softagarassayprotocol软琼脂克隆形成实验
检验技师考点：软琼脂培养法克隆
检验技师考点：软琼脂培养法克隆
检验技师考点：软琼脂培养法克隆
(1)软琼脂的配制：含有20%NCS(小牛血清)的.2倍浓缩的RPMI1640.
①1%琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。
②0.5%琼脂：由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。
置42℃保温。
(2)用上述0.5%琼脂液(含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。
(3)按100/ml，500/ml或5000/ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。
(4)1ml 0.5%琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。
(5)混匀后立倾注于琼脂基底层上，在室温中10min，使其凝固，孵育于37℃、5%CO2孵箱中。
(6)4～5天后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔中进行培养。
(7)检测抗体，扩大培养，必要是地再克隆化。
软琼脂克隆形成实验
➢ 铺下层胶：1.2%的琼脂糖胶与2X培养基1:1混 合，加入到6孔板中，每孔1.5mL,室温等其凝 固。
➢ 细胞计数：将细胞用PBS的洗一遍，用胰酶消 化终止后离心，加入新的培养基混匀稀释，调 整细胞浓度为5X104/mL,每孔加入100uL的细胞 悬液。
三、注意事项
➢ 软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。
➢ 试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40℃。
➢ 接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿 接种1000个细胞。
➢ 软琼脂克隆形成实验主要用于非贴壁生长的细胞，某些细 胞（如正常成纤维细胞）在悬浮状态下不能增殖，不适用 此种方法。
软琼脂克隆形成实验
➢ 铺上层胶：0.7%的琼脂糖胶与2X培养基1:1混合，加入100uL的细胞悬 液，即5000个细胞，混合均匀后，每孔加入1.5mL。
➢ 放入37℃，CO2培养箱培养，隔三天后补加培养基，约3周后收细胞。 计数比较对照组与实验组的细胞数量，最后进行分析，计算单克隆形 成率。
软琼脂克隆形成实验
➢ 软琼脂培养法常用来检测肿瘤细胞和转化细胞的增殖能力。
➢ 克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞 生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大正常细胞克隆形成率弱 ，肿瘤细胞强。
软琼脂克隆形成实验
二、实验方法
➢ 配制1.2%和0.7%的琼脂糖，高压灭菌后置于 55℃的水浴锅中，目的是为了使其保持融化状 态。
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Hale Waihona Puke 软琼脂克隆形成实验（Soft Agar Assay）
软琼脂克隆形成实验
softagarassayprotocol软琼脂克隆形成实验
1.软琼脂克隆形成实验
1)配制%和%的琼脂糖，高压灭菌后置于55℃水浴中，使其保持融化状态。
2)配含20%FBS、2×抗生素的2×RPMI 1640培养基，37℃预热。
3)灌下层胶：%的琼脂糖胶与2×培养基1:1混合，加入到6孔板中，每孔3ml，
室温放置待其凝固。
4)等待下层胶凝固过程中消化B16 con shRNA与B16 Myo7a shRNA稳转细胞，
计数，用无血清培养基调整浓度为5×104/ml，每孔用100μl细胞，设3个平行孔。
5)下层胶凝固后灌上层胶：%的琼脂糖胶与2×培养基1:1混合(温度约40℃左
右)，加入100μl细胞悬液，即5000个细胞，混匀，加入孔板中，每孔3ml。
培养，约2-3周收细胞，%结晶紫染色，计数并比较两组克隆形6)37℃ 5% CO
2
成情况。
软琼脂集落形成实验
1.双层软琼脂集落形成率实验于24 孔板中, 下层低熔点琼脂浓度为0. 5 % , 上层为0. 33 %,每孔上层低熔点琼脂含细胞数为2 000 个,每种细胞共铺5 孔。
把培养板移入CO2 孵箱,在37 ℃、5 %CO2 及饱和湿度环境下培养2～3 周后倒置显微镜下计数直径大于100μm或含50 个细胞以上的克隆,并计算克隆形成率(克隆形成数/ 接种细胞数×100 % = 克隆形成率) 。
2.软琼脂克隆形成实验将p27Kip1转染组、空载体转染组和未转染组细胞以每组600个细胞接种于60 mm 含底层5 g/L琼脂糖和顶层3 g/L琼脂糖的软琼脂中;37℃培养箱中培养14 d;倒置显微镜下观察克隆形成情况.计算克隆形成率.软琼脂克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%对照组克隆数-实验组克隆数抑制率= ×100%对照组克隆数3.软琼脂克隆形成实验用去离子水配制7 g．L-1和12 g．L -1琼脂溶液，高温高压灭菌后，于45℃水浴保温备用. 配制2×DMEM培养液，高温高压灭菌后45℃水浴保温. 将2×DMEM与12 g．L-1琼脂溶液等体积混匀后，按1 mL/孔加入24孔培养板，4℃放置30 min使之凝固. 再将2×DMEM与7 g．L-1琼脂溶液等体积混匀，之后加入单细胞悬液并调整细胞终浓度为1×106个．L-1，此混悬液按每孔0.5 mL加入上述24孔板，铺平后室温放置使琼脂凝固，之后置于37℃，50 mL．L-1 CO2孵箱中培养2 wk，观察细胞克隆形成情况并计算克隆形成率. 同时设HO-8910为空白对照和8910-pcDNA3为空载体对照.4.软琼脂克隆形成试验细胞在35 mm的平皿中长至70％～80％铺满，然后与20 μμmol·I-1的AS －ODN。
共孵育4h，之后将细胞重悬于新鲜培养液配制6mL·L-1的底层琼脂，lml／孔加入24孔板中，调整细胞浓度并与 4 mL·L-1的琼脂混合，以每孔0.5 mL中含500个细胞加到底层琼脂上，置37℃培养2Wk后计数克隆形成数克隆大于100个细胞着计数。
细胞克隆形成实验步骤及方法
细胞克隆形成实验步骤及方法细胞克隆形成实验步骤及方法一、技术简介细胞克隆形成实验是用来检测细胞增殖能力、侵袭性、对杀伤因素敏感性等的重要技术方法。
实验方法包括平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。
由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强；初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强。
