基因成分。
这些检测工作不仅可以帮助保证进口食品的安全性，也可以防止国内生产和销售单位过度添加和使用化学物质。
2. 酶免疫技术酶免疫技术也是食品中污染物检测的一种常用方法。
例如，可以利用酶免疫技术对食品中的残留农药、重金属等有害物质进行检测。
可以通过自动吸附荧光免疫法、免疫层析法等方法快速、准确地检测出有害物质的存在情况。
三、总结总之，分子生物学技术在检验检疫中的应用非常广泛，可以快速、准确、高效地检测动植物病原、进口食品中的污染物等，并为保证人民群众的健康和食品安全提供了有力保障。
随着技术的不断发展，分子生物学技术在检验检疫中的应用必定会越来越广泛，也将为保障人民群众的健康和生命做出更大的贡献。
PCR犬瘟检测值解读
PCR犬瘟检测值解读
感染性疾病在宠物中比较常见，由多种病原体如寄生虫，细菌，病毒等引起，且多具有传染性，死亡率也较高。
比如蜱虫传播的巴贝斯虫感染可导致患宠严重贫血，钩端螺旋体感染引起发热黄疸，犬瘟热及细小病毒感染引起发热难治性肠炎等。
猫弓形虫感染更是常见的人宠共患病，家中如有孕妇是要严格避免与患猫或隐形感染的猫接触以免感染胎儿引起畸形，流产等严重后果。
病原体感染性疾病的诊断主要靠病史和实验室检查，其中对病原体的检测是十分重要的环节。
传统的病原检测，比如目前常用的快速检测试剂盒等，多是利用酶联免疫或者免疫层析方法，检测动物血液中病原体特异蛋白抗原的存在，或因感染疾病后血清中因免疫反应而产生的抗体。
这些方法虽然出结果比较快，成本低，但因实验方法本身的限制，不同厂家产品的稳定性、灵敏度和特异性差异较大，也受到产品运输、保存和使用方法的影响，很容易出现假阳性和假阴性结果以及多个厂家检测结果不一的情况。
而目前对传染性疾病更先进，准确性更高，临床价值更大的是对病原体分子水平（DNA或RNA）水平的检测。
也就是今天要介绍的PCR 检测方法，也是目前国外普遍采用的检测方法。
PCR技术，全称为“聚合酶链式反应”。
PCR技术的最大特点，就是能特异性地将微量DNA的数量以几何级数方式扩增。
因此，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR方法加以放大，就可用来做定性的分析及各式各样的应用。
这也是“微量证据”的威力之所在。
PCR
技术的主要发明人穆里斯，也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。
兽医微生物学诊断方法
兽医微生物学诊断方法微生物学是研究微生物的学科，兽医微生物学诊断方法主要是通过检测动物体内的微生物种类和数量，以确定疾病的原因和影响，并指导治疗。
下面将介绍几种常见的兽医微生物学诊断方法。
1.细菌培养和观察细菌培养是一种常用的兽医微生物学诊断方法，可以分离和培养动物体内的细菌。
主要步骤包括样本采集、无菌处理、均匀涂抹在适当的培养基上，然后进行孵育和观察。
观察时可以通过显微镜观察细菌的形态、大小、颜色和运动性，进一步确定病原菌的种类。
2.病原菌的鉴定鉴定病原菌的方法主要有生化试验、免疫学试验和分子生物学方法。
生化试验可以通过对菌落的形态特征、氧需求、代谢产物等进行分析，进行快速初步鉴定。
免疫学试验可以检测血清中的抗体水平，判断动物体内是否存在特定的病原菌。
分子生物学方法如PCR技术可以通过扩增病原菌的DNA片段，再通过测序和序列比对来确定病原菌的种类。
3.抗生素敏感性试验抗生素敏感性试验是评估细菌对不同抗生素的敏感性的方法，可以帮助兽医选择治疗时使用最有效的抗生素。
常见的方法有纸片扩散法、胶杯扩散法和微量稀释法。
