2000年版中国药典 《细菌内毒素检查法》
药典三部版通则细菌内毒素检查法
药典三部版通则细菌内毒素检查法标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
细菌内毒素检查法-动态浊度法
２ 试 验试 剂
２ ． １ 内毒 素标 准 品 细 菌 内毒 素 标 准 品 是 保 证 试 验
表示 ） 。 为人 用 按 规定 的 给 药途 径 不 发 生 任 何 临 床 每ｋ ｇ体 重 每 ｈ最 大 可 接 受 的 内毒 素 剂 的平行 与重复 性 的 重 要 参 照标 准物 质 ， 主要 分 为 工 作 不 良反 应 时 ，
中 图分 类 号 ： Ｒ ９ ２ ７ ． １ ２
细 菌 内毒素 检 查 法 也 称 鲎 试 验 法 ， 用 来 判 定 供 试 可满 足 于动 态浊度 法 检测需 要 。 品中 内毒素 含量 的 限量是 否符 合规 定 的分析 方 法 。 目
前， 国内 外 药 典 收 载 的 有 凝 胶 法 、 浊度 法 和显 色法。
成凝 固蛋 白， 在 产生 凝胶 过程 中发 生 浊 度变 化 ， 用 浊度 ３ ． １ 内毒 素 限 值 （ ， Ｊ ） 的确 定 有 两 种 方 法 可 以确 定 ） Ｊ ： ①依《 中国药典 》 规定 ： 《 中国药 典 》 仪检测 反 应混 合物 的浊 度 到达某 一 预先 设 定 的 吸光 度 内毒 素 限值 （ 所需要 的反 应 时 间 ， 或 是 检 测 浊 度 增 加 速 度 的方 法 。 此 方法 灵 敏度 高 ， 操作简单 ， 检 测 范 围广 （ ０ ． ０ ０ ６～３ ０ ０
Ｅ Ｕ ／ ｍ １ ） 。
２ ０ １ ０年版 中有 规 定 检 查 细 菌 内 毒 素 项 的 化 学 药 ４ ２ ４ 个， 生 物制 品 ３ ９个 品种 的 正 文 可 以 查 到 相 应 的 值 。
② 根据 人 的最 大 注射 剂 量 ： 计 算 公 式 为 Ｌ： Ｋ ／ Ｍ， Ｌ为 供 试 品 的 细 菌 内毒 素 限 值 （ 以 Ｅ Ｕ ／ ｍｌ 、 Ｅ Ｕ ／ ｍ ｇ 、 Ｅ Ｕ ／ Ｕ
中国药典细菌内毒素检测方法
检测细菌内毒素的方法
1、热原检查
通常以家兔作为试验介质，检查在规定时间里观察家兔的体温变化，反应了热原物质引起哺乳类动物的体温反应过程。
2、凝胶法
通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法。
3、光度法
浊度法
利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。
显色基质法
利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。
细菌内毒素的检测
细菌内毒素的检测摘要:本文研究了注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠细菌内毒素的检测。
本文是在通过调查大量的科技文献的基础上，按照中国药典2000版二部附录XI E细菌内毒素检查法所规定的试验方法而进行的。
实验方案是根据注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠的细菌内毒素限度，并结合现有的实验条件而确定的。
注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠(Cefoperazone Sodium and Tazuobatanna)为头孢类抗生素头孢哌酮与β-内酰胺酶抑制剂他唑巴坦钠组成的复方注射用无菌粉针，在临床上用于治疗下呼吸道感染、泌尿生殖系统感染、腹腔盆腔感染、以及其他感染。
质量标准[国家食品药品监督管理局标准（试行）YBH0538 2003]中控制热原的方法仍为家兔热原法，鉴于家兔热原法有影响因素复杂、操作繁琐、检验成本高等缺点，而用细菌内毒素检查法来控制产品中的热原具有操作简便快捷、检验灵敏度高等优点[1]。
为了在大范围内开展本品的细菌内毒素检查，我们对本品进行了细菌内毒素检查凝胶法的研究。
本品细菌内毒素限值为0.15Eu/ml，在1.667至0.400mg/ml的浓度范围内，本品对细菌类毒素与鲎试剂的反应无干扰。
我们对3批样品进行了检验，并与家兔热原法进行对比，结果一致都为阴性，认为本品可用细菌内毒素检查凝胶法代替家兔热原法。
关键词：注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠细菌内毒素鲎试剂灵敏度复核试验干扰预试验干扰实验热原检查0引言细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白（Protein）的复合物，它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。
其化学成分广泛分布于革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、布氏杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌、沙门氏菌等）及其它微生物（如衣原体、立克次氏体、螺旋体等）的细胞壁层的脂多糖，其化学成份主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。