由于克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。
当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。
每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0 mm之间。
集落形成率表示细胞的独立生存能力。
各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。
通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测，细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。
贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
二、实验流程A．平板克隆形成实验：适用于贴壁生长的细胞。
1. 取对数生长期的各组细胞，制备细胞悬液。
2. 将细胞悬液作梯度倍数稀释，分别接种含培养液的皿中，培养2-3周。
3. 经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。
4. 弃去上清液，4%多聚甲醛固定，GIMSA染色液染10-30 min。
5. 计算克隆形成率，克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）× 100%。
6. 结果统计分析。
B．软琼脂克隆形成实验：适用于非锚着依赖性生长的细胞。
1. 制备细胞悬液，梯度倍数稀释。
2. 分别制备1.2%和0.7%琼脂糖溶液。
3. 下层琼脂凝固后放入37℃培养箱备用。
4. 加入细胞悬液，待上层琼脂凝固后，培养10-14天。
5. 计算克隆形成率，克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）× 100%。
三种不同生物学特性细胞在软琼脂中的生长表型分析
三种不同生物学特性细胞在软琼脂中的生长表型分析刘芳莉;于旸;傅松滨【摘要】背景与目的软琼脂(soft agar)实验一般用来检测细胞的集落形成能力,但很早就有人根据形态学变化用它来检测低等生物的生物学特性.本文探讨利用软琼脂集落形成实验这种方法进行哺乳动物癌细胞表型初步分析的可行性.方法将三种不同生物学特性的细胞(小鼠成纤维细胞NIH3T3,高转移人肺腺癌细胞系Anip973,高浸润人肺腺癌细胞系L18)悬液接种到软琼脂中,分别在1天、5天、14天后观察细胞形态特征.结果第五天开始细胞集落形态出现差异,14天时差异更显著.NIH3T3细胞克隆为椭圆形,中等大小,边界清楚;Anip973克隆周围有大量游走细胞,表现出其转移特性;L18细胞克隆分支多并向周围延伸扩展,与其浸润特性相符.结论软琼脂分析实验是一种良好的根据表型来观察及鉴定哺乳动物细胞生物学特性的方法.【期刊名称】《中国肺癌杂志》【年(卷),期】2008(011)001【总页数】4页(P51-54)【关键词】软琼脂;细胞学;细胞培养【作者】刘芳莉;于旸;傅松滨【作者单位】150081,哈尔滨医科大学遗传学教研室;150081,哈尔滨医科大学遗传学教研室;150081,哈尔滨医科大学遗传学教研室【正文语种】中文【中图分类】Q-331软琼脂分析（soft agar assay）为当前检测转化细胞和肿瘤细胞最为常用的方法，与细胞恶性程度有很大的符合率。
以往曾有人对金黄色葡萄球菌、阴道毛滴虫[1]等低等生物在软琼脂中的集落形态学进行过研究，认为在同一种生物中，不同种系来源的细胞产生的克隆其形态也不同，并据此可以区分病源性与非病源性种系。
那么高等哺乳动物细胞是否因也会其特性不同而在软琼脂上表现为不同的细胞形态呢？本实验采用3个不同特性的哺乳动物细胞系，针对这一问题做了研究及分析。
1 材料与方法1.1 材料NIH3T3细胞购自上海细胞生物所；Anip973细胞由哈尔滨医科大学病理教研室构建，是由低转移肺腺癌细胞系接种裸鼠体内后衍生的高转移细胞系；L18是来自中日友好医院的高浸润肺腺癌细胞系。
细胞克隆形成实验
细胞克隆形成实验当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。
每一个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。
集落形成率表示细胞的独立生存能力。
各类理化因素可能致使细胞的克隆形成能力发生改变。
通过必然的实验方式能够对细胞的克隆形成能力进行检测。
细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞没必要然每一个都能增殖和形成克隆。
而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依托性和增殖能力两个重要性状。
由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率不同也专门大：一样初代培育细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。
实验方式：平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验(a) 平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培育的细胞(b) 软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依托性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。
平板克隆形成实验大体步骤：一、取对数生长期的各组细胞，别离用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培育液中备用。
二、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞别离以每皿50、100、200个细胞的梯度密度别离接种含10mL 37℃预温培育液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。
置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培育箱中培育2～3周。
3、常常观看，当培育皿中显现肉眼可见的克隆时，终止培育。
弃去上清液，用PBS警戒浸洗2次。
加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。
然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透亮胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。
最后计算克隆形成率。
