致病菌检验-副溶血性弧菌.
副溶血性弧菌
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嗜盐性试验培养基
成分
蛋白胨 氯化钠 蒸馏水
2g
按不同量加
100mL
供碳氮源、维生素和生长因子 控制弧菌生长情况（7%生长最旺盛）
pH7.7
制法 配制2%蛋白胨水，校正pH， 共配制3瓶，每瓶100mL。 每瓶分别加入不同量的氯化钠： (1)3g；(2)7g；(3)10g。 待溶解后分装试管。 121℃高压灭菌15min。
2. 本菌嗜盐畏酸，若盐浓度低于0.5%则不生长，pH值为 8.0—8.5。
3. 本菌对酸较敏感，当pH6以下即不能生长，在普通食醋中
4. l一3min即死亡。
5. 分解葡萄糖，产酸不产气，不分解乳糖、蔗糖。
6. 在固体培养基上菌落常隆起，圆形，表面光滑，湿润。在 3％一3．5％含盐水中繁殖迅速，每8～9min为一周期。 对高温抵抗力小，50℃ 20 min；65℃ 5 min 或80℃ 1 min 即可被杀死。本菌对常用消毒剂抵抗力很弱，可被低浓度 的酚和煤酚皂溶液杀灭。
凝固剂
返回
3%氯化钠三糖铁琼脂
供碳氮源、维生素和矿物质
可发酵糖类，其产酸时通过酚红指示剂测出， 酸性呈黄色，碱性呈红色
较高含量可维持均衡的渗透压 硫代硫酸钠可被某些细菌还原为硫化氢，
与硫酸亚铁中的铁盐生成黑色硫化铁
凝固剂
此 斜菌 面的 颜反 色应 不为 变底 或层 红变 色黄 加不 深变 ，黑 有， 动无 力气 。泡
组员： 李铭艳（食品国标） 黄敏慧（进出口食品） 刘伟 （PCR定量检测） 刘建焕（ELISA快速检测）
概述
1. 副溶血性弧菌属弧菌科，是一种嗜盐性细菌。是 一种生活在近海的海洋微生物，深海一般未发现， 尤其是在洗浴者和海产加工工人的伤口中。
穗进口金枪鱼检出副溶血性弧菌 可致腹痛
穗进口金枪鱼检出副溶血性弧菌可致腹痛生吃金枪鱼有副溶血性弧菌性食物中毒的危险。
何建摄副溶血性弧菌检测结果呈阳性，易引起腹痛呕吐脱水意识不清等症记者昨天从广东检验检疫局获悉，近日，广州白云机场检验检疫部门从一批进口鲜黄鳍金枪鱼中检出副溶血性弧菌阳性，这是广东检验检疫部门首次在可以生食的进口水产品中检出致病菌。
副溶血性弧菌（Bibrio Parahemolyticus）食物中毒也称嗜盐菌食物中毒，是进食含有该菌的食物所致，主要翻版海产品。
临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。
主要病理变化为空肠及回肠有轻度糜烂，胃粘膜炎、内脏（肝、脾、肺）淤血等。
临床表现潜伏期自1小时至4天不等，多数为10小时左右。
起病急骤，常有腹痛、腹泻、呕吐、失水、畏寒及发热。
腹痛多呈陈发性绞痛，常位于上腹部、脐周或回盲部。
腹泻每日3～20余次不等，大便性状多样，多数为黄水样或黄糊便。
约2%～16%呈典型的血水或洗肉水样便，部分病人的粪便可为脓血样或粘液血样，但很少有里急后重。
由于吐泻，患者常有失水现象，重度失水者可伴声哑和肌痉挛，个别病人血压下降、面色苍白或发绀以至意识不清。
发热一般不如菌痢严重，但失水则较菌痢多见。
近年来国内报道的副溶血弧菌食物中毒，临床表现不一，可呈典型、胃肠炎型、菌痢型、中毒性休克型或少见的慢性肠炎型。
本病病程自1～6日不等，可自限，一般恢复较快。
热点专题推荐：食品安全没保障明天我们还能吃什么？治疗和预防㈠支持及对症治疗脱不者需输入生理盐水及葡萄盐水，或口服补液盐，以纠正失水。
血压下降者，除被补充知容量，纠正酸中毒等外，可酌用血管活性药。
㈡抗菌药物轻者患者可不用抗菌药物，较重者可给复方新诺明或庆大霉素、阿米卡星和诺氟沙星等喹诺酮类抗菌药物。
据介绍，该批金枪鱼由广州某贸易有限公司申报，从东南亚某国进口，重90公斤，货值720美元。
货物到达机场后，检验检疫部门立即对其取样送实验室检验，货物则运抵冷库，等待实验结果。
