发酵产氢细菌分离培养的厌氧实验操作技术
厌氧微生物的分离与培养
厌氧微生物的分离与培养一、实验目的熟练掌握Hungate厌氧操作技能，了解和掌握厌氧微生物的培养基配制，并进行分离纯化。
二、实验用具装有分压表的氮气钢瓶，氢气钢瓶，调压变压器，铜柱和铜柱固定架，高压灭菌锅，厌氧管（15ml）,厌氧瓶(50ml)，异丁烯橡胶塞、电炉、圆底烧瓶（500ml、1000ml）、各种规格的定量注射器（1ml、2ml，5ml），18#针头，酒精灯，酒精棉等。
三、实验操作(一)、高纯无氧N2的制备1、接通电源：把输出电压缓缓从0伏分级升到50～90伏之间（调电压的过程持续大约2-3s就可以了）。
大约20分钟后，铜柱温度能达到350℃左右（输出电压禁止长时间超过90V以上，否则会导致铜玻璃柱变形直至破裂，甚至发生安全事故）。
2、待铜柱温度升至350℃左右时，加热套触摸起来比较烫，开启氢气钢瓶并形成气流，使铜柱内的铜丝还原（反应速率很快，几秒钟见效，还原与否可以从铜丝颜色的变化看到，同时柱内会产生水蒸气，氧化铜与氢气反应所致；通氢气的时候最好打开窗户，一定熄灭操作台边上所有明火，包括酒精灯和电炉）。
3、待铜丝被氢气还原呈现纯紫铜铮亮色，同时把里面的水蒸气也排出完全后，关闭氢气钢瓶，压力表指针降为零；打开氮气钢瓶，气流大小以把针头对准操作者手背5cm距离明显感觉到气流为宜，并随时注意气流是否足够。
4、使用完毕后，先关紧氮气钢瓶，使压力表的指示针回至零位，接着关闭电源，使调压变压器调节指示回至0伏处。
(二)、无氧无菌水的配制1.将500ml一定浓度的NaCl水溶液（防止稀释时细胞涨破）沿玻璃棒倒入固定在铁架台上的1000ml圆底烧瓶中（选择合适的圆底烧瓶，水不可太满，否则水沸腾时容易溅出），最好放入几个防爆玻璃珠。
向500ml水中加入终浓度为0.001‰的刃天青（resazurin），即加入0.5ml 的1‰刃天青母液（W/V），并加入0.25g半胱氨酸（L-Cysteine）(终浓度0.5‰)。
1株高温型厌氧产氢细菌的分离与鉴定
（ 宁省 农 业 科 学 院 微 生 物 工 程 中心 ， 阳 １０ ６ ） 辽 沈 １ １ １ 摘 要 ： 用 平 面夹 层 和 平 板 培 养 瓶厌 氧 法 从 油 田区 的岩 石 中分 离 到 ８株 细 菌 ， 气 体组 成及 产 氢 能 力 检 测 ， 现 其 中 ２株 细 菌 具 利 经 发 有 产 氢 能力 。 ６ ￣高 温条 件下 ， 株 Ｚ １的氢 转 化 率 最 高 ， １ ｍ ｌＨ ・ ｌ 葡 萄糖 。 菌 为 革 兰 氏 阴 性 、 菌 、 芽 孢 、 鞭 在 ０Ｃ 菌 Ｘ一 为 ． ｏ ｍｏ。 ８ 。 该 杆 有 无 毛 ， 体 大 小 为 （ － — ． ） ｍｘ ２ ８ ｂ 菌 落 特 征 表 现 为 圆形 、 白色 、 面 光 滑 、 透 明 ： 理 生 化 试 验 结 果 表 明 ， 菌 ０３ ０４ ｔ （－ ）ｔ ５ ５ｚ ｍ； 乳 表 不 生 明胶 液 化 、 硝酸盐还原 、 檬 酸盐利用 、 萄糖为 阳性 ， 化酶 、 粉水解 、— 柠 葡 氧 淀 Ｖ Ｐ反 应 为 阴 性 ， 步 鉴 定 为 短 芽 孢 杆 菌 属 （ ｒｖｂｃ ｌ ） 经 初 Ｂｅｉａｉｕ 。 ｌｓ １ Ｓ ｒ Ｎ Ｃ 扩 增 及 测 序 结 果 表 明 ， 菌 序 列 与 Ｂｅｉａｉｕ ｏｓ ｌ ｓ ６ Ｄ Ａ Ｐ Ｒ 该 ｒｖ ｅ ｌ ｂｒ ｅ ｎｉ ｂ ｌｓ ｔ ｅ ｓ的序 列 相 似 性 达 １０ 进 一 步 确 定 该 菌 为 波 茨 坦 短 ０ ％．
Ｗ ＡＮＧ Ｎａ ，ＸＩ ｕ ．Ｚ ＡＯ Ｊ ｎ ＨＡＯ ｒｉｇ ｎ ，Ｗ ＡＮＧ ｎ ，Ｃ Ｈｏ ｇ ＨＥ ｎ ＧＯＮＧ ，ＹＡＮＧ Ｔ ｏ Ｎ Ｘｕ ， Ｎａ ａ术
厌氧发酵实验
厌氧发酵实验厌氧发酵实验是一种常用于研究微生物在无氧条件下的生长和代谢过程的实验方法。
通过控制实验条件，可以模拟厌氧环境中的微生物代谢，观察其产物生成和生物过程的变化。
本文将介绍厌氧发酵实验的步骤和相关注意事项。
一、实验材料和设备1. 实验材料：- 不同种类的厌氧菌培养液；- 用于菌液接种的培养基；- 发酵产物分析所需的试剂和设备。
2. 实验设备：- 厌氧培养罐；- 恒温恒湿箱；- 离心机；- pH计；- 显微镜等。
二、实验步骤1. 准备工作：- 清洗所有使用的玻璃器皿和设备，使其干净无菌；- 准备好所需的培养基和培养液。
2. 厌氧培养罐的准备：- 将培养基倒入培养罐中，密封好；- 使用高压蒸汽灭菌器对培养罐进行高温高压灭菌，确保培养罐内无菌。
3. 厌氧发酵实验的进行：- 取出灭菌的培养罐，用无菌培养针将厌氧菌接种到培养基中；- 将培养罐放入恒温恒湿箱中，保持适宜的温度和湿度；- 每隔一段时间，取出培养罐进行样品采集，进行产物分析。
4. 产物分析：- 将采集到的样品进行离心分离微生物细胞和发酵产物；- 对分离得到的细胞和发酵产物进行相应的化学检测和分析；- 使用显微镜观察细胞的形态和数量变化。
