细胞间-无菌操作要点
细胞培养操作规范
细胞计数板计数室构造
细胞数/ml=（4个大方格
细胞总数/4）×104×稀
释倍数
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四、细胞培养注意事项
1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射20-30分钟灭菌，以75 %酒 精 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运 转10 分钟后，才开始实验操作。
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细胞培养皿 ▫ 35mm （加液量3ml) ▫ 60mm （加液量5ml) ▫ 100mm（加液量10ml)
150mm (加液量15ml)
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常用培养基：
RPMI1640：
适合许多种细胞，如肿瘤细胞、正常细胞的原代培 养、传代培养等。
尤其适合人白细胞，如H9、HL-60、IM-9和K562等细胞系的培养。
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天，至室温下全溶后再分装，一般用15ml无菌 离心管分装。
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谷氨酰胺：
谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃放置1周可分 解50％，故应单独配制，置于-20℃保存，临 用前加入培养液。
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消化液：
胰蛋白酶溶液： 常用浓度：0.25%。 消化时间：2-10分钟（显微镜下观察）
用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 。
0.5M NaOH煮沸15分钟或浸泡过夜，流水冲洗，0.5M HCl煮沸15分钟或浸泡过夜，流水冲洗，蒸馏水冲洗
15次以上，50℃烤干备用。
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消毒： 消毒前常用的包装：牛皮纸、棉布、铝饭盒包
装 高压蒸汽消毒：121℃ ，维持20-30分钟。
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三：细胞培养方法
细胞培养基本操作技能
细胞培养基本操作技能无菌操作基本技术1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。
每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。
实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。
操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。
2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。
实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。
实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。
3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。
勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。
容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。
对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。
操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。