副溶血性弧菌检验
01
02
03
采用适当的生物安全防护措 施，如穿戴防护服、戴手套
、口罩等。
对实验废弃物进行妥善处理 ，防止交叉污染和环境污染
。
04
05
定期对实验室进行生物安全 检查，及时发现并消除安全
隐患。
废弃物处理与环保要求
建立废弃物处理制度，对实 验废弃物进行分类收集和处 理。
04
遵守环保法规和相关标准， 确保实验室废弃物处理符合 环保要求。
副溶血性弧菌检验
汇报人：XX
• 引言 • 病原学特性 • 检验方法与步骤 • 临床意义与解读 • 实验室质量控制与安全管理 • 研究进展与展望
01
引言
目的和背景
了解副溶血性弧菌的 生物学特性及致病机 制
提高对副溶血性弧菌 感染的防控意识和能 力
掌握副溶血性弧菌的 检验方法和诊断标准
副溶血性弧菌概述
对实验人员进行定期培训 ，提高其专业技能和质量 控制意识。
对实验仪器进行定期维护 和校准，确保其处于良好 状态。
对实验数据进行统计分析 ，及时发现并解决问题。
采用标准化的实验方法和 操作程序，减少实验误差 。
生物安全管理与防护
对实验人员进行生物安全培 训，提高其生物安全防护意
识。
建立生物安全管理制度，明 确实验室人员的食品卫生管理，防止海产品污染；避 免食用未经煮熟的海产品；加强个人卫生 习惯，饭前便后洗手；对于食品加工人员 ，应定期进行健康检查，防止带菌者污染 食品。
05
实验室质量控制与安全管理
实验室质量控制措施
建立完善的实验室质量管 理体系，包括质量手册、 程序文件、作业指导书和 记录等。
抵抗力与传播途径
抵抗力
副溶血性弧菌标准的检验方法
副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝类中的海洋性细菌，为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季节的沿海地区，经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒。
在非沿海地区，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。
为保障食品卫生质量和食用安全，根据副溶血性弧菌的特性，进行下列检验，以便鉴别诊断。
第一节副溶血性弧菌标准的检验方法一、检验方法（一）操作步骤1. 分离培养：首先称取样品25g，加225mL3.5％灭菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，接种氯化钠琼脂平板和嗜盐性琼脂平板各一个，同时取10mL加入100mL增菌液中，放37℃8~16h培养后，涂上述平板进行分离，37℃培养18~24h取出观察，挑取可疑菌落，转种3.5％氯化钠三糖铁斜面，37℃、24h观察结果。
2. 涂片镜检：将三糖铁培养基上反应可疑者即底层变黄（葡萄糖产酸不产气）、上层斜面不变（乳糖、蔗糖不分解）、有动力、不产生硫化氢，进行革兰氏染色镜检形态。
3. 嗜盐性试验：将上述可疑培养物分别接种不同含量的盐胨水（0％，3％，7％，10％）于37℃24h培养后观察生长情况，在无盐和10％盐的胨水中不生长，在3％和7％盐的胨水中生长良好者，继续进行下列有关试验。
4. 生化试验：分别接种下列各类生化培养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、V-P，赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢及溶血性试验，放37℃培养，除V-P、靛基质和甲基红试验培养48h后加试剂观察外，其他均在24h观察结果。
5. 动物试验：将上述符合各类反应的副溶血性弧菌，接种3.5％氯化钠胨水，经37℃、16~18h培养后，小鼠腹腔注射0.3mL，观察2~3d，将死亡小鼠进行解剖作分离培养。