三、注意事项1. 实验条件的控制：- 在实验过程中，严格控制实验条件，如温度、湿度等；- 厌氧培养罐的密封性很重要，确保无氧条件的维持。
2. 操作安全：- 在进行实验操作时，需戴好实验手套和口罩，注意个人安全；- 对于产生的废液和废物，应按照规定的程序进行处理。
3. 数据记录和分析：- 在实验过程中，要准确记录各项数据和实验结果；- 对实验结果进行合理的数据分析，得出相应的结论。
结论厌氧发酵实验是一种重要的实验方法，通过该实验可以研究微生物的生长和代谢过程。
在实验过程中，需要严格控制实验条件，确保实验结果的准确性。
实验结果的分析和结论对于深入理解微生物的代谢机制具有重要的意义。
通过进一步的研究和应用，厌氧发酵实验可以在工业生产和环境治理等领域发挥重要作用。
厌氧发酵工艺流程
厌氧发酵工艺流程厌氧发酵是一种在缺氧条件下进行的生物反应过程，通常用于生物质、有机废物和废水的处理，以及生物氢气和甲烷的产生。
在这篇文章中，我们将详细介绍厌氧发酵工艺流程，包括工艺原理、操作步骤和应用范围。
1. 工艺原理厌氧发酵是一种微生物代谢过程，通过这种过程，有机物质在缺氧条件下被微生物分解产生气体和有机酸。
这种过程一般分为四个阶段：水解、酸化、醇化和甲烷发酵。
在水解阶段，有机物质被水解成小分子有机物；在酸化阶段，这些小分子有机物被酸化成醋酸、丙酸等有机酸；在醇化阶段，有机酸被进一步分解成醇和二氧化碳；最后，在甲烷发酵阶段，醇和二氧化碳被甲烷菌发酵产生甲烷。
2. 操作步骤厌氧发酵工艺通常包括反应器、搅拌系统、温控系统、气体收集系统等设备。
操作步骤如下：（1）原料处理：将有机废物经过粉碎、均质等处理，使其适合于微生物的生长和代谢。
（2）投料：将处理好的有机废物投入反应器中，注意保持一定的固液比和适宜的pH值。
（3）密封：密封反应器，排除其中的氧气，创造缺氧条件。
（4）发酵：在适宜的温度和pH条件下，微生物开始对有机废物进行厌氧发酵，产生甲烷等气体。
（5）气体收集：收集产生的甲烷等气体，用于能源生产或其他用途。
（6）产物处理：处理反应器中的固体产物，如沉淀物或渣滓，可以进行堆肥、焚烧等处理。
3. 应用范围厌氧发酵工艺在生物质能源生产、有机废物处理和废水处理等领域有着广泛的应用。
在生物质能源生产中，厌氧发酵可以用于生产生物氢气和甲烷，这些气体可以作为清洁能源使用。
在有机废物处理和废水处理中，厌氧发酵可以将有机废物和废水中的有机物质转化为甲烷等气体，减少污染物的排放。
总之，厌氧发酵工艺是一种重要的生物技术，具有广阔的应用前景。
通过对厌氧发酵工艺流程的研究和优化，可以更好地实现有机废物的资源化利用和环境保护。
希望本文能够对厌氧发酵工艺有所了解，并为相关领域的研究和应用提供一定的参考价值。
实验室厌氧发酵方案
实验室厌氧发酵方案一、引言厌氧发酵是一种在缺氧条件下进行的生物反应过程，通过微生物的代谢产生有机酸、气体和其他有用物质。
在实验室中，厌氧发酵方案广泛应用于生物能源生产、废弃物处理和生物材料合成等领域。
本文将介绍一种常见的实验室厌氧发酵方案，并探讨其应用和优化。
二、实验室厌氧发酵方案的基本步骤1. 菌种的选择和培养在实验室厌氧发酵中，菌种的选择非常重要。
常用的菌种包括产氢菌、产甲烷菌等。
菌种的培养需要在无氧条件下进行，可以使用密闭培养瓶或无氧罐来提供无氧环境。
培养基的选择应根据菌种的特性和所需产物来确定。
2. 发酵基质的准备和处理发酵基质的选择和处理对于实验室厌氧发酵方案的成功至关重要。
常见的发酵基质包括废弃物、植物生物质和纯化有机物等。
在使用废弃物作为基质时，需要对其进行预处理，如固液分离、调整酸碱度和去除抑制物质等。
3. 实验室发酵装置的设计和操作实验室厌氧发酵装置的设计和操作直接影响发酵的效果和产物的质量。
常见的实验室发酵装置包括密闭发酵罐、发酵袋和连续流动反应器等。
装置的设计应考虑气体的收集和排放、温度的控制和搅拌等因素。
4. 发酵过程的监测和控制实验室厌氧发酵过程中，对发酵过程的监测和控制是必不可少的。
常用的监测指标包括产气量、产物浓度和pH值等。
可以使用气体分析仪、液相色谱仪和pH计等仪器进行监测。
根据监测结果，可以进行相应的控制措施，如调整温度、添加营养物质等。
三、实验室厌氧发酵方案的应用1. 生物能源生产实验室厌氧发酵方案广泛应用于生物能源生产领域。
通过利用产氢菌和产甲烷菌等微生物的代谢产物，可以生产可再生能源，如氢气和甲烷。
这些能源具有高能量密度和低碳排放的特点，对于替代传统化石能源具有重要意义。
2. 废弃物处理实验室厌氧发酵方案可以用于废弃物的处理和资源化利用。
废弃物中含有丰富的有机物质，通过厌氧发酵可以将其转化为有用的产物，如甲烷和有机肥料。
这不仅可以减少废弃物的排放，还可以实现废弃物的资源化利用。
一株厌氧发酵菌Biolog鉴定及利用不同碳源对产氢的影响