5. 定期检测下列项目：5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。
5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。
实验用品1. 种类︰1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌制品。
细胞培养无菌操作
细胞实验考核要点一、准备工作1、清点超净台中仪器物品（垃圾桶、饭盒中三种管、橡胶塞、蓝枪头、移液枪、电子枪、50ml离心管、镊子、剪刀、marker笔、打火机、卫生纸、6孔板、平衡50ml内含1ml离心管），合理布置台面。
2、超净台灭菌：酒精喷洒超净台面，紫外照射20min左右。
3、预热：将PBS、10%FBS、胰酶装进PE手套中，37℃预热备用。
二、实际操作1、点燃酒精灯2、从水浴锅中取出预热的三种液体，喷酒精后放入超净台，用卫生纸擦拭瓶壁酒精。
撕开三个封口膜。
瓶口在外焰烧灼烧，拧松三个瓶盖，以备用。
3、手喷酒精后，旋松并取出T25瓶。
在显微镜下观察细胞长势，若细胞密度达到了80%-90%，则可以进行传代。
注意若显微镜没有人用过，需要在载物台附近喷洒酒精后擦拭。
4、将T25拿到超净台里面。
手进入台面内需酒精喷洒消毒（后不赘述）。
打开吸泵。
5、来回灼烧吸泵铁头。
旋开T25瓶，注意灼烧瓶盖，瓶盖扣放。
铁头插上两个蓝枪头，瓶身倾斜吸去瓶中原培养基。
灼烧瓶盖和瓶口后盖盖，不要盖太紧。
6、取1ml移液枪，将T25竖起来，向未生长细胞的侧壁打入5ml PBS冲洗。
盖盖后左右上下稍移动。
将PBS吸出。
关吸泵！7、向瓶中加入500ul胰酶。
稍混合均匀。
放入培养箱中消化2min。
计时。
8、2min内需完成的操作（1）取出一个50ml离心管。
（2）烧套管：镊子在火上过一下，套管盒稍稍开一小口，用镊子取出一个套管，火上来回灼烧，然后放置在离心管架上。
（3）烧弯头吸管：从烧瓶中用镊子取出一个塞子。
弯头吸管盒稍开一小口，确定是不是塞棉花的一头。
镊子稍稍过火灼烧，开一小口，镊子夹出塞棉花一头，放下镊子，拿出吸管。
盒子放回原处。
将塞子塞入弯头吸管中。
手持塞子来回在火上灼烧，完毕后放入套管中。
9、取出培养箱中消化的细胞，显微镜及肉眼观察消化是否合适。
若在显微镜下看到细胞质壁分离呈球形，大部分细胞已经脱离瓶壁游走在视野中，肉眼观察有白色的成片细胞脱落，说明消化完成。
干细胞移植手术中的物品消毒与无菌操作要点
干细胞移植手术中的物品消毒与无菌操作要点干细胞移植手术是一种重要的医疗技术，通过将干细胞移植到患者体内来治疗一系列疾病。
在手术过程中，物品消毒与无菌操作是确保手术成功和患者安全的重要环节。
本文将针对干细胞移植手术中的物品消毒和无菌操作要点进行探讨，并介绍一些常见的操作规范。
一、物品消毒要点1.使用合适的消毒剂：在干细胞移植手术中，常用的消毒剂包括酒精、过氧乙酸、氯己定等。
在选择消毒剂时，应根据具体物品的特性和消毒需求来选择合适的消毒剂。
2.按照规定浓度和时间进行消毒：不同的消毒剂在浓度和时间上的要求有所不同，应根据消毒剂的说明书和相关规定来进行操作。
过短的消毒时间可能无法杀灭病原微生物，而过长的消毒时间可能导致物品受损。
3.确保物品表面完全湿润：在进行物品消毒时，应确保消毒剂能够完全湿润物品表面，以提高消毒效果。
对于有凹陷或难以达到的部位，可以使用喷雾器或刷子等辅助工具来帮助消毒剂渗透并覆盖到所有表面。
4.避免交叉感染：在干细胞移植手术中，要注意避免物品之间的交叉污染。
应为不同物品配备专用的消毒工具，以确保不同物品间的消毒剂不会相互污染。
二、无菌操作要点1.准备无菌器械和物品：在进行干细胞移植手术前，必须准备好无菌器械和物品，如手术刀、手套、手术衣等。
这些物品应在经过专门的灭菌处理后才能使用，以确保手术过程中的无菌环境。
2.正确佩戴手套和手术衣：医护人员在进行干细胞移植手术时，应正确佩戴手套和手术衣，以避免污染手术区域。
手套和手术衣应是无菌的，并要求穿戴人员具备相应的操作技能，确保操作的无菌性。
3.注意手术区域的无菌性：在干细胞移植手术中，手术区域应保持无菌。
在手术开始前，应进行彻底的清洁消毒。
在手术过程中，应避免碰触非无菌物品，如手机、门把手等，并尽量减少手术区域的空气流动，以防止空气中的微生物附着到手术区域。