（二）检验程序图6-1 副溶血性弧菌检验程序二、结果分析判定及注意事项（一）样品处理采样时应注意首选准备好灭菌用具及容器，以无菌手续取有代表性的样品，样品必须尽快送检，不宜存放时间过长，副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快，但不适于低温生存，在寒冷的情况下容易死亡，防止待检材料冷冻，以免影响检验结果。
副溶血性弧菌检验-检验操作程序及要点-微课件
副溶血性弧菌检验 ——检验操作程序及要点
目录页
CONTENTS PAGE
检验操作程序及要点
— 2—
副溶血性弧菌检验—检验程序及操作要点
检验程序及操作要点-1
• • • • 流程图 增菌 分离 纯培养
— 3—
检验程序及操作要点
微生物学检验
依据GB 4789.7-2013《食品安全国家标
试述副溶血性弧菌在TCBS琼脂平板上的典型菌落特征
— 11 —
智慧职教 /portal/
校本资源库 / 参考网站： /
分离 纯培养
初步鉴定
结果与报告
确定鉴定
定性 定量
— 5—
副溶血性弧菌检验—检验操作程序及要点
检验程序及操作要点流程图源自副溶血性弧菌检验—检验操作程序及要点
— 6—
检验程序及操作要点
增菌
无菌操作 称量或量取 均质
液态样品，不需均质，振荡混匀即可；
鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃；
副溶血性弧菌检验—检验操作程序及要点
— 8—
检验程序及操作要点
纯培养
挑取 3 个或以上可疑菌落
副溶血性弧菌检验—检验操作程序及要点
— 9—
检验程序及操作要点
初步生化鉴定
确定生化鉴定
革兰氏染色试验 氧化酶试验 动力试验
三糖铁（TSI）试验 嗜盐性试验
副溶血性弧菌检验—检验操作程序及要点
— 10 —
贝类取全部内容物，包括贝肉和体液； 甲壳类取整个动物，或者动物的中心部 分，包括肠和鳃。
选择性增菌液
及时检验 副溶血性弧菌检验—检验操作程序及要点
— 7—
副溶血性弧菌检测
副溶血性弧菌的分布与传播
分布
副溶血性弧菌主要分布在近海岸的海 水、海底沉积物和鱼贝类等海产品中 ，尤其在温带和亚热带地区的沿海水 域更为常见。
传播
副溶血性弧菌主要通过食用被污染的 海产品，尤其是生的或未煮熟透的鱼 、贝类等传播给人类。此外，也可通 过直接接触带菌的水或食物传播。
副溶血性弧菌的致病性
结果报告
根据检测结果，撰写并提交检测报告。
04 副溶血性弧菌检测的应用 与意义
在食品安全领域的应用
食品生产过程监控
副溶血性弧菌检测是食品安全监 控的重要环节，用于确保食品在 生产、加工和储存过程中的卫生
安全。
食品质量评估
通过检测食品中副溶血性弧菌的数 量和种类，评估食品的质量和安全 性，确保消费者健康。
提供科学决策依据
副溶血性弧菌检测数据可为政府和相关部门提供科学决策依据，促进 食品安全、环境保护和公共卫生领域的政策制定和实施。
05 副溶血性弧菌检测的挑战 与展望
当前面临的挑战
检测方法的局限性
目前常用的副溶血性弧菌检测方法，如培养法、免疫学方法和分子生物学方法，存在灵敏 度不高、特异性不强、操作繁琐等问题，难以满足快速、准确检测的需求。
分离培养法具有较高的特异性，但检测时间较长，且对操作人员的技术要求较高。
免疫学检测方法
免疫学检测方法利用抗体与抗原的特 异性结合来检测副溶血性弧菌，包括 间接免疫荧光法、酶联免疫吸附试验 等。
免疫学检测方法具有快速、简便的优 点，但可能出现假阳性或假阴性的结 果。
分子生物学检测方法
分子生物学检测方法利用DNA或RNA的特异性序列来检测副溶血性弧菌，如聚合酶 链式反应（PCR）、基因芯片等。
检测规范
副溶血性弧菌的快速检测技术
3、多重PCR