第21卷 第1期环境研究与监测2008年01月科研报告(11～13)一株厌氧发酵菌Biolog鉴定及利用不同碳源对产氢的影响刘婧1,2(1.重庆大学城市建设与环境工程学院,重庆 400045; 2.三峡库区生态环境教育部重点实验室,重庆 400045)摘要:从湖沼中分离出一株厌氧发酵产氢菌,利用Biolog微生物自动鉴定系统对其进行复核鉴定.鉴定结果表明:此菌株为Enterobacte r aerogenes,可能性(PROB)为99%,相似度(SIM)值为0.79,DIS值小于5.0,三个重要参数和数据库匹配良好,准确度高.该菌株为兼性厌氧菌,丙酸型发酵.利用5种不同底物测定其产氢能力,以蔗糖为底物时产氢累计总量最高达到114mL,蛋白质类不适合做发酵产氢的底物.关键词:发酵细菌;生物产氢;Biolog中图分类号:X382 文献标识码:A 文章编号:(G)08060(2008)0120011203 能源短缺、环境污染是未来人类所面临的两大难题,而改变原有的能源结构则是实施可持续发展的有效手段.研究开发环保、高效的产氢技术一直是国内外科研人员努力追求的方向,其中生物制氢[1,2]由于其使用的原料低廉,生产过程清洁、节能且不消耗矿物资源,正越来越受到人们的关注,也是目前研究进展最快并很有希望进行规模化生产的一种制氢方法.随着科学技术的发展,微生物鉴定领域和自动化分析技术有很大进步.实验目前分离培养的产氢菌株有较高的氢气产量,为了更进一步研究菌株的属性以及对碳源的利用状况和产氢的关系.实验利用Biolog全自动微生物分析鉴定仪[3]对发酵菌进行数据分析鉴定[4],和传统鉴定方法相比,自动鉴定系统过程快捷,数据可靠,数据库包含菌种广泛.对更好的研究纯菌种不同碳源代谢活性,代谢功能有重要意义,选用的5种碳源从定量角度分析菌株利用不同底物的产氢能力,为研究混合菌的代谢和产氢提供理论依据.1 实验材料和方法1.1 菌种来源本实验所用菌株为实验室内分离培养的一种厌收稿日期5223基金项目国家自然科学基金重点课题(3)作者简介刘婧,在读硕士研究方向城市建设与环境工程氧发酵产氢细菌,从环境中通过富集培养分离得到,将分离得到的单菌落扩大后用于各试验.1.2 主要仪器厌氧工作站;美国Biolog微生物自动鉴定仪;浊度仪;722型紫外分光光度计;SL12P HS23E型p H计;超净工作台;数显水浴锅等.1.3 培养基菌株鉴定培养基B UA+B:①称取25.85g B UA琼脂培养基,加入475mL蒸馏水在烧杯中,在氮气吹拂下缓慢加热并搅拌至全部溶解.②冷却后调p H值至7.2±0.1(25℃).121℃灭菌15 min,保持厌氧环境,冷却至45～50℃.③加入50 mL新鲜的脱脂羊血,摇匀,厌氧环境中倒平板;产氢发酵细菌基础培养基去掉葡萄糖碳源,由酵母膏, NaCl及微量元素溶液和维生素液组成[5].1.4 Biolog技术原理用Biolog技术进行碳源代谢分析,微生物在利用95种碳源过程中产生自由电子,与四唑盐染料发生了还原显色反应,颜色的深浅反应微生物对碳源的利用程度[6].微生物的种类和固有属性决定了对不同碳源利用程度不同,从而在鉴定板上形成该微生物特征性的“指纹”[7,8],通过读数仪来读取颜色变化,计算机通过与数据库比较,将目标微生物与数据库中的特征数据进行比对,与分析的微生物进行最大限度的匹配:200120.:021*********.:.:..1.5 实验方法1.5.1 Biolog鉴定方法碳源代谢实验按照Biolog微生物鉴定流程进行.先进行革兰氏染色和氧化酶实验,可以确定出菌株类型,按照革兰氏阴性菌Biolog鉴定参数(见表1)选择合适的培养条件.Biolog鉴定方法:将厌氧发酵菌分离纯化,在对数生长期进行平板划线,得到培养良好的单菌落,接种到BU A+B培养平板上,37℃在厌氧工作站培养24h,用无菌牙签挑取少量新鲜菌落,制成菌悬液,和标准菌悬液进行对照,误差范围小于±2,用八道移液枪进行Biolog GN板接种,每孔接种菌悬液150μL,加盖30℃培养24h,打开微孔板盖放入结果自动读数仪,显色结果与Bi2 olog数据库进行比对分析,颜色变为深紫色即为相似性在80%以上,表明对此种碳源利用很好.表1 革兰氏阴性菌Bio log系统鉴定参数Para meter s N EN T EN T(厌氧)扩大培养基BU G+B BUA+B温度/℃3037接种液G N/GP2IF GN/GP2IF+T浊度/%5261浊度标准类型GN2NEN T G N2ENT 鉴定板G N2G N2每孔菌悬液量/μL150150培养时间/h4～6,16～244-6,16～241.5.2 产氢实验方法产氢培养基分别装在体积为150mL的实验反应器中,用橡皮塞封闭,用固体石蜡密封,橡皮塞上扎入排气管和取样管,气体用排水法收集,并吸收CO2.所有器皿及培养基等均在121℃下高压灭菌20min后使用,所有操作均在无菌条件下进行,在37℃条件下培养,实验接入的菌种量总菌数为6×108个,接种量为10%,每隔12h测定一次产气量.2 实验结果与分析2.1 发酵细菌的分离纯化从湖沼环境中取出污泥悬浮液,分别做不同稀释度的菌悬液进行平板涂布,做平行实验,在厌氧工作站培养4d后,取生长良好,有40～80之间的菌落平板,挑取不同类型菌落再次接种,分离纯化数次后,镜检为纯菌株后进行各项产氢实验.