全内反射荧光显微镜90613113
全内反射荧光显微镜概述
3. 物镜型光学成像系统中物镜
由于细胞的典型折射率为1.33~1.38，因此要实现全内 反射，在物镜型全内反射荧光成像系统中物镜的数值 孔径（NA）必须大于1.38。 当物镜数值孔径为1.4时，只有很小的一部分数值孔径 范围（1.4-1.38=0.02）被利用，入射角可调节范围 （最大孔径角与全内反射角的差值）很小，光束校准 比较难，同时光束的强度也很难提高。若使用数值孔 径为1.65的物镜，则有一个大的多的孔径范围（1.651.38=0.27）可以被利用，则入射角可调节范围变大， 降低了操作难度。高数值孔径的物镜的使用是物镜型 全内反射荧光成像系统的关键。
全内反射
全内反射是一种普遍存在的光学现象。 考虑一束平面光波从折射率为n1的介质进入到折射 率为n2的介质中。入射光在表面上一部分发生反射， 另一部分则发生透射。入射角θ1和透射角θ2之间满 足关系式n1sinθ1=n2sinθ2 当n1大于n2时，全反射就可能发生:即所有的入射光 线全部反射出来,称为全内反射。
2.2 物镜型
而在物镜型成像系统中，显微镜的物镜既是发生全内反射的 光学器件，又是样品荧光信号的收集器。其优点是样品的大 小没有棱镜的限制，样品的放置非常方便，并且由于样品远 离物镜而可以与多种其他技术相结合，例如微操作，微分干 涉成像系统，光镊技术，扫描探针显微术等等，因而相对于 棱镜型展现出更加广阔的生物应用前景。
2.1棱镜型
棱镜型利用激光经过棱镜并产生全内反射，其隐失波照射已 被荧光标记的生物样品，其激发光从另一侧进入物镜并被 CCD相机捕捉。棱镜作为发生全内反射的光学器件。物镜只 是作为荧光信号收集器。在探测上，它也不容易受到入射光 的干扰。缺点是放置样品的空间位于棱镜和盖玻片之间，所 以样品大小和样品的放置受到限制。
全内反射成像的原理及应用
全内反射成像的原理及应用1. 引言全内反射成像是一种重要的光学现象，广泛应用于光学仪器、光纤通信、医学影像等领域。
本文将详细介绍全内反射成像的原理及其在不同领域中的应用。
2. 全内反射成像的原理全内反射是光从光密介质射向光疏介质的界面时，入射角大于临界角时发生的现象。
在这种情况下，光线将完全被反射回光密介质中，而不会透射到光疏介质中。
全内反射成像利用这一原理，在光密介质和光疏介质的交界面上形成虚拟的光学元件，通过控制入射角和光线传播路径，实现成像功能。
3. 全内反射成像的应用3.1 光学仪器中的应用全内反射成像在光学仪器中有着广泛的应用。
例如，在显微镜中，通过使用透明的物质作为载玻片和近场物体之间的介质，可以利用全内反射成像来观察样本的细微结构。
同样，在光学显微镜和投影仪中，也可以利用全内反射成像来改善成像的清晰度和分辨率。
3.2 光纤通信中的应用光纤通信是一种利用光信号进行高速数据传输的技术。
在光纤中，信号的传播主要依靠全内反射成像。
光纤的内部涂覆着高折射率的材料，从而让光信号在光纤中完全反射。
通过控制入射角和光纤的弯曲，可以实现信号的传输和调制。
光纤通信具有高带宽、低衰减等优点，已经成为现代通信领域的重要技术。
3.3 医学影像中的应用在医学影像学中，全内反射成像也起到了关键的作用。
例如，通过内窥镜和纤维光学技术，医生可以观察和诊断患者体内的病变。
内窥镜通过应用全内反射成像，将光线引导到需要观察的部位，通过适当的透镜和传感器，可以获取高清晰度的图像，为医生提供更准确的诊断依据。
4. 结论全内反射成像是一种重要的光学现象，广泛应用于光学仪器、光纤通信和医学影像等领域。
通过理解其基本原理，我们可以更好地利用全内反射成像技术，提高成像质量和传输效率。
未来随着科学技术的不断发展，全内反射成像在更多领域中的应用将会得到进一步的拓展和改进。
以上是对全内反射成像原理及应用的简要介绍，希望能为读者提供有关这一主题的基本知识和启发。
全内反射荧光显微镜 - 北京大学单分子与纳米生物学实验室