这些试验都是通过在培养基上加入一定浓度的抗生素，观察细菌生长的情况来判断细菌对抗生素的敏感性。
4.病毒诊断病毒诊断常用的方法主要有病毒培养、核酸检测和免疫学试验。
病毒培养可以通过将病毒接种到特定的细胞系中，观察细胞的形态变化和细胞内病毒颗粒的形成，进一步确定病毒的存在和种类。
核酸检测可以通过PCR技术扩增病毒的DNA或RNA，再使用特异性探针进行检测。
免疫学试验可以检测动物体内产生的特异性抗体水平，推测是否感染了特定的病毒。
5.真菌和寄生虫诊断真菌和寄生虫的诊断主要是通过显微镜观察和培养方法。
真菌的诊断可以通过直接镜检和培养法，观察菌丝、分生孢子和子实体的形态特征。
寄生虫的诊断可以通过显微镜观察动物组织中的虫体、卵囊、孢子等。
培养法可以适用于一些难以直接检测的寄生虫种类，如血液中的疟原虫。
动物寄生虫病PCR诊断技术样本
动物寄生虫病PCR诊断技术样本动物寄生虫病是指动物体内寄生的一类寄生虫引起的疾病，它们通过寄生在动物体内并侵害宿主的组织、器官和系统，引起一系列不同程度的病理损害。
动物寄生虫病对养殖业、畜牧业和野生动物保护等方面都有重要影响，因此及早、可靠地诊断寄生虫感染是非常重要的。
寄生虫病的诊断一直是医学科学家和兽医师所关注的重要领域，为了提高动物寄生虫病的诊断效率和准确性，PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）技术被广泛应用于寄生虫病的诊断。
PCR技术是一种通过DNA扩增来检测目标DNA序列的技术，它采用了一种在体外复制DNA的酶，聚合酶，通过不断重复的步骤，复制目标DNA 片段从而使其增加几个数量级。
PCR技术的基本原理是将DNA样本与反向引物和正向引物结合，并加入DNA聚合酶、四种碱基和缺失单碱基的dNTP，通过反复温度循环中的DNA变性、引物结合和DNA合成，最终得到数倍于起始数量的目标DNA序列。
PCR技术具有敏感、特异性强、高通量、快速和准确等优点。
在动物寄生虫病诊断中，可以通过设计特异的引物，将寄生虫的DNA从动物组织或体液样本中扩增出来，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或实时荧光PCR等方法进行分析和检测。
对于一些传统的诊断方法难以确诊的情况，如寄生虫病在早期感染、轻微感染和低密度感染等情况下，PCR技术能够提供更为敏感和准确的结论。
根据动物寄生虫病的特点，适宜的PCR样本包括动物体内组织和体液样本。
常见的动物寄生虫病的PCR样本有：1.血液样本：对于一些血吸虫感染、疟原虫感染等疾病，可以通过提取感染动物的全血样本中的寄生虫DNA进行诊断。
2.组织样本：通过对动物组织样本进行PCR扩增，可以检测到一些针对特定寄生虫的DNA片段。
例如，肉眼可见的病变组织、手术获取的寄生虫感染的组织切片等。
3.分泌物样本：对于一些存在寄生虫卵或囊泡排出的动物寄生虫病，如弓形虫感染等，可以通过采集动物的分泌物样本，提取其中的寄生虫DNA进行PCR检测。
动物检疫中实验室检验的主要方法
动物检疫中实验室检验的主要方法动物检疫是通过对动物体内的样本进行实验室检验，以便检测出一些疾病、寄生虫及其他有害生物。
以下是动物检疫中常用的实验室检验方法：1. 细菌培养：用于检测动物体内的细菌感染，主要通过从样本中取得细菌并将其培养在适当的培养基上。
培养后，通过观察细菌的形态特征、生长速率和产生的代谢产物来确定细菌的种类和数量。
2. 病毒分离和鉴定：针对动物患病的病毒感染，可以采用细胞培养、鸡胚培养或小鼠接种等方法，将动物体内的病毒分离出来。