菌落为乳白色圆形湿润菌,菌落表面光滑,边缘整齐,挑取时呈黏丝状,镜检为杆状菌.2.2 Biolog菌种鉴定发酵细菌进行革兰氏染色实验确定为阴性杆菌,不产芽孢.氧化酶实验为阴性并形成较大菌落,则为G N2EN T.菌株在培养4～6h已经有部分碳源发生显色反应,一般16～24h的结果比较稳定.表2是厌氧培养24h对发酵细菌进行Biolog鉴定后计算机读取数据、按照可能性大小给出的10个I D的名称.表2 菌种鉴定结果序号Species PROB SIM DIS T YPE 1Entero bacter aerogenes990.79 3.36G N-EN T 2Se rratia ficaria30.02 6.91G N-EN T 3Ser ratia r ubidaea00.008.25G N-EN T 4Ente ro bacter a sburiae00.009.53G N-EN T 5Kle bsiella pneumoniae ss p neumoniae00.0010.30G N-EN T 6Enterobacter cloacae00.0010.46G N-EN T 7Ser ratia liquef aciens/grime sii00.0010.91G N-EN T 8Pantoea agglomerans00.0010.97G N-EN T 9Ente robacter aeroge nes(Kle b.mobilis)00.0011.10G N-EN T 10Raoultella pla nticola00.0011.11G N-EN T 通过以上数据可以看到:SIM值=0.79>0. 75;DIS值=3.36<5.0;PROB为99%.系统得到的三个重要参数比较理想,与数据库匹配良好,SIM 值越接近,说明鉴定结果的可靠性更高在I D 地址栏显示出一个最佳匹配名称,属名2 ,种名,是一株产气肠杆菌,其他种在名称栏里列出作为参考.菌种鉴定出阳性反应64种,阴性反应25种,边界反应7种.阳性反应表示目标菌株和数据库的匹配程度≥80%,阴性反应表示样品菌与数据库匹配程度≤%,边界反应多于5个为鉴定结果不好,实验中为,并且第一个和第二个ID的DIS值大于,各种数据指标都表21环境研究与监测第21卷1.00.:Ent er obact er:aerogenes920 172.0明,鉴定结果准确,和数据库有很好的匹配.2.3 利用不同碳源的产氢能力根据代谢微平板对照相应碳源,从中选择出Ente robacter aerogenes能够利用的4种碳源和一种蛋白质比较,以葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉、蛋白胨底物为代表,研究不同种类底物对厌氧发酵产氢的影响,其中葡萄糖、蔗糖、乳糖代表简单的碳水化合物,淀粉代表复杂的碳水化合物,蛋白胨代表蛋白质不同种类底物厌氧发酵在生长过程中的产氢曲线见图1.图1 E.aer og enes利用不同碳源的产氢量从图1中可以看出,葡萄糖、蔗糖、乳糖都是E. aeroge nes很好的产氢底物,最大累计产氢量分别为99、114和78mL,淀粉氢气产量为32mL,蛋白胨没有氢气产生,不适合做厌氧发酵产氢细菌底物.所以,对于厌氧发酵细菌产氢,简单碳水化合物和比较复杂的碳水化合物都是良好的碳源.而蛋白质等复杂的碳水化合物不适合做产氢底物.需要其他酶和微生物的催化分解作用下,才可以被利用来产氢.Eaerogenes属于兼性厌氧菌,进行丙酸型发酵,同时也产生乙酸、乙醇、丁酸等产物.在兼性厌氧的条件下,能够获得优势生态位,进行发酵产氢.五种常规底物产氢实验结果和Biolog鉴定过程中对碳源利用状况相吻合.而不同碳源所表现的产氢差异主要是由于碳源是以不同方式进入光合细菌内部代谢过程的,并且在厌氧条件下作为供氢体形成H+的能力不同,而H+积累所形成的还原力吸收光激活的电子直接导致了氢分子的释放,从而会影响光合细菌的产氢活性[9].3 结论与传统鉴定方法相比,Biolog自动微生物鉴定系统快速、便捷、有效,在微生物鉴定技术上是一项很大的进步,由于其数据库范围广,包含全面,为广大的微生物工作者提供了方向性指导.同时要获得准确的鉴定结果,实验过程中的每一步都需要熟练掌握,严格按照操作规程进行,尤其重要的是菌种的分离纯化、细菌数量和活性、样品预处理、严格无菌环境、与标准菌液一致的浓度范围和均匀性、培养温度和时间都是鉴定成功的保证.对实验室在厌氧状态条件下分离纯化的发酵细菌进行鉴定结果为Ent erobacte r aerogenes,根据产氢实验,这种菌具有很好的产氢能力,并且根据Bi2 olog2GN板对应碳源选出4种常规碳源和一种蛋白质作为生长产氢底物,在温度37℃,p H为7.0,以氩气维持厌氧环境,进行产氢实验.菌株Enter2 obacter aerogenes以蔗糖为底物时产氢累计总量最大,达到了114mL.