当一束平面光波从折射率为n1的介质进入到折射率为n2的介质中
消逝波----全内反射荧光镜的关键所在
消逝波 消逝场(evanescent field)
荧光消逝波 θ2=90° θc=sin-1(n2/n1)
全内反射的仪器组成
全内反射荧光显微成像系统
棱镜型
物镜型
成像系统的消逝场 是通过入射光经棱 镜发生全反射产生 的
基本概念
Title 全内反射荧光显微术：
Title 数值孔径：
全内反射荧光显微术：
全内反射荧光显微术是利用全内反射产 生的消逝波来照射样品，从而致使在样 品表面数百纳米级厚度的光学薄层内的 荧光团受到激发，使单分子成像。
数值孔径：
数值孔径又叫做镜口率，简写为N.A。它是 由物体与物镜间媒质的折射率n与物镜孔径 角的一半（a\2）的正弦值的乘积，其大小 由下式决定：N.A=n×sin a/2
全内反射荧光技术发展历程
1965年
Hirsch field 完成了第一个 全内反射荧光 实验
1995年
Yanagida小 组用TIRFM技 术首次在液体 溶液中得到了 荧光标记的单 个蛋白质分子 的成像.
1996年
Moerner小 组又用这项技 术实现了限制 在丙烯酰胺胶 体的纳米孔中 的单分子的三 维成像。
层析深度分别为～ 500nm～800nm , 而全内反 射显微术典型的垂直照明深度<100nm。这么 薄的光学层析层切片意味着信噪比 比共焦系统 好得多, 细胞的光损伤和光漂白也很小。
全内反射荧光显微镜优点：
1：信噪比高 2：分辨率高 3：对生物样本损伤小
与共焦技术相比, 单光子或双光子的共焦系统层 析深度分别为～ 500nm～800nm , 而全内反射显 微术典型的垂直照明深度<100nm。这么薄的光 学层析层切片意味着信噪比 比共焦系统好得多, 细胞的光损伤和光漂白也很小。
全内反射荧光显微术名词解释
全内反射荧光显微术名词解释全内反射荧光显微术，听起来就像是从科幻电影里蹦出来的名词，是吧？其实它可是一种非常酷炫的显微镜技术，能让我们看到那些微小得像针尖一样的细胞和分子。
想象一下，把光线像小箭一样射向样品，当光线以一定的角度入射，嘿，光线就不再穿透，而是在界面上反射回来，这就是全内反射的魔法！这时候，样品里的荧光分子会被激发，发出闪闪的光芒，简直就像夜空中的繁星，令人心醉。
用这个技术，科学家们可以观察生物样品，像细胞膜、蛋白质等。
大家知道细胞是生命的基本单位，对吧？而这些微小的结构可不是轻易就能看清的，普通显微镜就像是用放大镜看远处的星星，模糊得很。
全内反射荧光显微术却像是把宇航员送到了太空，直接给你展示了细胞内部的每一个角落，真是让人眼前一亮。
这项技术的魅力在于，能在活细胞中进行观察。
别小看这一点，很多传统的显微镜技术可得把细胞弄得死去活来才能看清。
可是全内反射荧光显微术却让我们能够在“现场”观察，活生生的细胞在做什么，简直就像在看一场精彩的真人秀！你可以看到细胞的动态变化、分裂过程，甚至是它们如何和周围的环境互动，这些都是生命中最微妙的瞬间。
说到荧光，这里有个小秘密。
荧光分子就像是小小的发光棒，只有当它们被特定波长的光激发时，才会闪耀出美丽的光芒。
像小孩子玩耍一样，开心得不得了。
这种现象让我们能够区分不同的细胞，甚至标记特定的蛋白质，形成色彩斑斓的图像。
这些图像比任何油画都要生动，简直就是生命的艺术品。
想想看，科学家们在显微镜下能看到的那些细胞，像极了微缩版的城市，热闹非凡。
全内反射荧光显微术也让我们在医学研究中大放异彩。
比如在癌症研究中，科学家们通过观察癌细胞的特征，发现它们是如何突破正常细胞的防线，蔓延到其他地方的。
这种技术帮助我们了解疾病的根本，寻找更有效的治疗方案。
感觉像是在揭开一个个神秘的面纱，让我们看清楚那些潜藏在暗处的真相。
操作全内反射荧光显微术可不是随便拍拍的事。
它需要一套精密的设备和技术，像调整光路、选择激发波长，这些都得小心翼翼。
全内反射荧光显微镜TIRFM介绍