细菌内毒素检查法及应用进展
细菌内毒素检查法及应⽤进展临床经验药品注射剂的热原检查时保证药品安全的重要检验项⽬。
家兔法（PT 法）检查热原的⽅法因耗时长、不经济、难以标准化等很多局限性使越来越多品种的热原检查项被细菌内毒素检查法（BET 法）所取代。
BET 是⼀种体外热原实验法，该法因其快速、灵敏、经济、重现性好等优点在国内外得到了⼴泛的应⽤。
因此检测细菌内毒素在药品质量控制、制药⼯艺和临床治疗监测中具有重要意义。
本⽂就细菌内毒素检查法及其应⽤进展作⼀综述。
1细菌内毒素检查法的国内外发展简述BET 最早由美国学者Dr.Levin 和Bang ⾸先建⽴，作为法定的检查⽅法。
1968年Dr.Levin 和Bang 发现阿⽶巴样⾎细胞含有⼀种物质，当和极⼩量的内毒素混合时就变成胶质，这个发现发展⾄今形成了现在的鲎试验法。
最早在1980年被美国药典20版（USPXX ）第⼀次正式收载，随后EP （1987版）BP Ⅷ1990年增补本，JP1991年改正版相续收载了此法。
到USPXXⅣ（2000版）已有580多种注射⽤药品采⽤了此法，仅有30余种药品因⼲扰因素难以排除⽽采⽤传统的热原法。
与国外相⽐，我国在这⽅⾯的研究还存在着较⼤的差距，发展较慢。
最早于1988年卫⽣部颁布《细菌内毒素检查法》和鲎试剂标准，中国药典（1995版）正式收载，规定13个品种使⽤BET 法。
到中国药典（2005版）细菌内毒素检查品种增⾄168种，BET 法正式收载光度测定法。
随着2010版中国药典的颁布和实施，它将被更⼴泛的应⽤于各种药品的质量控制。
2细菌内毒素检查的⽅法2.1鲎试验法鲎试验法⽬前有凝胶法，浊度法（⽐浊法），显⾊基质法(⽐⾊法)2.1.1半定量测定-凝胶法凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产⽣凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的⽅法，是⼀种限量法，是各国药典细菌内毒素检查的⾸选⽅法。
此法操作简单，经济，不需要专⽤测定设备，结果可靠，重复性好。
其缺陷为特异性不强，精密度、定量性较差，不能直接反映药品中内毒素量值。
再论细菌内毒素限值的确定
再论细菌内毒素限值的确定中国药品生物制品检定所北京 100050王思理张国来蔡彤国家药典委员会北京 100061王平张莜红中国药典2000年版已经正式出版，并将于2000年7月1日正式执行。
细菌内毒素检查法应用指导原则及附件细菌内毒素定量检测法（动态浊度法和显色基质法）均被列入新版药典。
指导原则中对细菌内毒素限值的确定有非常明确清楚的规定："细菌内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L＝K/M式中 L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/u表示。
K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg·hr)表示。
注射剂，K＝5EU/(kg·hr)；其中放射性药品注射剂，K＝2.5 EU/(kg·hr)；鞘内用注射剂，K＝0.02 EU/(kg·hr)。
M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml/ (kg·hr)、mg/(kg·hr)、u/(kg·hr)表示，人均体重按60kg计算，注射时间小于1小时，按1小时计算。
按人用剂量计算L值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际作必要调整。
应该说，今后国内对细菌内毒素限值（L）的确定可以统一了。
然而，从目前发表的文章和笔者审核的成果报告等都发现在药品的细菌内毒素检查法建立时对关键性的细菌内毒素限值（L）的确定尚存在不少问题。
主要问题是对"M为人用每公斤体重每小时最大剂量"作了如下的解释：其一、把最大剂量解释成"热原检查法剂量"。
例如："注射用硝普钠中细菌内毒素的检查注射用硝普钠的内毒素限值（L）：根据药品内毒素限值的计算方法，K=5.0EU/Kg，注射用硝普钠热原检查剂量M=1mg/KgL=K/M=(5.0EU/Kg)/(1mg/Kg)=5EU/mg。
《中国药典》9251 细菌内毒素检查法应用指导原则
《中国药典》9251细菌内毒素检查法应用指导原则《中国药典》9251细菌内毒素检查法应用指导原则包括以下几个方面：
1.细菌内毒素检查法主要用于临床诊断中，可以辅助判断细菌感染的程度和危险程度，对临床治疗方案的选择和预后评估具有重要意义。
2.在应用细菌内毒素检查法时，应考虑到各种药品的特性和使用方法，以确保结果的准确性和可靠性。
3.在进行细菌内毒素检查时，应严格遵守操作规程，确保实验过程的标准化和规范化。
4.对于细菌内毒素的检测结果，应结合其他实验室检查结果和临床表现进行综合分析，以得出正确的诊断结论。
以上信息仅供参考，建议查阅《中国药典》获取更全面准确的信息。
细菌内毒素检测方法
（85）细菌内毒素检查法✹本章内容已与《欧洲药典》和/或《日本药局方》相应的内容统一，不一致的部分用符号（✹✹）标记。