主要进行丙酸型发酵,为兼性厌氧菌.进一步研究Ent erobacte r aerogenes代谢途径和代谢方式,为混合培养产氢菌的生长,混合代谢模式和途径,生理生化特性奠定了基础.参考文献:[1] 许冬生.纤维素衍生物[M].北京:化学工业出版社,2001.141～142.[2] Landoll Leo M.Modi fi ed no nionic cel lulo se et hers[P].US:4228277,1980210214.[3] Biolog公司网页:www.biolo g.co m[EB/OL].[4] Garland J L,Mill s A L.Clas s ificat ion and characterizatio n ofhet erot rop hic m i crobial co mmuniti es o n t he bas i s of p at t ernsof co mmu ni ty2level s ol e2carbon2source ut ilizat ion[J].ApplEnvi ro n Microbiol,1991,57(8):2351～2359.[5] 林明,任南琪,马汐平.产氢发酵细菌培养基的选择和改进[J].哈尔滨工业大学学报,2003,35(4):398～402.[6] B ochner B R.S l eut hi ng out bact eri al i dent it ies[J].Nat ure,1989,399:157～158.[7] Bochner B.ASM News.1989,55:536～539.[8] Mill er J M,Rhoden D L.Jo urnal of C li nical Mi crobiology,1991,29:1143～1147.[9] Barbara R,Sharak Gent hner,J udy D.Wall Amm o niym up2t ake i n R ho dop seu do m o nas capulat a[J].Arch Microbiol,1985,141:219～224.31第1期刘婧:一株厌氧发酵菌Biolog鉴定及利用不同碳源对产氢的影响。
厌氧发酵产氢的研究进展
厌氧发酵产氢的研究进展作者：屈佳玉来源：《北方环境》2013年第01期摘要：厌氧发酵产氢具有很多优越性，发展潜力巨大，具有高效、节能、成本低等优点。
全文介绍了国内外发酵产氢的研究情况，厌氧发酵产氢的影响因素。
并提出了厌氧发酵产氢的发展趋势。
关键词：厌氧发酵产氢；污泥发酵；微生物发酵目前，人们在对新能源的研究中，清洁、高效、廉价的氢一直是研究者所追求的目标。
氢是一种理想的清洁能源，它的热值高，最高达3042eal/m3，热转化率也很高，而且能量密度很高，是普通汽油的3倍，这意味着燃料的自重可减轻2/3。
制氢技术主要有物化法和生物法，物化法包括水电解法、甲烷裂化法和水煤气转化法等；生物制氢主要有光合制氢和厌氧发酵制氢。
物化法存在着耗能大、效率低等问题，生物制氢技术与之相比，具有清洁、节能和不消耗矿物资源等突出优点。
生物制氢的方法包括光合生物制氢及厌氧发酵制氢，生物制氢中提供充分的光能是光合微生物产氢的必要条件，由于光的穿透能力有限，若要提供足够的光源需要消耗大量的能源，光源的维护与管理十分复杂，并且所占空间较大，使得实现产业化的氢气生产难度很大。
与光合生物法制氢相比，厌氧发酵制氢在很多方面表现出更多的优越性：（1）发酵法生物制氢无需光源，可以实现持续稳定产氢；（2）发酵产氢菌种的产氢能力耍高于光合产氢菌种，而且发酵产氢细菌的生长速率一般比光合产氢细菌要快；（3）可生物降解的工农业有机废料都可能成为发酵法生物制氢生产的原料，来源广且成本低廉。
可见，厌氧发酵制氢更具有发展潜力，是更理想的制氢方法。
1 厌氧发酵制氢的研究进展纵观国内外，现有的厌氧发酵产氢的主要研究成果及发展方向包括：（1）利用污泥厌氧发酵产氢；（2）高效产氢菌种发酵产氢。
1.1 污泥厌氧发酵产氯培养产氢污泥是进行厌氧发酵产氢试验研究的基础和关键。
污泥是多种微生物的混合体，既有产氢微生物又有嗜氢微生物。
在厌氧发酵过程中，产氢微生物所产生的氢气会迅速为嗜氢微生物所利用。
厌氧发酵过程中产氢菌源的预处理方法及其影响因素_孙立红
收稿日期：2014－10－28基金项目：深圳市科技计划项目资助（JSE201109160056A ，CXB201105100085A ，CXB201111240110A ）作者简介：孙立红（1988—），女，河北保定人，硕士研究生，研究方向：纤维素类生物质厌氧发酵产氢。
通讯作者：陶虎春（1974—），副教授。
厌氧发酵过程中产氢菌源的预处理方法及其影响因素孙立红，李金波，陶虎春（北京大学深圳研究生院环境与能源学院，深圳市重金属污染控制与资源化重点实验室，广东深圳518055）摘要：厌氧发酵制氢可利用包括工农业废弃物在内的多种有机物作为基质产生氢气。