克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆形成实验方式简单，适用于贴壁生长的细胞。
细胞克隆形成实验
细胞克隆形成实验当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。
每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。
集落形成率表示细胞的独立生存能力。
各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。
通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。
细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。
而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大：一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。
实验方法：平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验(a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞(b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。
平板克隆形成实验基本步骤：1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。
2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。
置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。
3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。
弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。
加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。
然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。
最后计算克隆形成率。
克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
肿瘤细胞软琼脂克隆形成实验
Soft Agar Colony Formation AssayDarren Carpizo, M.D.Overview: This assay is designed to assay a cell's ability to grow unattached to a surface and therefore suspended in agar. The assays are done in 6cm plates. A bottom layer of enriched media + agar is poured first (2.5ml), after solidifying this is followed by a layer containing a lower amount of agar and containing a specified number of cells (cell layer = 5ml), after solidifying a top layer is poured. The plates are placed in the incubator and after two weeks or so, colonies are counted by naked eye.1)Make sol'ns of 2X Iscove's Media (Gibco BRL, dissolve one 1L packet in 500ml of water)and filter sterilize, make about 100 ml of 1X by diluting the 2X, separate from this 100ml make 100 ml of 1X Iscove's containing 10% FBS2)Make Noble Agar (Difco) at 1.3% and place in 55° C water bath to keep in liquid phase3)Determine the number of sample pairs you will be making (a sample pair consists of oneplate control and one plate experimental. I usually made 4 sample pairs or an n of 4. Add one to this, so n of 4 +1 = 54)The bottom and top layer solutions are made as one and divided in half. The cell layersolution is made separately.5)Determine the volume of reagents that make up each of the above solutions according to thefollowing formula:Bottom/Top layer - 2X Iscove's 5ml X n sample pairs (5) = 25 mlFBS - 1ml X n sample pairs (5) = 5ml100X Glutamine .1 ml X n sample pairs = 0.5 ml1.3% Noble Agar - 5ml X n sample pairs = 25mlpour these volumes into a 50 ml conical and separate the total volume in 1/2 into one tube for the bottom and the other for the top**Do Not add the Agar until you are just ready to pour, so separate the total (without the agar) into a bottom and top tubes (the volume of agar that will be added to each will be12.5ml)Cell Layer media - 2X Iscove's 2 X n = 10ml1X Iscove's 4 X n = 20mlFBS 1 X n = 5ml100X glutamine 0.08 