细胞毒性试验总结
细胞毒性检测方法总结!
细胞毒性检测方法总结！细胞毒性(cytotoxic)是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。
有时需要进行特定物质细胞毒性的检测，比如药物筛选。
细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测，常用以下几种方法：MTT、XTT法：利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行转化，然后通过酶标仪进行检测一.LDH的方法：通过检测细胞培养上清中LDH的酶活性，来检测细胞毒性其它酶方法：如检测上清中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性等细胞增殖能力分析试剂原理：正常细胞代谢旺盛，其线粒体内的琥珀酸脱氢酶，可将四唑盐类物质（如MTT、XTT、WST-1等）还原为紫色的结晶状的物质，沉积在细胞周围，然后通过酶标仪读取OD值，从而检测到细胞增值状态优点：1）快速：96孔培养板形式，可进行高通量检测。
2）灵活：可直接通过显微镜观察，也可通过酶标仪进行定量检测。
二.荧光素发光法细胞生存能力检测原理：腺苷酸激酶（AK）存在于所有真核和原核细胞的胞浆中，AK具有激活ADP 生成ATP。
当细胞受损后，细胞膜发生破损，AK会释放到培养上清中。
该试剂盒利用荧光素酶和荧光素在ATP作用下可以发光，通过化学发光仪可以定量进行检测。
特点： 1）简单、快速。
2）板式检测，可进行高通量。
三.LDH法细胞毒性检测原理：LDH（乳酸脱氢酶）是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外； LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应形成紫色的结晶物质，可通过500nm酶标仪进行检测。
通过检测细胞培养上清中LDH的活性，可判断细胞受损的程度特点：1）方法简单，安全，不使用放射性物质2）可进行高通量检测。
整理)MTS 细胞增殖及毒性试验
MTS 或者CCK8细胞删殖及毒性考查之阳早格格创做一、所需试剂1、CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay 试剂盒（-20℃躲光保存，4℃保存6周，黄色）（1）MTS：新一代四氮唑蓝盐化合物，即被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还本成有色的甲瓒产品，其颜色深浅与某些敏感细胞株的活细胞数正在一定范畴内呈下度相闭.（2）PES：吩嗪硫酸乙酯，一种电子奇联剂，具备巩固的化教宁静性，那使它可与MTS混同产死宁静的溶液2、Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）（保存条件共上，紫色）（1）WST-8：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-两磺酸苯)-2H-四唑单钠盐（2）1-Methoxy PMS：1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸两甲酯3、药物或者毒素（药物IC50等用到）4、96孔板两、真验步调1、种板（96孔板）（个/孔），先配总管再加样（多算5孔的量去配总管，免得没有敷用）每种处理树立3个副孔（空黑组可1个），加进100μl培植基：（1）细胞删殖真验：树立NC组，处理组，空黑组，6天时间，仄衡每孔1000-2000个细胞（2）毒性或者药物或者搁疗IC50：树立梯度给药组（包罗没有给药组），空黑组，仄衡每孔5000-8000个细胞2、正在37°C，5% CO2的环境下培植（1）删殖：8h或者24h（细胞揭壁时间）,也可种板后直交测第一次，动做基准线，之后每隔24小时检测下一天的细胞量（MTS 每孔加20μl，CCK8加10μl）（2）毒性战药物：培植24h后加进药物培植48小时及以上3、删殖真验每天丈量一次，以100齐培植基：20MTS比率配造总管（CCK8以100:10）4、吸掉96孔板内待测孔内培植基，每孔加进120μl密释后的MTS试剂（CCK8加进110μl）4、正在37°C，5% CO2的环境下孵育1-4个小时（普遍选2h）5、采用波少，MTS选492nm，CCK8选450nm，读与吸光度值，记录截行，以时间为横坐标，每日吸光值/基准值为纵坐标画造细胞死少直线.三、注意事项1、CCK8本理WST-8正在电子载体1-Methoxy PMS的效率下被细胞中的脱氢酶还本为具备下度火溶性的黄色甲瓒产品（Formazan dye）.死成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比2、所有历程没有成爆收气泡，免得对于测光爆收效率3、如果需要以去检测每孔加进25ul 10% SDS末行反应，躲光保存于室温的干盒中最多可保存18小时4、可正在待测孔四面加进PBS预防中围的待测孔液体挥收效率截行.（革新于2018.11）。
医疗器械生物学评价第五部分体外细胞毒性试验
医疗器械生物学评价第 5 局部：体外细胞毒性试验1范围GB/T 16886 的本局部阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。
这些方法规定了以下供试品以直接或通过集中的方式与培育细胞接触和进展孵育；a〕用器械的浸提液，和／或b〕与器械接触。
这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反响。
2标准性引用文件以下文件中的条款通过GB/T 16886 的本局部的引用而成为本局部的条款。
但凡注日期的引用文件，其随后全部的修改单〔不包括订正的内容〕或均不适用于本局部，然而，鼓舞依据本局部达成协议的各方争论是否可使用这些文件的最版本。
但凡不注日期的引用文件，其最版本适用于本局部。
GB/T 16886. 1 医疗器械生物学评价第1 局部：评价与试验〔GB/T 16886.1-2023,idt ISO 10993- 1:1997〕CB/ T 16886. 12-2023 医疗器械生物学评价第12 局部：样品制备和参照材料〔idt ISO 10993-12 :1996〕3术语与定义GB/ T 16886. 1/ ISO 1993-1 中确立的以及以下术语和定义适用于本局部。