其优点是耗能少，成本低廉，有巨大的应用前景和发展潜力。
但在实际应用中，存在着基质利用率较低、发酵产氢微生物不易获得和培养等问题。
本文综述了厌氧发酵产氢过程中的混合菌筛选技术，比较了不同的预处理方法，包括物理处理（热处理、微波，超声，紫外、冷冻解冻、曝气处理）、化学处理（酸碱处理、化学试剂）和电处理等，但是，不同的预处理方法中仍存在不同的缺陷，在此基础上对厌氧发酵产氢的预处理过程提供了全新的发展方向。
除了菌源的预处理之外，影响厌氧发酵过程的因素还有很多，例如pH 值、温度、水力停留时间、Fe 2+浓度以及C /N /P 比例等，本文逐一介绍了这些因素对厌氧发酵过程中的影响。
关键词：厌氧发酵；产氢菌；预处理；影响因素中图分类号：TQ116．2文献标识码：A文章编号：1008－021X （2015）01－0022－08Pretreatments Methods on Hydrogenogens of Anaerobic Fermentation and Its Influcing FactorsSun Lihong ，Li Jinbo ，Tao Huchun（Shenzhen Key Laboratory for Heavy Metal Pollution Control and Ｒeutilization ，School of Environment and Energy ，Peking University Shenzhen Graduate School ，Shenzhen518055，China ）Abstract ：Microorganisms can make use of many kinds of organic materials including industrial and agricultural wastes to produce hydrogen through anaerobic fermentation．The process is thought to have a tremendous application prospect and a good development potential for its little energy input and low cost．Whereas there some problems for an application goal ，such as low degradation rate of substrate and difficulty to cultivate hydrogenogens of anaerobic fermentation．This paper summarizes technologies of screening hydrogenogens from mixed inoculums of the anaerobic fermentation ，and makes a comparison among different methods ，including physical pretreatments （heat ，microwave ，sonication ，ultraviolet ，freezing and thawing ，aeration ），chemical pretreatments （acid and base ，chemical reagents ）and electricity pretreatments．But each method has its own disadvantages ，so in the end ，the development direction of the screening technologies is discussed．Besides the pretreatment methods ，this artcle summaries the factors influcing the biohydrogen production such as pH ，temperature ，hydraulic retention time ，ferrous iron concentration ，ratio of C /N /P and so on．Key words ：anaerobic fermentation ；hydrogenogens ；pretreatment ；influcing factor 随着人类对能源的需求日益增加，煤炭、石油和天然气等不可再生的化石能源被快速消耗，为了实现经济和社会的可持续发展，需要寻求经济、清洁、可再生的能源。
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颈培养瓶平板技术. 通过培养基组成成份的增减和细 菌增长、种类 和数量 的研究 确立了厌 氧发酵 产氢细 菌
的分离和富集培养基. 利用这些厌氧培养技术 , 已成功分离培养了 550 余厌氧菌株系.