4.合理运用无菌器械和物品：在干细胞移植手术中，医护人员应使用无菌器械和物品进行操作，以确保手术区域的无菌环境。
细胞培养—无菌操作
细胞培养—无菌操作细胞培养是一种常见的生物技术操作，可以用来研究细胞的生理功能、细胞的增殖和分化以及生物化学反应等。
在进行细胞培养时，无菌操作至关重要，因为细胞非常容易受到外部微生物的污染，从而影响实验结果的准确性。
下面将介绍细胞培养的无菌操作步骤。
1.准备工作在进行细胞培养之前，需要准备好以下工具和试剂：-培养皿：使用符合实验要求的培养皿，常见的有培养瓶、细胞培养板等。
-培养基：根据实验需要选择适当的培养基，例如DMEM、RPMI-1640等。
-无菌操作台：无菌操作台提供一个无菌的工作环境，可以防止微生物的污染。
-显微镜：显微镜可以用来观察细胞的形态和增殖情况。
-移液器和吸头：用于移液操作，需要保持无菌。
-无菌培养液：例如乙醇、连苯三氯和消毒液等。
-消毒器材：例如灭菌器、高压蒸汽灭菌器和紫外线灭菌器等。
2.准备培养皿和培养基将培养皿放入无菌操作台的工作区域内，通过高压蒸汽灭菌器或紫外线灭菌器对培养皿进行灭菌处理，确保其表面无菌。
然后用无菌移液器加入适量的培养基到培养皿中，根据实验需要选择适当的培养基。
3.细胞接种将需要进行细胞培养的细胞按照预定的密度接种到培养皿中。
在进行细胞接种前，需要将细胞培养液中的细胞进行离心，去掉上清液，然后用适量的培养基将细胞悬浮液稀释到适当的细胞密度。
在接种细胞时需要注意，避免将培养皿的口部接触到任何表面，以免引入微生物污染。
4.细胞培养将接种好的细胞培养皿放入细胞培养箱或培养箱中进行培养，保持适当的温度和湿度。
通常将细胞培养箱设置在37摄氏度，5%二氧化碳的环境中，以模拟人体体内的条件。
在细胞培养过程中需要定期检查细胞的状态，观察细胞的形态和增殖情况。
5.细胞培养的无菌操作在培养细胞的整个过程中，需要保持无菌操作。
在进行任何操作之前，需要在无菌操作台上烧毁以杀死细菌和真菌。
接种细胞、更换培养基、观察细胞等一系列操作都需要在无菌操作台上进行，以减少细胞受到外部污染的机会。
个人整理总结神经细胞和胚胎细胞培养操作注意事项及相关protocols
Drosophila S2 cell culture protocols陈文锋一、基本注意事项（一）无菌操作培养所需一切物品、液体应无菌。
操作前先列出所需物品，培养液须室温平衡，所有物品准备好后再操作，避免往复拿取用品。
有关数据的计算要事先做好。
（二）操作区消毒进入细胞室内换穿里面的拖鞋。
无菌培养室每周用0.2%的新洁而灭（苯扎溴铵）拖地面1次（拖布专用），紫外照射15-30min。
超净工作台使用前后需用75%乙醇擦洗，然后进行紫外灯照射15~30min进行消毒，操作时打开风机。
紫外照射期间不能放置培养细胞和培养液等。
所有进入操作区域的物品需经75%乙醇擦拭消毒。
工作台面均需经75%乙醇擦拭消毒，特别是液体溢出时，需立即擦拭。
移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%乙醇擦洗后置于台内同时紫外照射消毒。
废液缸、污物盒每次做完实验马上清理倒掉。
（三）洗手和着装乳胶手套75%乙醇喷洒消毒。
白大褂定期高温高压灭菌。
（四）火焰消毒培养或其他无菌操作时，首先点燃酒精灯。
安装管帽、打开或封闭瓶口等，都需要在火焰近处。
二、细胞培养条件S2细胞培养在Schneider's Drosophila Medium + 10% FBS的培养基中+100U/ml青霉素+100ug/ml链霉素，25℃无需要CO2培养。
五、FBS分装及灭活分装：初次买500ml血清，4℃完全融化（过夜差不多20h，时间比较长），期间间隔混匀。
无菌操作分装于50ml离心管（直接倒，但是注意不要让血清瓶和离心管接触）。
同时分装几管15ml的（15ml不好倒就用枪或移液管操作）。
（-80℃保存）再次分装：等15ml的分装血清用完。
把50ml的血清取出，4℃完全融化，期间间隔混匀。
无菌操作分装于15ml离心管。
灭活：把装有灭菌水的烧杯置于56℃水浴锅中，等水浴锅温度恒定，把装有血清的15ml离心管放于烧杯中，水位应超过血清的位置。
灭活30 min，每隔10min混匀一次。
细胞培养—无菌操作