TIRFM 原理
全内反射是一项依赖于消逝波的技术。 在两种不同折射率介质的临界面上，临界角 的光线几乎被完全反射： c= sin-1 (n2/n1) n1 > n2 消逝波只能够传播到盖玻片后几百纳米内 典型的有效照明下渗透度只有50nm到100nm
低折射率 q 高折射率
只有临近盖玻片表面（近场）的荧光分子才能 被激发。远场分子不受激发。
如何得到消逝波
标本折射率 消逝波 水 n２ =1.33 细胞内液 n２ =1.38
d
盖波片 （n1＝1.52 for PLAPO60XOTIRFM) (n1＝1.78 for APO100XOHR ） 镜油 （n0＝1.52 for PLAPO60XOTIRFM） （n0＝1.78 for APO100XOHR ）
安装简单 可用于膜片钳实验 物镜数值孔径受限制
PDF created with pdfFactory Pro trial version
全内反射照明的切换
宽场荧光照明
盖波片
物镜
激光
PDF created with pdfFactory Pro trial version
高灵敏度冷CCD --- EMCCD Rolera-MGi
背感光、高量子效率，>90% 芯片增益EMCCD，不放大读出噪音 高速度，全幅30fps，最高300fps以上 低温制冷CCD
EM CCD在以下应用具有无可比拟的优势： 1。单分子成像：Single molecule imaging 2。全内反射：Total internal reflection 3。转盘式共聚焦：Spinning Disk 5。Ca等的离子测定 6。快速时间序列的荧光3D成像
PDF created with pdfFactory Pro trial version
简述全内反射荧光显微术的原理和应用
全内反射荧光显微术原理与应用1. 引言全内反射荧光显微术（Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，TIRFM）是一种基于全内反射原理的显微技术，利用全内反射限制激光光束的传播范围，使其仅激发样品表面附近的荧光染料，并通过荧光显微镜观察和记录表面附近的高分辨荧光信号。
该技术具有高灵敏度、高空间分辨率和实时监测能力等优点，广泛应用于生命科学研究中。
本文将详细介绍TIRFM的原理和应用。
2. 全内反射原理光在由一个折射率较大的介质（如光具）射入折射率较小的介质（如空气）时，当入射光线的入射角大于一个特定的临界角时，光线将会完全发生反射，不再穿透进入折射率较小的介质中。
这个现象被称为全内反射（Total Internal Reflection，TIR）。
当一个光束从高折射率的物质射入低折射率的物质时，入射角大于临界角时，发生全内反射。
通过调控入射角，可以使光线沿着介面传播，从而形成衰减系数很小的光束。
这个现象可以被用来实现TIRFM的照明光路。
3. 全内反射荧光显微术系统TIRFM系统主要由以下几个部分组成：激光光源、调制器、目标镜、物镜、荧光滤光片、成像系统和数据采集分析系统等。
激光光源：一般使用高功率激光器，如氩离子激光器或二极管激光器。
激光通过光纤输入到光路系统中。
调制器：用于控制激光的工作模式，常用的包括振荡镜或振荡腔。
目标镜：一般是具有高折射率的玻璃片或光具，用于实现全内反射，常用的目标镜材料有石英、玻璃等。
物镜：用于聚焦激光到样品表面，并收集荧光信号。
物镜的选择要考虑到激光的聚焦效果和空间分辨率。
荧光滤光片：用于选择性地阻挡激发光和透射荧光信号。
成像系统：一般是荧光显微镜或全内反射显微镜。
能够观察并记录样品表面的荧光信号。
数据采集分析系统：可以对观察到的荧光图像进行实时处理和分析，如图像增强、图像叠加、荧光强度计算等。
4. TIRFM原理TIRFM的原理可以通过以下步骤进行解释：1.激光从物镜聚焦到样品表面。
全内反射荧光显微镜 - 北京大学单分子与纳米生物学实验室