✹细菌内毒素检查法（BET）系利用鲎试剂（美洲鲎或中国益）检测或量化革兰阴性菌产生的细菌内毒素。
可采用三种技术进行细菌内毒素检查：基于凝胶形成的凝胶法；基于内源性底物裂解后浊度变化的比浊法；基于合成胁显色基质复合物裂解后发生颜色变化的显色法。
可采用上述任意一种方法进行检测。
当对测定结果有怀疑或争议时，除另有规定外，以凝胶法测定结果为准。
本法操作过程中应防止内毒素的污染。
器具应按照经过验证的程序将所有玻璃器皿和其他热稳定材料置于干热烤箱中去除热原。
✹①✹通常使用的最低温度和最短时间为250℃加热30分钟。
如果使用多孔板和微量加样器吸头等塑料器具时，只有证明其不含有可检出的内毒素并对试验无干扰方可使用。
（注：本章中的“管”包括微孔板中的孔等所有反应容器。
）试剂和试液试剂是由鲎（美洲鲎或中国鲎）的阿米巴细胞（白细胞）溶解产物制得的冻干品。
这种试剂必须是按照权威机构认定的规程生产的产品。
（注：除内毒素外，鲎试剂也与P葡聚糖反应。
通过消除G因子或抑制G因子反应系统，能够制得不与葡聚糖反应的鲎试剂，此种鲎试剂可用于葡聚糖存在情况下的内毒素检查。
）内毒素检查（BET）用水在检测限内不与鲎试剂产生凝集反应的注射用水或用其他方法制备的水。
鲎测试液将鲎试剂溶解于内毒素检查用水或鲎试剂生产企业推荐的缓冲液中，轻轻混匀。
复溶的鲎试剂须按照生产企业的规定冷藏或冷冻保存。
溶液的制备内毒素标准品贮备液使用经现行WHO国际内毒素标准品标定过的美国药典内毒素标准品配制内毒素标准品贮备液。
按照包装说明书和标签上的规定制备、贮存贮备液。
内毒素的单位用EU表示。
[注：1个美国药典内毒素单位（EU）等于1个国际内毒素单位（IU）]内毒素标准品溶液将内毒素标准品贮备液充分混匀后，用内毒素检查用水进行连续稀释。
为避免因内毒素的吸附而导致失活，配制后的稀释液应尽快使用。
2000版中国药典附录(二部)
二部药典附录Ⅰ A 片剂.................................................................................2～4 Ⅰ B 注射剂..............................................................................5～7 Ⅰ C 酊剂 (8)Ⅰ D 栓剂 (9)Ⅰ E 胶囊.................................................................................10～11 Ⅰ F 软膏剂乳膏剂糊剂.........................................................12～13 ⅠG 眼用.................................................................................14～16 ⅠH 丸剂.................................................................................17～18ⅠJ 植入剂（增订） (19)ⅠK 糖浆剂 (20)ⅠL 气雾剂粉雾剂喷雾剂......................................................21～26 ⅠM 膜剂 (27)ⅠN 颗粒剂..............................................................................28～29 ⅠO 口服溶液剂口服混悬剂口服乳剂.......................................30～31 ⅠP 散剂.................................................................................32～33 ⅠQ 耳用制剂...........................................................................34～35 ⅠR 鼻用制剂...........................................................................36～37 ⅠS 洗剂冲洗剂灌肠剂 (38)ⅠT 搽剂涂剂涂膜剂 (39)ⅠU 凝胶剂 (40)ⅠV 贴剂………………………………………………………………………41～42附录Ⅰ A 片剂片剂系指药物与适宜的辅料混匀压制而成的圆片状或异形片状的固体制剂。
注射用甲泼尼龙琥珀酸钠细菌内毒素检查研究
注射用甲泼尼龙琥珀酸钠细菌内毒素检查研究
孙淑莲;苑庆华;叶志;唐元泰
【期刊名称】《天津药学》
【年(卷),期】2003(15)2
【摘要】目的:对注射用甲泼尼龙琥珀酸钠进行细菌内毒素检查研究,建立检测注射用甲泼尼龙琥珀酸钠中内毒素试验方法.方法:采用中国药典2000年版附录细菌内毒素检查法.结果:注射用甲泼尼龙琥珀酸钠在药液稀释浓度1.5 mg/ml以下时,与TAL试剂反应无干扰因素影响.结论:用细菌内毒素检查法检查注射用甲泼尼龙琥珀酸钠中的内毒素是可行的.