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生物安全柜
• 生物安全柜一般是做致病菌，霉菌，酵母菌，病毒来用，操作区域 是负压，简单说是往上处抽风的，当然致病菌也不是直接抽出排到 室外，是过滤在生物安全柜的顶部漏器上，从排风量上可以分为， 50%外排型，75% 以及100%外排型。在生物安全柜内所形成的几乎 没有微生物的环境中，尽量避免使用明火，酒精灯的火焰可能会影 响室内的气流平衡。
• 超净台外部，操作口处用75%酒精棉球擦拭 • 消毒结束后，拉下超净台玻璃门，打开超净台紫外30min • 离开培养室时，注意关闭照明灯，打开紫外灯
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污染及其防治处理
• 化学污染物（培养基、血清和水中的杂质、内毒素、增塑剂和去污剂） • 生物污染物（细菌、霉菌、酵母、病毒、支原体以及其他细胞系的交
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消毒
• 75%酒精消毒原理
• 酒精之所以能消毒是因为酒精能够吸收细菌蛋白的水分，使其脱水变 性凝固，从而达到杀灭细菌的目的。如果使用高浓度酒精，对细菌蛋 白脱水过于迅速，使细菌表面蛋白质首先变性凝固，形成了一层坚固 的包膜，酒精反而不能很好地渗入细菌内部，以致影响其杀菌能力。 75%的酒精与细菌的渗透压相近，可以在细菌表面蛋白未变性前逐渐不 断地向菌体内部渗入，使细菌所有蛋白脱水、变性凝固，最终杀死细 菌，酒精浓度低于75%时，由于渗透性降低，也会影响杀菌能力。
• B级：指无菌配制和灌装等高风险操作A级洁净区所处的背景区域。
• C级和D级：指无菌药品生产过程中重要程度较低操作步骤的洁净区。
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实验器具和材料的准备
• 在开始实验前要制定好实验计划和操作计划，有关数据的计算要事先 做好。根据实验要求，准备各种所需耗材物品及试剂，清点无误后将 其放置在操作场所进行消毒处理。
细胞间管理规范
细胞间管理规范一、背景介绍细胞间管理是指在细胞生物学研究中，对细胞的培养、处理和操作过程中所需遵守的一系列规范和标准。
细胞间管理的目的是保证实验结果的准确性和可重复性，同时确保实验操作过程中对细胞的安全和健康不造成任何伤害。
本文将详细介绍细胞间管理的规范要求。
二、细胞培养环境1. 实验室环境- 实验室应保持清洁、整洁，无灰尘和杂物。
- 实验室应保持适宜的温度和湿度，以维持细胞生长所需的环境条件。
- 实验室应定期消毒，以防止细菌和病毒的污染。
2. 培养基和培养器具- 培养基应采用无菌技术制备，确保无任何细菌和病毒的污染。
- 培养器具（培养皿、离心管等）应经过高温高压灭菌处理，以确保无菌状态。
三、细胞操作规范1. 细胞的传代- 细胞的传代应根据实验需要和细胞生长情况进行，避免细胞过度密集和老化。
- 细胞传代时应注意使用无菌操作，以防止细菌和病毒的污染。
2. 细胞的处理和处理液- 细胞处理液的配制应使用高纯度的试剂，并根据实验需要进行无菌过滤。
- 细胞的处理操作应使用无菌技术，避免细菌和病毒的污染。
3. 细胞的冻存和解冻- 细胞冻存前应进行细胞数目计数和细胞活力检测，确保冻存的细胞质量。
- 细胞解冻时应使用快速解冻法，并立即将细胞转移到预先准备好的培养基中。
四、细胞安全管理1. 细胞的标识和文档管理- 细胞应进行标识，包括细胞株的名称、来源、传代数等信息，以便于追溯和管理。
- 细胞相关的文档（如实验记录、细胞存储记录等）应进行规范的管理和保存。
2. 细胞的安全操作- 细胞操作时应佩戴适当的防护用具，如实验手套、口罩等，以防止细胞对实验人员的伤害。
- 细胞操作后应进行彻底的清洁和消毒，以防止细胞的交叉污染。
3. 细胞废弃物处理- 细胞废弃物应按照规定程序进行处理，避免对环境和他人造成污染和危害。
五、细胞质量控制1. 细胞的鉴定和检测- 细胞应定期进行鉴定和检测，以确保细胞的纯度和一致性。
- 细胞的鉴定和检测方法应符合相关的标准和规范。
无菌操作规范流程(完整版)
无菌操作规范流程（1）一、开始实验前15分钟，在更衣间更换细胞房专用拖鞋进入细胞房，打开生物安全柜（超净台）的紫外。