3.13.2 阴性比照材料negative control material依据本局部试验时不产生细胞毒性反响的材料。
注：阴性比照的目的是验证背景反响，例如高密度聚乙烯1〕牙科材料的阴性比照物。
阳性比照材料 pos itive control material依据本局部试验时可重现细胞毒性反响的材料。
已作为合成聚合物的阴性比照材料，氧化陶瓷棒则用作注：阳性比照的白目的是验证相应试验系统的反响，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯的阳性比照，酚的稀释液用于浸提液的阳性比照。
2）已用作固体材料和浸提液1)高密度聚乙烯可从美国药典委员会〔Rockvillie, Maryland, USA〕和Hatano 争论所食品和药品安全中心〔Ochiai 729-5 ,Hanagawa.257-Japan〕获得。
关于细胞污染的一些总结和心得
关于细胞污染的一些总结和心得概述凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染，细胞污染不能完全被消除，但能减少其发生的频率和后果的严重性。
细胞污染根据污染源主要可以分为物理性，化学性和生物性污染。
物理性污染的来源、危害及预防：物理性污染常常被人们所忽视或被笼统地归为化学性污染。
物理性污染通过影响细胞培养体系中的生化成分，从而影响细胞的代谢。
培养环境中的物理因素，如温度、放射线、振动、辐射(紫外线或荧光)会对细胞产生影响。
细胞、培养液或其它培养试剂暴露于放射线、辐射或过冷过热的温度中，可以引起细胞代谢发生改变，如细胞同步化、细胞生长受抑制甚至细胞死亡。
通过实验室的合理设计及建立规范的操作规程，可以减少环境中物理因素对细胞的影响。
孵箱应放在温度较恒定的环境中，周围不能放置能引起机械振动的设备，如离心机。
培养液及培养试剂应放在固定的位置，为避免光照试剂不能放在玻璃门的冰箱中，试剂周围不能放同位素。
培养液从冰箱中取出后应在室温中放置一段时间后再进行实验，以避免过冷的温度对细胞的影响。
化学性污染的来源、危害及预防培养环境中许多化学物质都可以引起细胞的污染。
化学物质并不总是抑制细胞的生长，某些化学物质如激素就可促进细胞的生长。
不同细胞对化学物质污染的反应是不一样的。
未纯化的物质、试剂、水、血清、生长辅助因子及储存试剂的容器都可能成为化学性污染的来源。
细胞培养的必需养分，如氨基酸，若浓度超过了合适的范围，也会对细胞产生毒性。
同样，不同细胞系其最佳培养条件下对血清和缓冲液的要求是不一样的，在培养中应严格控制。
玻璃制品清洗过程中残留的变性剂或肥皂(通常残留在瓶盖的内表面)是最常见的化学性污染。
水是唯一一种在凝固时膨胀的化合物。
因此在选择冻存细胞的容器时应考虑到这个因素。
容器因水的膨胀而发生破裂是引起试剂污染的重要原因。
为了避免金属离子、有机分子、细胞内毒素等物质对水的污染，在配制液体，清洗容器时必须使用不含杂质的超纯水。
生物新药的临床前研究方法
生物新药的临床前研究方法生物制药领域广泛应用于制药、医药领域，成为医药行业革命性的发展方向。
生物新药的产生充分体现了生物制药领域的发展和应用。
作为生物新药的关键环节，临床前研究方法的探究和推广对于保障生物新药质量和安全具有非常重大的意义。
一、基本概念临床前研究方法：是指在生物制药生产领域，通过体内或体外试验，对于生产的药物进行评估，判断其安全性、有效性等方面的相关技术和方法。
包括分子生物学、生物化学、细胞学、动物药理学、细胞毒性、免疫毒理、药代动力学等方面的研究技术和方法。
二、技术和方法1、细胞毒性试验细胞毒性试验是在一个细胞培养条件下进行的一系列实验分析。
通过细胞毒性试验，对于生产的药物的毒性评估进行较为全面、准确和可靠的信息收集。
细胞毒性试验是生物制药领域中比较重要的一个环节。
2、药物代谢和消除研究药物代谢和消除研究，是临床前研究方法中比较关键的一个环节。
药物代谢和消除研究可以用来表征药物的生物利用度和清除度，这是药物有效性和毒性的关键因素。
药物代谢和消除的研究方法包括体内动物药代动力学分析，以及体外药物酶筛选和鉴定等。
3、免疫毒理试验免疫毒理试验是在免疫响应和毒性之间进行的一组实验。
通过对于生产的药物进行免疫毒理试验，可以对于其在体内可能引发的免疫系统反应进行准确的预测，为生物药物的开发提供技术支持。
4、生物制品微生物学研究生物制药制品中的微生物学质控，是维护生物新药质量安全的关键一环。
通过生物制品微生物学研究，可以对于生产过程中的微生物污染、不纯和微生物残留等问题进行相关方面提供审核甚至预警。
三、研究领域临床前研究方法是在生物制药领域中最为重要的环节，广泛应用于药物研发生产环节中的各个步骤。
不同领域的生物制药研发生产过程中，需要对于不同的生物新药进行特定的临床前研究方法的研究和探究。
临床前研究方法可以应用于蛋白质生物药品、蛋白质多肽类药物和抗生素类药物等方面；可以应用于新药、复方、口服、注射、外用等多种药品类型。
细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结
细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结实验原理：Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。
其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。
生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。
因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
一、用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。
二、优点：1.使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；K-8法能快速检测；K-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；K-8法的重复性优于MTT 法，MTT 实验生成的formazan 不是水溶性的，需要使用DMSO 等有机溶剂溶解；5.而本方法产生的formazan 是水溶性的，不仅省去了溶解步骤，更因此而减少了该操作步骤带来的误差；K-8法对细胞毒性小，可以多次测定选取最佳测定时间，与MTT 方法相比线性范围更宽，灵敏度更高；K-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。