结果显示，所有的V.p都扩增出tl基因，tl 基因是V.p特异的；54％的V.p扩增出tdh基因； 只有38.73％的V.p扩增出trh基因;该法灵敏度 38.73 V.p trh ; 高，能把10g牡蛎培养肉汤里10～100个V.p 检测出来。与其他常规生化方法相比，多重 PCR更快速，仅8h就能完成检测，结果更为准 确、可靠，而且还可改进成定量竞争PCR，对 标本中靶序列进行定量。
3、多重PCR
由于不是全部副溶血性弧菌都含有tdh基因 或trh基因，所以只针对tdh或trh的单一PCR， 有时会漏检。多重PCR(multiplex-PCR)能全 PCR(multiplex-PCR) 方位高效率地检测V.p。 Bej白等针对tl、tdh、trh设计不同的引物 对，在同一PCR反应体系内同时扩增tl、tdh、 trh。
总结
与传统方法相比较，PCR法更加快速、 灵敏，基本满足了快速检测的要求，但是其 技术含量较高，试剂费用都比较高，而且一 般检测时间也还是要6-8小时左右，离即时 检测的要求还有一定距离，随着分子生物学 和科技水平的不断提高，更加准确、可靠、 方便、快速、经济、安全的检测方法将是食 品安全检测的发展方向。
参考文献
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副溶血性弧菌致病性和检测方法研究
doi :10.3969/j.issn.1002-7386.2022.22.034·综述与讲座·副溶血性弧菌致病性和检测方法研究进展陈媛媛 王亚男 刘士朋项目来源:河北省医学研究重点课题(编号:20211149)作者单位:100029 北京市,中日友好医院(陈媛媛);河北省宁晋县医院(王亚男);河北医科大学公共卫生学院环境与人群健康重点实验室(刘士朋)通讯作者:刘士朋 E⁃mail:17100880@ 【摘要】 本文对副溶血性弧菌的生物学性状、致病性特点、污染食品规律、食物中毒事件、检测标准等进行综述,重点介绍了溶血毒素和检测方法,提出预防副溶血性弧菌食物中毒5要点和关键措施,以期更好地预防副溶血性弧菌食物中毒的发生。
【关键词】 副溶血性弧菌;食物中毒;耐热性溶血毒素;耐热性溶血毒素相关溶血毒素;检测标准【中图分类号】 R 378.3 【文献标识码】 A 【文章编号】 1002-7386(2022)22-3491-05Study on pathogenicity and detection method of Vibrio parahaemolyticus CHEN Yuanyuan ∗,WANG Yanan ,LIU Shipeng.∗China⁃Japan Friendship Hospital ,Beijing 100029,China【Abstract 】 This article systematically reviews related aspects in Vibrio parahaemolyticus (VP ),including biological characteristics ,pathogenic characteristics ,contaminated food conditions ,food Posisoning incidents detection standard ,etc.,focusing on hemolytic toxins and detection methods.Five key points for preventing VP⁃related food poisoning and treatment measures are proposed aiming to to better prevent the occurrence.【Key words 】 vibrio parahaemolyticus ;food poisoning ;thermostable direct hemolysin ;thermostable related hemolysin ;testing standards 副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus)是一种常见的病原菌,主要栖息在海水中,存在于近海海水、海产品及盐渍食品中。