关键词: 生物制氢; 产氢发酵细菌; 分离纯化; 厌氧操作; 培养基
中图分类号: X703
文献标识码: A
取 1 m l 细菌培养物( 活性污泥或经过倍比稀 释的活性污泥) 和 9 ml 无菌无氧水或无菌无氧生 理盐水混合, 制成 10- 1~ 10- 25倍比稀释菌液, 经 过实验对比, 选取 10- 13~ 10- 18接种固体培养基 可以获得有单细胞菌体生长而来的菌落. 用本实 验室制作的弯头毛细管转移入液体培养基中, 进 行富集扩增. 上述操作重复进行, 直至固体培养 基( Hungat e 厌氧滚管或平面培养瓶) 上的菌落和 普通光学显微镜下菌体细胞形态一致为止. 一般 进行/ 固体- 液体0培养基反复操作 2~ 5 次. 1. 4 氢气量和产氢能力测定
2 结果与讨论
211 Hungate 滚管技术的改良与应用 21111 培养基的配制操作
将配制好的培养基倒入一平底三角烧瓶中, 放在电热炉上加热. 加热之前通入高纯氮气( 99, 99% ) 驱除三角瓶内气相空气. 当气体通过煮沸 的培养基表面时, 培养基轻轻煮沸. 当培养基完 全无氧时( 通过刃天青指示剂的颜色变化来指示, 无氧时刃天青无色) , 既可移入厌氧螺旋管. 移入 培养基用 10 ml 注射器, 并采用平头兽用针头( 长 约 10~ 15 cm) , 将注射器和针头放入煮沸培养基 内部时同时进行氮气吹培养基容器和瓶. 21112 滚管技术
氢具有十分重要的意义.
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哈尔滨工业 大学学报
第 36 卷
1 材和方法
111 供试菌种与活性污泥 供试纯菌种来自本实验室分离得到的高效产
氢细菌 B49[ 5] , 供试污泥来自本实验室生物制氢 反应器. 112 细菌分离
从生物制氢反应器中取 10 ml 产氢发酵活性 污泥, 放入事先充满氮气无氧灭菌的培养瓶中, 加 入 10 粒玻璃珠, 在振荡器中振荡 1 h 或手工摇瓶 30 min, 将污泥中菌胶团打碎, 用脱氧无菌水或脱 氧无菌生理盐水进行 10 倍为基准的倍比稀释, 再 接种于固体培养基之中或平板培养或制成滚管培 养. 培 养时间为 20 d, 通过 MPN 法估计菌体数 量[ 15] . 1. 3 纯化富集
HP B- L R 培 养基: 根据 H PB- 1、H PB- 2、 HP B- 3 和 L M- 1 四种培养基的实验结果, 综合 而成的培 养基 HPB - L R, 成 份如下 ( g/ l) : 葡萄 糖, 2010; 胰 蛋白 胨, 110; 蛋白 胨, 310; 牛肉 膏, 210; 酵 母汁, 110; N aCl2, 310; K 2HP O4, 110; L 半胱氨酸, 015; 维生素液与微量元素( 抗坏血酸, 01025; 叶 酸 0101, N ICl216H2O, 01001; CaCl212H 2O , 0101, ZnCl2, 0102 ) 10 ml; 刃 天 青
采用林明[ 9] L M - 1 培养基作为本项研究的 起始培养基. 11512 改进培养基
HP B- 1 培养基( g/ l) : 葡萄糖, 20; 胰蛋白胨 + 蛋白胨( 110+ 310) ; 牛肉膏, 210; 酵母汁, 110; NaCl, 310; K2HPO 4, 110; Mg Cl2, 0105; FeSO417H2O , 0105; L - 半胱 氨酸, 015; 另 加 L M 1[ 9] 维生素液和微量元素液; 刃天青( 012% ) ; 110 ~ 210 ml; 琼脂, 2010g 或 不加 琼脂成 液体 培养 基.
产氢发酵细菌的产氢能力和产氢气量的测定 方法和装置见文献[ 5] . 1. 411 改良 Hungat e 滚管技术[ 1]
无菌水和培养基的制备及分离培养涉及菌种 操作环节采用简化的 H ungate 厌氧技术. 以高纯 氮气吹脱厌氧管内的空气( 氧气) , 用厌氧螺旋管 装液体和固体培养基, 35 e 常规培养, 手工冷水中 滚管. 11412 平面厌氧操作技术[ 16~ 18] 1141211 厌氧管斜面法
并下压, 使皿内不留气泡. 并用琼脂密封皿盖与 皿底边缝间隙. 11413 平板培养瓶厌氧技术
利用宽体窄颈瓶形成培养瓶底部的平面, 进 行菌液涂布或滴加菌滴并轻摇涂布法, 操作按氮 气吹脱培养 瓶内空气 ( 氧 气) . 配制培养 基过程 中, 利用加热煮沸驱逐液相溶解氧和利用氮气吹 脱瓶内气相空气的方式, 保证严格厌氧. 多加琼 脂 012~ 015% , 吸收多余水分. 同样的操作技术, 配制成液体培养基, 进行菌体富集增量. 全部实 验操作采用吹氮气脱氧和加热驱氧. 115 培养基 11511 基本培养基
固体培养基的滚管技术是指将装有热熔的厌 氧管放入装有冷水的平底盆中迅速不断转动而制 成. 当琼脂围绕管壁完全凝固后, 琼脂滚管即可 垂直放置贮存, 并可使少量未凝结的水分集中在 底部. 当管内培养基在 45 e 左右未凝结时, 用注 射器将稀释比配为 10- 10~ 10 -菌15液注射入培养管 中, 然后滚管. 灭菌管接种时, 橡皮塞在火焰上灼 烧, 稍冷后通过橡皮塞注入菌液. 21113 厌氧细菌分离
文章编号: 0367- 6234( 2004) 12- 1589- 04
The experimental anaerobic operation of isolation and culture on hydrogen- producing and fermentative bacteria
L I Yong- f eng, REN Nan- qi, CH EN Ying, LI Jian- zheng , HU L-i jie, ZHENG Guo- x iang
( 012% ) 1 ml; 琼脂 20~ 2510 g 或不加琼脂或液 体培养基; pH 调整为 410~ 415. 116 培养条件
高压灭菌 115 e 30 m in, 恒温培养或震荡培 养, 转速 120 r/ m in.