三、所需设备及仪器：1. 10ul，100-200ul及多通道移液器2. 酶标仪（带有450nm滤光片）3. 96孔培养板4. 二氧化碳培养箱四、方法及步骤：实验一：细胞增殖分析1、制备细胞悬液：细胞计数。
2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数（约1-2×104），每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做4-6个重复。
3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。
4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议将枪头浸入培养液中加入且在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
医疗器械生物学评价体外细胞毒性试验
【分享】医疗器械生物学评价-体外细胞毒性试验什么是体外细胞毒性试验？体外细胞毒性试验是一种在离体状态下模拟生物体生长环境，检测医疗器械及生物材料接触机体组织后所发生的细胞溶解、抑制细胞生长和其他毒性作用的体外试验。
体外细胞毒性试验是医疗器械生物学评价体系中最重要的检测指标之一，几乎也是医疗器械及生物材料临床应用前的必选项目。
哪些产品需要进行体外细胞毒性试验？与人体接触或植入体内的医疗器械都需要进行细胞毒性试验。
与人体接触的部位包括：1）表面：皮肤，粘膜，损伤表面。
2）外部接入：组织/骨/牙，循环血液。
3）体内植入：组织/骨，血液。
体外细胞毒性试验的目的和意义目的：评级医疗器械和生物材料致细胞毒性反应的潜在性，并预测最终生物体应用时的组织细胞反应。
通过体外细胞培养技术，可检测供试品接触细胞后细胞发生生长抑制、功能改变、细胞溶解、死亡或其他毒性反应。
意义：可在短时间内较经济、简便地筛选出批量供试品的细胞毒性，它为动物试验的进行与否提供了先决条件，对新型医疗器械及生物材料的研制和应用提供了重要保证。
体外细胞毒性试验依据的相关标准o ISO 10993-5:2009 Biological Evaluation of MedicalDevices -- Part 5: Tests for in vitro Cytotoxicityo GB/T16886.5-2007医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验，GB/T16886是由ISO 10993转化过来的标准o GB/T 16175-2008 医用有机硅材料生物学评价试验方法o GB/T 14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物试验方法o YY/T0127.9-2009口腔医疗器械生物学评价第2单元试验方法细胞毒性试验：琼脂扩散法及滤膜扩散法细胞系和培养基的选择优先采用已建立的细胞系并从认可的贮源获取。
试验只能使用无支原体污染细胞，使用前应该检测原代培养细胞是否存在支原体。
抗癌药物细胞实验报告
一、实验背景癌症作为一种严重威胁人类健康的疾病，其治疗一直是医学界的研究重点。
近年来，随着分子生物学、细胞生物学等领域的不断发展，越来越多的新型抗癌药物被研发出来。
为了评估这些新型抗癌药物的疗效和安全性，细胞实验成为了一种重要的研究手段。
本实验旨在通过细胞实验研究某新型抗癌药物的活性及其对肿瘤细胞的影响。
二、实验材料与方法1. 实验材料（1）细胞：人肺癌细胞A549、人正常肺上皮细胞HepG2（2）抗癌药物：某新型抗癌药物（以下简称药物A）（3）试剂：细胞培养试剂、细胞毒性检测试剂盒、流式细胞仪等2. 实验方法（1）细胞培养：将人肺癌细胞A549和人正常肺上皮细胞HepG2分别接种于96孔板中，置于细胞培养箱中培养。
（2）药物处理：将A549细胞分为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。
对照组加入等体积的溶剂，低、中、高剂量组分别加入不同浓度的药物A。
（3）细胞毒性检测：在药物处理24小时后，采用细胞毒性检测试剂盒检测细胞活力。
（4）细胞凋亡检测：采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
（5）数据统计分析：采用SPSS软件对实验数据进行统计分析，比较各组间的差异。
三、实验结果1. 细胞毒性检测结果显示，随着药物A浓度的增加，A549细胞的细胞活力逐渐降低，而HepG2细胞的细胞活力基本保持不变。
这说明药物A对A549细胞具有显著的细胞毒性，而对正常细胞影响较小。
2. 细胞凋亡检测结果显示，随着药物A浓度的增加，A549细胞的凋亡率逐渐升高，而HepG2细胞的凋亡率基本保持不变。
这说明药物A对A549细胞具有显著的诱导凋亡作用。
四、实验讨论1. 药物A对A549细胞的细胞毒性作用实验结果显示，药物A对A549细胞具有显著的细胞毒性作用，这可能与其抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡等作用有关。
此外，药物A对正常细胞影响较小，表明其具有较好的安全性。
2. 药物A对A549细胞的诱导凋亡作用实验结果显示，药物A对A549细胞具有显著的诱导凋亡作用，这可能是其治疗肿瘤的重要机制之一。
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（一）实验前应明确的问题1.选择适当的细胞接种浓度。
一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。
但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。
这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。
否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。
2.药物浓度的设定。
一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。
根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。
切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。