分离后，可以使用免疫荧光、酶联免疫吸附试验（ELISA）或PCR等技术对病毒进行鉴定和定量。
3. 血清学检验：检测动物体内的免疫反应，主要通过血液样本中的血清进行。
血清中的抗体水平可以通过酶联免疫吸附试验、补体结合试验或中和试验等方法进行测定，以确定动物是否感染某种病原体，并评估其免疫状态。
4. 寄生虫检测：用于检测动物体内的寄生虫感染，包括内寄生虫和外寄生虫。
内寄生虫的检测常通过粪便检查，利用显微镜观察寄生虫卵或幼虫的存在和数量。
对于外寄生虫，可以通过沾取动物毛发或皮肤组织样本，用显微镜观察或进行分离培养来检测寄生虫的存在。
5. 分子生物学方法：包括PCR、实时定量PCR和基因测序等技术，可以用于检测动物体内的病原体DNA或RNA。
这些方法在诊断疾病、监测感染水平以及进行病原体基因型鉴定等方面具有高灵敏度和高特异性。
6. 组织学检查：对于一些疑难病例，可以通过组织学检查来确定疾病的诊断。
常用的方法包括组织切片染色和显微镜观察，可以帮助确定动物体内的病理变化和病因。
总之，动物检疫中的实验室检验方法丰富多样，根据需要选择合适的方法进行检测，以确保动物的健康和防控有害生物的传播。
这些检验方法的应用可以帮助监测和预防动物病原体的传播，保护人畜健康和农业生产安全。
猪钩端螺旋体病的临床症状实验室检查和防治措施
猪钩端螺旋体病的临床症状实验室检查和防治措施1. 引言1.1 猪钩端螺旋体病概述猪钩端螺旋体病，又称钩端螺旋体病，是一种由钩端螺旋体寄生虫引起的人畜共患疾病。
该疾病主要通过寄生在猪和其他动物的肠道内，通过粪便排出体外，再通过土壤、水源等途径传播给人类。
钩端螺旋体病具有全球流行的特点，尤其是在发展中国家地区更为普遍。
钩端螺旋体病主要表现为腹痛、腹泻、贫血、营养不良等症状，严重时还会导致消化道出血、肠梗阻等并发症。
临床上常见的病原体包括猪钩端螺旋体属的蛔虫、钩虫等。
确诊钩端螺旋体病需要进行粪便检查、血清学检测等实验室检查，以明确病原体的存在。
钩端螺旋体病的防治措施主要包括加强卫生教育、提高个人卫生意识、定期进行去寄生虫治疗等。
预防该病的关键在于减少接触寄生虫的途径，保持环境卫生，避免食用未经煮熟的生肉等潜在感染源。
针对该病的未来研究方向可以从疫苗研发、快速诊断技术等方面进行探讨，以提高钩端螺旋体病的防治水平。
1.2 猪钩端螺旋体病的传播途径猪钩端螺旋体病的传播途径主要有三种：直接接触感染、食物或水源传播和宿主媒介传播。
直接接触感染是指人体接触感染源，如被感染的猪或其他动物，从而导致疾病传播。
食物或水源传播是指通过摄入被感染的食物或水源而导致疾病传播，特别是在污染严重的地区或不洁净的环境中更容易发生。
宿主媒介传播是指通过介体传播，如病媒生物叮咬或叮咬后吸血而导致疾病传播。
这种传播方式在一些地区的蚊蝇、苍蝇等昆虫中常见，对疾病的传播起着重要作用。
除了以上三种传播途径外，猪钩端螺旋体病还可能通过其他途径传播，需要人们引起重视并采取有效的预防措施。
加强卫生意识，保持环境清洁，避免与患病动物接触，注意食品安全和饮用水的卫生，定期接受体检等都是预防猪钩端螺旋体病传播的重要措施。
通过对传播途径的深入了解和有效的防治措施的实施，可以有效降低猪钩端螺旋体病的感染风险，保障人们的健康和生命安全。
2. 正文2.1 临床症状猪钩端螺旋体病是一种由寄生虫引起的传染病，主要通过摄入寄生虫囊蚴感染。
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动物寄生虫病PCR诊断技术聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）技术是一种既敏感又特异的DNA体外扩增方法，它可将一小段目的DNA扩增上百万倍，其扩增效率使得该方法可检测到单个虫体或仅部分虫体的微量DNA。