【总页数】3页(P23-25)
【作者】孙淑莲;苑庆华;叶志;唐元泰
【作者单位】天津市药品检验所,天津,300070;天津市药品检验所,天津,300070;天津市药品检验所,天津,300070;天津市药品检验所,天津,300070
【正文语种】中文
【中图分类】R927.12
【相关文献】
1.注射用氢化可的松琥珀酸钠的细菌内毒素检查 [J], 郑丽容;罗群;韦群
2.注射用甲泼尼龙琥珀酸钠不良反应分析与对策研究 [J], 王燕敏
3.注射用甲泼尼龙琥珀酸钠的细菌内毒素检查 [J], 关恺珍;卢丽霞;梁毅
4.痰热清注射液联合注射用甲泼尼龙琥珀酸钠治疗重症哮喘的临床研究 [J], 陈爽;刘浩;林彤彦;穆晓静
5.注射用甲泼尼龙琥珀酸钠联合鼠神经生长因子耳后骨膜下注射治疗突发性耳聋的临床研究 [J], 邢恩东
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E. 细菌内毒素检查法
中国药典2000年版二部附录
本法系用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制得到的内毒素。
以细菌内毒素国际标准品为基准，经过协作标定，使其与国际标准品单位含义一致。
细菌内毒素国家标准品用于标定细菌内毒素工作标准品和标定、仲裁鲎试剂灵敏度。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准进行标定，确定其重量的相当效价。
每1ng工作标准品效价应不小于2EU，不大于50EU，并具备均一性和稳定性的实验数据。
细菌内毒素工作标准品用于鲎试剂灵敏度测定及试验中的阳性对照。
试验准备
试验所用器皿，需经处理，除去可能存在的外源性内毒素，常用的方法是250℃或180℃干烤适当的时间，也可用其它适宜的方法。
试验操作过程应防止微生物的污染。
鲎试剂灵敏度复核
根据鲎试剂灵敏度的标示值(λ<[b]>),将细菌内毒素国家标准品或工作标准品用细菌内毒素检查用水①溶解，在旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成合适的2倍稀释浓度,即2λ<[b]>、λ<[b]>、0.5λ<[b]>和0.25λ<[b]>备用，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟，按“检查法”项下试验,每一稀释液平行做4管,如最大浓度4管均为阳性，最低浓度4管均为阴性，按下式计算鲎试剂灵敏度测定值(λ<[c]>)。
ΣX λ<[c]>＝log<-1>───
4
X为反应终点内毒素浓度的对数值。
当λ<[c]>在0.5～2.0λ<[b]>(包括0.5λ<[b]>和2.0λ<[b]>)时，方可用于细菌内毒素检查并以λ<[b]>为该批鲎试剂的灵敏度。
每批新的鲎试剂在用于试验前都要进行灵敏度的复核。
供试品干扰试验
按“鲎试剂灵敏度复核”项下试验，用供试品的最大有效稀释液将细菌内毒素国家标准品或工作标准品制成2.0λ<[b]>、λ<[b]>、0.5λ<[b]>、0.25 λ<[b]>浓度稀释液。
供试品的最大有效稀释倍数（D）按下式计算：
D＝L／λ<[b]>L为供试品的细菌内毒素限值，EU／ml。
如果有供试品和无供试品测得的鲎试剂灵敏度(λ<[c]>)在0.5～2.0λ<[b]>（包括0.5λ<[b]>
和 2.0λ<[b]>）时，则认为供试品在该浓度下不干扰试验，否则需进行适当处理后重复本试验。
使用更灵敏的鲎试剂，对供试品进行更大倍数稀释，是排除干扰因素的简单有效的方法。
检查法
取装有0.1ml鲎试剂溶液的10×75mm试管（或0.1ml／支规格的鲎试剂原安瓿）4支，其中2支加入0.1ml供试品作为供试品管，1支加入2λ<[b]>内毒素工作标准品溶液0.1ml作为阳性对照管,1支加入细菌内毒素检查用水①0.1ml作为阴性对照管。
将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37±1℃水浴中，保温60±2分钟。
保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
结果判断
将试管从水浴中轻轻取出,缓缓倒转180°时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为(+)；凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为(-)。
供试品两管均为(-)，应认为符合规定；如两管均为(+)，应认为不符合规定；如2管中1管为(+)，1管为(-)，按上述方法另取4支供试品管复试，4管中有1管为(+)，即认为不符合规定。
阳性对照为(-)或阴性对照为(+)，试验无效。
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①细菌内毒素检查用水系指与使用批号鲎试剂4小时不产生凝集反应的注射用水。