x n = .4 mlNoble agar 2 X n = 10ml (again do not add this until ready to pour)6)Pour 12.5 ml of 1.3% Noble agar to the bottom layer tube, mix thoroughly and pipette 2.5 mlto each of 8 plates, place in 37° C incubator7)Trypsinize cells, collect disattached cells and spin down, rususpend pellet in 5ml of 1XIscove's + 10% FBS for counting. Determine the conc of cells in cells/ml and then calculatethe volume of media that will yield 2 X 104 cells (one sample pair or n = 2 X 104 cells, or 1 X 104 cells/ 6cm plate)8)Add volume for 2 X 104 cells in a 15 ml Falcon tube containing 1 ml of 1x Iscove's media.Do this for n samples ( in this case 4 Falcon tubes, 2 control, 2 experimental)9)Add the volume of agar calculated for the cell layer to the tube containing the cell layersolution and mix thoroughly and add 9ml of the cell layer solution to each of the four Falcon tubes and mix thoroughly.10) Remove plates from incubator (bottom layer has solidified at this point) and add 5ml fromeach Falcon tube to each plate and allow to solidify for 30 min at RT.11)Add the last 12.5 ml of agar to the tube containing the top solution, mix throughly and pipette2.5ml to each plate.12)Place plates in incubator and remove when colonies can be seen with naked eye, (timingdepends of the tumorgenicity of the cell line but typically is around two weeks.13)To count colonies, take a digital picture of each 6cm plate by placing the plate on a light boxand using a digital gel photography set up. Print out a picture of each plate and manually count the number of colonies per plate. Determine the average number of colonies per plate for both control and experimental groups。
白芨水提物对人肝癌HepG2细胞增殖的影响
白芨水提物对人肝癌HepG2细胞增殖的影响令狐浪;李成龙;姚晓东【摘要】目的:研究白芨水提物对人肝癌HepG2细胞增殖的影响.方法:使用水提醇沉法提取白芨粗多糖,同时保留有机小分子物质部分;采用CCK8试剂检测不同浓度的两部分提取物对HepG2细胞存活率及生长曲线的影响;倒置显微镜观察提取物对HepG2细胞形态的影响,以及soft agar法检测提取物对HepG2细胞克隆形成的影响.结果:与对照组相比,白芨水提物均能降低HepG2细胞的存活率和增殖能力,并与浓度呈正相关,其中多糖和有机小分子物质的半数抑制浓度(IC50)分别为65.99μg/mL和52.62μg/mL;此外,白芨水提物作用后改变了细胞形态,并能抑制HepG2细胞的克隆形成能力.结论:白芨水提物中的多糖和有机小分子物质均能抑制HepG2细胞的增殖作用.【期刊名称】《中国民族民间医药》【年(卷),期】2018(027)023【总页数】4页(P29-32)【关键词】白芨;水提物;HepG2细胞;细胞增殖【作者】令狐浪;李成龙;姚晓东【作者单位】遵义医学院药学院, 贵州遵义 563006;遵义医学院药学院, 贵州遵义563006;遵义医学院药学院, 贵州遵义 563006【正文语种】中文【中图分类】R963白芨是一种珍稀名贵中药材，为兰科植物白芨(Bletilla striata)的干燥块茎，其味苦、甘、涩，归肝、肺、胃经，具有收敛止血、消肿生肌等功效[1]，野生品主产于贵州、四川和湖南等地，已被列为国家濒危珍稀植物保护名录[2]。
药理学研究表明，白芨具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌和促进伤口愈合等作用[3]。
近年来，白芨在抗肿瘤方面时有报道[4-6]，其主要活性成分为大量含有的多糖类物质。
白芨中的主要化学成分有多糖类、菲类、联菲类、联苄类、甾体和三萜类等物质。
菲类化合物是目前报道从白芨块茎中分离得到的较多的一类化学成分，该类化合物芳环上的取代基主要有羟基、甲氧基和对羟苄基，是白芨中的主要活性成分，联菲类化合物主要有白芨联菲A、B、C和白芨联菲醇A、B、C[7-9]。
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1)配制%和%的琼脂糖，高压灭菌后置于55℃水浴中，使其保持融化状态。
2)配含20%FBS、2×抗生素的2×RPMI 1640培养基，37℃预热。
3)灌下层胶：%的琼脂糖胶与2×培养基1:1混合，加入到6孔板中，每孔3ml，
室温放置待其凝固。
4)等待下层胶凝固过程中消化B16 con shRNA与B16 Myo7a shRNA稳转细胞，
计数，用无血清培养基调整浓度为5×104/ml，每孔用100μl细胞，设3个平行孔。
5)下层胶凝固后灌上层胶：%的琼脂糖胶与2×培养基1:1混合(温度约40℃左
右)，加入100μl细胞悬液，即5000个细胞，混匀，加入孔板中，每孔3ml。
培养，约2-3周收细胞，%结晶紫染色，计数并比较两组克隆形6)37℃ 5% CO
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成情况。