通过设计种、株特异的引物，此法只扩增出种、株特异的PCR产物，具有很高的特异性。
而且PCR 技术的操作过程也相对简便快捷，无需对病原进行分离纯化；同时可以克服抗原和抗体持续存在的干扰，直接检测到病原体的DNA，既可用于虫种、株的鉴别，动物寄生虫病的临床诊断，又可用于动物寄生虫病的分子流行病学调查。
随着PCR技术的不断完善与发展，它已广泛应用于分子生物学、生物技术、临床医学等各个领域，具有广泛的应用前景。
一、实验目的要求掌握PCR诊断技术所涉及实验的基本原理，全面熟悉PCR诊断技术的操作过程，其中包括寄生虫DNA 的提取、PCR引物的设计、PCR条件的优化、对目的片断的扩增、琼脂糖凝胶电泳及结果分析、PCR产物的纯化等等。
二、实验仪器和材料（一）寄生虫基因组DNA的提取及纯化1.虫体材料。
单个虫体。
2.器具。
超净工作台、恒温培养箱、TGL-16G高速台式离心机、旋涡振荡器、微量取液器及配套吸头、微量离心管、一次性注射器、微型眼科镊、微型眼科剪刀、玻璃平皿、滴管、有机架等。
3.试剂。
(1) 乙二胺四乙酸（Ethylene diaminetetra acetic acid，EDTA）、十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）、三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸（Tri (Hydroxymethyl) Aminomethane-HCl，Tris-HCl）、氯化钠、蛋白酶K（25µg/µl）、异丙醇（80%）、双蒸水、灭菌超纯水等。
(2) DNA裂解液：500 mM NaCl 70 µl 、100 mM Tris-HCl（pH 8.0）30 µl、50 mM EDTA（pH 8.0）150 µl、10%SDS 30 µl。
(3) Wizard TM DNA Clean-Up 试剂盒或类似的DNA提取试剂盒。
（二）PCR扩增及琼脂糖电泳1．材料。
提纯的虫体DNA。
2．器具。
超净工作台、微型高速台式离心机、微量取液器（2/20/200/1000 µl）、PCR扩增仪、琼脂糖电泳系统、凝胶成像系统、微波炉、4℃/-20℃冰箱、紫外透射仪、微型离心管（200/500/1500 µl）、有机架、一次性手套、透明胶带、量筒（100 ml）、三角瓶（500 ml）等。
3．试剂。
(1) 10×PCR Buffer（无Mg2+）、dNTP（2.5 mM each）、ddH2O 、MgCl2（25 mM）、Primers、Ex Taq 酶（5 U/l）、琼脂糖、EB（10mg/ml）、Tris碱、硼酸（Boric acid）、去离子水、EDTA（0.5 mol/L，pH 8.0）、10×载样缓冲液。
(2) 0.5×TBE缓冲液：准确秤取Tris碱5.4g，硼酸2.75g，充分溶解于800 ml去离子水中，加10ml 0.5 mol/L EDTA（pH8.0），用去离子水定容至1000ml。
（三）PCR扩增产物的纯化1．材料。
PCR扩增产物。
2．器具。
TGL-16G高速台式离心机；三用电热恒温水箱；微量取液器（2/20/200/1000 µl）、琼脂糖电泳系统、微波炉、电子天平、4℃/-20℃冰箱、紫外透射仪、微型离心管（500/1500 µl）、有机架、透明胶带、一次性注射器、量筒（100ml）、三角瓶（500ml）、手术刀、保鲜纸等。