在实验室准备间将细胞房风机打开，并将细胞房外空调视气温选择是否打开并调整至合适温度。
二、进入细胞房时，实验人员首先在更衣间更换无菌服，换好细胞房专用拖鞋，戴好口罩、手套。
帽子须遮盖全部头发、口罩须盖住口鼻，并认真洗手。
细胞房内如果有不洁的口罩、手套（包括手套袋）、鞋套，应及时扔进垃圾桶。
实验白大褂应整齐挂入衣橱，鞋子于鞋柜摆放整齐，保持更衣间干净整洁。
三、从更衣间进到风淋室再进到细胞房有两道门，进到风淋室后先打开分淋并关门，经过分淋才能打开进细胞房的门。
两扇门不能同时打开。
四、关掉所有紫外灯，将废液桶放到每个实验台备用，给垃圾桶套上垃圾袋，并从冰箱中取出当天需要用到的培养基及相关试剂预热到室温。
五、实验中，手套袖边要用酒精棉球充分消毒，以避免人为带进污染物。
培养基等外来物表面要用酒精棉球擦干净再放入超净台。
培养瓶等瓶口需在火边消毒后再拧开或旋紧。
无菌操作规范流程（2）一、每个超净台用完后，应立即取出废液桶将废液倒入水池，倒入少许新洁尔灭消毒液预处理并洗净，然后放到指定位置。
用75%乙醇擦干净超净台台面，将移液枪（100ul、200ul、10ul、2ul）调到最大量程并整齐摆放于实验台。
整理超净台和实验台台面，使之看起来干净整齐。
二、离开细胞房时注意关掉超净台、显微镜、离心机，每个房间的照明灯以及空调，处理不洁耗材等杂物，换回白大褂实验服和外用鞋。
关闭细胞房的空气净化风机。
三、细胞房内需要准备充足的75%酒精棉球、新洁尔灭消毒液、无水酒精、10ml 移液管、25ml移液管、六孔板、中型培养瓶、小型培养瓶、吸管、50ml离心管、15ml离心管、培养皿、1.5ml离心管、枪头（1000ul、200ul、10ul）、口罩、手套、垃圾袋等耗材（注意外包装完整）。
尽量避免实验期间进出无菌室。
细胞培养无菌操作技术
❖ 塑料制品现多采用无毒并已特殊处理的包 装，打开包装即可用，多为一次性物品
❖ 清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗， 浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃ 清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁 液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏 水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备 用。
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细胞间内操作
（用酒精消毒代替酒精灯灭菌的工作方案）
实验结束整理灭菌
环境清洁：进入细胞间前半小时，超净工作台及细胞间紫外灭菌。
试剂物品进入细胞间需酒精充分消毒。
无菌溶液进入细胞间前检查是否有沉淀、絮状物或变色，如有以上情况，禁止进入细胞间。
无菌服穿戴：隔离衣、帽子、手套、口罩穿戴整齐，(帽子遮盖全部头发、手套需套住袖口)。
物品进入超净台：试剂、培养瓶及废液缸需酒精消毒
培养箱：
1.开门前，在手套及培养箱门上喷酒精；
2.缩短开门时间；减少开门次数
3.开门时细胞间内减少走动，实验室的门应为关闭状态
超净台内(不使用酒精灯，但需严格消毒)：
1.操作区域用酒精擦拭，保持整洁、宽敞，并打开超净台风扇运转通风
2.所有试剂、耗材进入前必须喷洒酒精，并充分擦拭，避免出现死角
10.取用无菌物品须用无菌持物钳（若持物钳污染，酒精棉球消毒后使用）
11.废液缸应放在远离操作区的最右侧靠外位置(弃废液动作轻柔，棉球擦拭载物台
2.观察完毕后，关闭显微镜
分类整理用品
1.试剂开封使用完，盖好盖子，封口膜封口
2.废液缸倾倒
3.隔离衣展开放置
离开前检查：
1.超净台是否关闭、台面是否恢复原样
2.显微镜、水浴锅是否关闭
3.恒温箱门是否关紧
3.无菌持物钳等工具在使用前紫外灭菌
4.无菌物品一经取出，即使未用，也不可放回。
5.手及袖口不能在无菌容器上方经过。
6.枪头盒随用随关
7.无菌容器盖的内面朝上放置于台面或拿于手中
8.任何液体（特别是培养基）洒落在器械或工作台上，应及时用酒精棉擦拭；瓶口外侧有试剂滴落，也应用酒精棉擦拭干净
9.超净台内不宜摆放过多物品，防止影响气流