PC-linker
全内反射荧光显微术应用
现在全内反射荧光显微术已被泛广用于 实时观察单个肌浆球蛋白分子的运动、 单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转 移( FRET) 、ATP 酶的翻转,聚合物内单 个分子的结构变化、以及等离子体膜附 近的神经分泌腺的颗粒运动等多方面。
全内反射荧光显微镜的发展展望
成像系统的消逝场 是通过入射光经物 镜本身全反射产生
棱镜型系统包括三个主要部分
(1) 倒置的相衬光学显微镜; (2) 可以二维精确移动的样品台; (3) 用来发生全反射的棱镜
棱镜型评价
1
棱镜型系统在实现上更加容易,它只 需要激光光源、棱镜和显微镜。
2
在探测上,它也不容易受到入射光信 号的干扰
3.全内反射荧光显微镜同原子 力显微镜结合的应用
Injected Fluorescent Beads
1) Silanization of whisker crystals 2) Modification of PC-linker 3) Immobilization of Fluorescent Beads
合适的pH值：PH:4.25
合适的TPPS的浓度：1.5x10-6 -1"L’
2.蛋白质的分泌：
A. 为刺激给予之前;B、C. 为刺激给予后 MIN6 细胞用吖啶橙荧光染料转染后给予50 mmol/ L 氯化钾 刺激,应用TIRFM 得到全反射影像
A1 为刺激给予之前;B、C1 为22mmol/ L 葡萄糖给予之后 MIN6 细胞应用吖啶橙荧光染料转染后给予高浓度葡萄糖刺激, 应用TIRFM 得到全反射影像。
放置样品的空间收到棱镜的限制
基于全内反射显微镜的荧光漂白后恢复实验方法建立
文章编号：2095－6835（2022）05－0133－05基于全内反射显微镜的荧光漂白后恢复实验方法建立＊曹慧珍，王瑾瑜，王文娟（清华大学生物医学测试中心尼康生物影像中心，北京100084）摘要：发展了基于全内反射显微镜的荧光漂白后恢复（TIR/FRAP）的成像方法，该方法通过全内反射显微镜（TIRFM）和激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的联合使用，将全内反射荧光成像和荧光漂白后恢复技术相结合，可广泛用于研究质膜附近分子动力学特征。
LSCM对任意感兴趣区域（ROI）执行光漂白，TIRFM特异性采集漂白前后细胞质膜附近的荧光信号，通过NIS-Elements软件程序实现显微镜模式间的自动快速切换。
相比目前通用的基于全内反射的光漂白方法，这种方法具备灵活可变漂白区域的优势，可以满足大多数的基于全内反射的光漂白后恢复实验需求。
同时，这种技术方法也为开发TIRFM或LSCM与其他设备的联用方法奠定了实践基础。
关键词：全内反射显微镜；荧光漂白后恢复；自动切换；感兴趣区域中图分类号：Q336文献标志码：A DOI：10.15913/ki.kjycx.2022.05.041全内反射荧光显微镜（Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，TIRFM）特异性地照亮盖玻片/样品界面附近的荧光团，抑制来自细胞更深层的背景[1-2]，广泛应用于质膜附近的生物过程研究中，例如细胞粘附位点、囊泡胞吐和内吞作用或内质网/质膜接触位点等[3-4]。
荧光漂白后恢复（Fluorescence Recovery After Photobleaching，FRAP）技术是研究分子迁移特性的技术。
基于全内反射显微镜的荧光漂白后恢复实验（Total Internal Reflection/Fluorescence Recovery After Photobleaching，IR/FRAP）将TIRFM和FRAP技术相结合，测量盖玻片/样品界面分子的动力学数据，是研究质膜附近分子动力学的有力工具[5]。