3．试剂。
琼脂糖；0.5×TBE缓冲液；UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒；UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒；异丙醇（80%）等。
三、实验方法、步骤和操作要领(一) 寄生虫基因组DNA的提取及纯化1.实验原理。
应根据研究目的来决定是从单个虫体还是多个虫体提取基因组DNA。
寄生虫虫体的各个部位都可以作为基因组DNA的抽提材料，如果虫体较大的话可取其中部而保存其头部及尾部，以备形态学鉴定以验证其种类。
如果虫体较小（小于1 cm），则应使用整条虫体抽取DNA。
若虫体特别细小（例如幼虫），可用多条虫体来提取DNA。
为了获得高含量、高纯度的DNA，最好使用新鲜材料。
从冻干或50%-70%乙醇保存的寄生虫材料中也可较容易地提取DNA。
寄生虫DNA的抽提方法有多种，不同种类的寄生虫虫体都有其最适合的抽提方法，但各种方法的基本原理都一样，即先用机械的方法将虫体组织破碎，然后加入DNA裂解液和蛋白酶K，充分作用后，虫体组织中的细胞膜破裂，蛋白质变性，将虫体基因组DNA释放到溶液中。
在裂解过程中，虫体细胞碎片及大部分蛋白质会相互缠绕成大型复合物，后者被DNA裂解液中的SDS包盖，通过离心沉淀，这些复合物会从溶液中沉淀下来，变性剂也同时被除去，从而就可从上清中回收虫体基因组DNA溶液。
回收后的虫体基因组DNA液用Wizard TM DNA纯化试剂盒进行纯化。
纯化时，DNA溶液与纯化试剂盒中的清洗树脂混合后，其混合液在通过微型柱时DNA会结合在柱上，而其它杂质会通过微型柱排出；再用80%异丙醇进行冲洗，去除残余杂质。
最后，在微型柱中加入预热的TE缓冲液或超纯水，使结合在微型柱上的DNA充分溶解，通过离心，其洗脱液即为纯化的虫体基因组DNA溶液。
2．实验方法、步骤和操作要领。
(1) 虫体材料的处理(若为新鲜或冻干保存的虫体，则不需要此步骤)。
若虫体较大，用镊子将保存在70%的酒精溶液中的虫体材料取出，剪取其中部，保存其头端或尾端部分。
用双蒸水反复吹打冲洗2次后，再用超纯水反复冲洗2～3次，置于一新的1.5ml的离心管中。
若虫体较小，取一整条虫体经如上洗涤处理。
对于鸡球虫，将保存在2.5%重铬酸钾溶液的卵囊悬液以2000×g离心10min，弃重铬酸钾溶液。
以双蒸水重悬，同法离心洗涤三次后，用20%次氯酸钠处理卵囊20min，2000×g离心沉淀卵囊，用适量饱和盐水重悬卵囊沉淀，1500×g离心10min，上清液加入4倍体积的灭菌双蒸水，3000×g离心10min。
卵囊沉淀再用上述方法重新漂浮、洗涤一次。
用少量灭菌双蒸水重悬卵囊沉淀，然后将其轻轻地加在0.6M无菌蔗糖溶液之上，2000×g离心5min，取上层卵囊加5倍体积的水，3000×g离心10min，沉淀再用无菌蔗糖溶液漂浮一次，即可得纯净的卵囊，可立即用于裂解以提取DNA。
(2) 虫体材料的裂解。
用灭菌且经紫外灯照射过的微型眼科剪刀将虫体组织剪碎，加入280µl的SDS裂解缓冲液，轻轻混匀，再加入20µl（25µg/µl）的蛋白酶K溶液。
对于原虫如鸡球虫、隐孢子虫，将纯化好的卵囊3000rpm/min 离心10min，去掉大部分上清后加入与卵囊体积相同的玻璃珠，漩涡震荡直到有95％卵囊破壁后，即可加入SDS裂解缓冲液及蛋白酶K溶液。
混匀后，放于恒温培养箱中，37℃作用12～48 h，其间不时摇动离心管，使虫体组织裂解充分。