第 12 期
李永峰, 等: 发酵产氢细菌分离培养的厌氧实验操作技术
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HPB- 2 培养基( g/ l) : 碳源、氮源与大量元素 同 LM- 1 培养基[ 9] ; 维生素液中只加具有还原性 的抗坏血酸 01025 g/ l 和叶酸 0101 g/ l, 10 ml. 另加 微量元素液同 L M- 1[ 9] . 加琼脂 2010 或不加 琼 脂, 其它同 HPB- 1.
利用厌氧螺旋管装入培养基 3 ml, 将其摆成 尽可能的斜面, 垂直培养. 1141212 平皿夹层厌氧法
培养基经灭菌后无菌条件下倒入一层营养琼 脂, 厚度与培养皿高度相近为宜, 用稀释菌液涂布 冷却后的培养皿( 同好氧操作) . 涂布后让菌液渗 透 5 分钟, 然后揭开培养皿一边将营养琼脂再度 倒入, 直到营养琼脂将溢未溢/ 凸起0状态( 这一点 靠粘稠的营养琼脂表面张力) , 随后迅速盖上皿盖
第 36 卷 第 12 期 2 0 0 4 年 12 月
哈尔滨工业大学学报 JOURNAL OF HARBIN INST IT U T E OF T ECH NOLOGY
V ol1 36 No1 12 Dec. , 2004
发酵产氢细菌分离培养的厌氧实验操作技术
李永峰, 任南琪, 陈 瑛, 李建政, 胡立杰, 郑国香
琐; 与此同时过去要求技术设备试剂要求高, 限制 了厌氧菌的研究, 厌氧菌各学科的研究进展都大 大落后于普通好氧菌. 用厌氧分离培养技术, 国 内外 学 者 也 开 展 了 分 离 高 效 产 氢 菌 种 的 研 究[ 5- 14] , 但是, 大多数学者未能分离到具有高效 产氢能力的细菌, 即使分离到产氢菌种也仅仅局 限在 2~ 3 个 菌属[ 6~ 11] . 为 了能够 获得 目标细 菌, 一些学者配制了复杂成分的培养基, 但是有些 成分并不是该微生物所需, 例如分离到高产氢能 力菌种的 K umar[ 11] 和任南琪等[ 5] 的培养基成份 就十分复杂, 也存在进一步简化的必要. 在研究 厌氧分离技术的基础上, 研究出新的厌氧发酵细 菌培养基对分离和富集产氢发酵细菌和工业化制
( 哈尔滨工业大学 市政环境学院, 黑龙江 哈尔滨 150090)
摘 要: 厌氧产氢细菌的分离纯化与培养是发酵法生 物制氢 技术的基 础课题 之一, 现有厌 氧细菌 的分离 制
备技术和培养基分别存在着操作繁琐和成份复杂问题. 通过厌氧培养技术比较和细菌生长试 验, 确 定了/ 煮
沸吹氮去氧, 固液交替分离0 的厌氧产氢细菌分离纯 化培养程 序, 改进了 Hungate 技术和建 立了新 的宽体 窄
收稿日期: 2003- 12- 10. 基金项目: 国家杰出青年科学基金资助项 目( 50125823) ; 国家 重
点基础研究发 展规划 资助项 目( G2000026402) ; 哈 尔 滨工业大 学跨 学科 交叉性 研究 基金 资助 项目 ( HIT . M D20021 25) . 作者简介: 李永峰( 1961- ) , 男, 博士研究生; 任南琪( 1959- ) , 男, 教授, 博士生导师, 特聘教授.
( School of M unicipal and Enviro nmental Eng ineering, Harbin Institute of T echnolog y, Harbin 150090, China)
Abstract: Isolat ion and culture of hy drog en- producing and ferment at ive bact eria is an import ant foundat ion on biohydrogen product ion process. T here are com plicated operat ion and composit ion in present anaerobic techniques and cult ure media. Hungat e technique w as im proved and plat e of cult ure bott le w as est ablished by com paring anaerobic methods and bacterium grow th. Isolat ion and enrichment culture media w ere conf irmed by the t est of diff erent com posit ion and the species and amount of hy drog en- producing and fermentat ive bact erium. 550 bacterium st rains were isolated by the anaerobic operat ion. Key words: biohydrogen product ion; hydrogen- producing and ferment at ive bact eria; isolation and cult ure; anaerobic operat ion; culture media