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（ 缺编：K2 、 K14 、K17、 K35、 K62）
血清分型：所有副溶血性弧菌的H 抗原均相同，但是O 抗
原和K 抗原存在差异，以13种O抗原及65种K抗原将其分为 13个群和845个型。
副溶血性弧菌的流行病学
• 1、传染源 传染源为病人，集体发病时往往仅少数病情严重者 住院，而多数未住院者可能成为传染源，但由于病人仅在疾病初 期排菌较多，其后排菌迅速减少，故不至因病人散布病菌而造成 广泛流行。 • 2、传播途径 本病经食物传播，主要的食物是海产品或盐腌渍 品，常见者为蟹类、乌贼、海蜇、鱼、黄泥螺等，其次为蛋品、 肉类或蔬菜。进食肉类或蔬菜而致病者，多因食物容器或砧板污 染所引起。 • 3、易感者 男女老幼均可患病，但以青壮年为多，病后免疫力 不强，可重复感染。本病多发生于夏秋沿海地区，常造成集体发 病。近年来沿海地区发病有增多的趋势。
来源和传播途径
• 分布极广，主要分布在海水和水产品中，我国 华东地区沿岸的海水的副溶血性弧菌检出率为 47.5%~66.5%，海产鱼虾的平均带菌率为 45.6%~48.7%，夏季可高达90%以上。出了海产 品以外，畜禽肉、咸菜、咸蛋、淡水鱼等都发 现有副溶血性弧菌的存在。 • 海水是本菌的污染源，海产品、海盐、带菌者 等都有可能成为传播本菌的途径，另外有肠道 病史的居民、渔民带菌率偏高，也是传染源之 一 。
预防措施
• 对海产品赢特别注意操作，加工前用消毒 水洗干净，接触过海产品的用具要洗刷干 净； • 最好不吃凉拌菜，若吃充分洗净，活加醋 拌 • 严格执行生熟食品分开 • 剩菜饭，食前要回锅热透
致 病 菌 副溶血性弧菌 检 验
一.副溶血性弧菌的概述
• 副溶血性弧菌（Bibrio Parahemolyticus）， 进食含有该菌的食物致可食物中毒，也称嗜 盐菌食物中毒，主要是海产品。临床上以急 性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要 症状。本病多在夏秋季发生于沿海地区，常 造成集体发病。近年来由于海鲜空运，内地 城市病例也渐增多。此菌对酸敏感，在普通 食醋中5分钟即可杀死；对热的抵抗力也较 弱。
菌体为多形态杆菌 或 稍弯曲弧菌
2、培养特性 需氧或兼性厌氧 嗜盐，在2~３%NaCL培养基中生长最好，无盐或食 盐>11%不能生长。 最适温度37℃，pH7.7-8.0 在固体培养基上菌落呈圆形凸起，灰白色、混浊不透 明，表面光滑，较湿润，边缘不整齐。 在血平板上可见溶血环。 在肉汤、蛋白胨水等培养基中呈现混浊，表面形成菌
膜
副溶血性弧菌在不同培养基菌落特征如表9-10
3、生化特性
分解葡萄糖产酸不产气，不分解乳糖，蔗糖。 H2S（－）、V-P（－）、靛基质（+）、精氨酸（－）
甲基红（+）、赖氨酸（＋）、溶血＋/ 具体生化特性见表9-11
4、抗原结构
O抗原：O1~O13
H抗原： K抗原：K1~K71
13种。
• 本菌存活能力强，在抹布和砧板上能生存1个月以上， 海水中可存活47天。 • 中毒食品主要是鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品， 其次为咸菜、熟肉类、禽肉、禽蛋类，约有半数中毒 者为食用了腌制品后。中毒原因主要是烹调时未烧熟 煮透或熟制品被污染．
副溶血性弧菌检验
二、生物学特性 1、形态与染色 革兰氏阴性无芽胞多形态杆菌或 稍弯曲弧菌 ，有时呈棒状、甚至球状、 丝状等。单端鞭毛。无芽胞、无荚膜。