(3) 虫体DNA的抽提和纯化。
首先进行虫体DNA提取，然后按Promega公司试剂盒Wizard TM DNA Clean-Up System使用说明对DNA 进行纯化。
方法如下：①取出于恒温培养箱中作用了约20小时的离心管，旋涡震荡器震荡混匀，10000rpm离心2min，上清即为虫体DNA溶液。
将上清转移至一新的离心管中，加入1ml清洗树脂（按50～500µl悬液/1 ml清洗树脂的比例），旋涡震荡混匀。
②取一支5ml的一次性注射器，去针头，拔出注射器内芯推液筒，接上Wizard TM微型柱。
③将DNA-树脂混合液全部转移到注射器中，用注射器内芯推液筒，慢慢地将DNA-树脂混合液推过微型柱，排出废液。
④将注射器从微型柱上拔出后，拿去注射器内芯推液筒，再将注射器套在微型柱上，向注射器内加入2 ml 柱洗溶液（80%的异丙醇），用注射器内芯推液筒慢慢将洗柱液通过微型柱，以洗涤DNA-树脂样品。
⑤拔去注射器，将微型柱套在洁净的1.5ml离心管上，10000rpm离心20sec，以除去残留的异丙醇。
⑥将微型柱从注射器上转移到一新的离心管上，在柱中央加入30～50µl预热（60～70℃）的超纯水或1×TE缓冲液，静置1 min，10000rpm离心20sec。
离心管内的液体即为DNA溶液。
可将DNA溶液转移至0.5 ml离心管中于-20℃冰箱保存备用。
（二）寄生虫DNA的PCR扩增及琼脂糖电泳1.实验原理。
(1) PCR引物设计。
PCR反应成功扩增的一个关键条件在于寡核甘酸引物的正确设计。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的寡核甘酸片段，使其能有效地与目的片段两端的序列互补。
设计引物时要遵循以下原则：①长度不能太长，也不能太短，一般在18～25个碱基左右；②G+C含量及Tm值：引物的G+C含量以40%～60%为宜。
引物的Tm值是指寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下50%寡核苷酸双链的解链温度。
PCR引物应保持合理的G+C含量。
含有50%G+C 的20个碱基的引物其Tm值约界于56～62℃，这可为有效退火提供足够的温度。
由于G+C间的氢键数较A+T间多，因此，G+C含量高的DNA片段其Tm值也高。
对于短于20个碱基的引物，Tm值可按Tm=4(G+C)+2(A+T) 计算。
而对于较长的引物，Tm值的计算较为复杂。
由于PCR扩增的特异性取决于两条引物与相应模板的结合，因此，反应中退火温度应根据两个Tm值折衷选择。
③碱基的组成尽量随机，尽量不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在；尤其是3’末端不应超过3个连续的G 或C；④引物内部不应有互补序列，否则引物自身会折叠形成发夹结构或引物本身复性。
这样二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
若引物自身连续互补碱基达3个以上，就容易形成发夹结构。
⑤两个引物之间不能互补，尤其应避免3’末端的互补重叠以防止形成引物二聚体。
两个引物不应有4个以上的碱基连续相同或互补；⑥引物的3’末端应与目的片段完全相配。
这对于获得好的扩增结果非常重要。
如果能确定一个保守氨基酸，可将其密码子的前2个碱基作为3’末端。
⑦引物的5’末端可不与目的片段互补，可被修饰而不影响扩增的特异性。
引物的5’末端修饰包括：加酶切位点，标记生物素、荧光、同位素、地高辛等。