3. 时间点的设定。
在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。
4.培养时间。
200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。
5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。
做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。
6.理论未必都是对的。
要根据自己的实际情况调整。
7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。
调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。
对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。
8.避免血清干扰。
用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。
由于试验本底增加，会试验敏感性。
因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。
在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。
（二）实验步骤贴壁细胞：1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
2.5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况.3.5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
4.每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。
若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5.终止培养，小心吸去孔内培养液。
6.每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）悬浮细胞：1）收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 lug/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。
每板设对照（加100ul(储存液100 1640）。
2）置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。
（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）4）离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。
5）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
（三）MTT的配制MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉。
配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。
PBS配方:Nacl 8g，Kcl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，调ph 7.4，定容1L。
（四）关于细胞的接种(铺板)细胞过了30代以后就不要用了,因为状态不好了;培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。
接种时最好按照预实验摸索出的密度接种, 因为细胞密度在10000/ml左右时，所测得的OD值的区间即细胞抑制率（或者增值率）的所呈现的线性关系最好，结果最可信。
如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显，太密细胞可能都会凋亡，因为细胞长的太快营养会不够，最后导致死亡。
且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。
故而MTT细胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。
细胞密度要根据不同细胞的特点来定.如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度，如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度，这样与对照的区别更明显，数据更好。
悬浮细胞每孔的细胞数可达到105,贴壁细胞可为103-104.（五）加入MTT个人认为MTT最关键的是你的细胞数目和你加入真正起作用的的MTT的适当比例，具体细胞数目和真正起作用的的MTT之间的关系确实不好确定，我认为MTT多加一些比少加好一些 MTT的量各家报道不同，一般是过量的，所以10ul即够了。
如果不使用96孔板，培养基超过100ul，MTT按照10%的比例加入.加入MTT以后振荡一下让MTT与培养基混匀，不过这个应该关系不大。
如加入MTT后都有个别孔立即变为蓝黑色，则污染的可能性極大,另外MTT稀釋後加入細胞前還是需要以過濾的方式滅菌為宜.且在加MTT前可以先在镜下观察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是临近的。
因为血清中白蛋白对大部分的药物都有结合效应，所以可以单独将药物和MTT加在一起，看会不会起反应。
如果不起反应，就不用去除含药物的培液，直接加MTT即可。
首先说说我的一点经验：1. 吹打时悬液总量不能太多，达到吸管吸液量的3到4倍，可能比较容易混匀。
10ml的离心管里面最好装3~4ml的悬液：悬液太少容易吹起很多气泡，悬液太多又不容易吹成单细胞悬液。
2. 吸管的吸液量最好在1ml左右：吸液量过多的话，一下吸起很多液体，管中所剩就很少，这样吹打容易起泡，吸液量过少，吹打的力度就不够，吹打就会不均匀。
如果是吸液量1ml 多的吸管，总液量在5ml左右为益3. 吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是吹下去的时候不要离开液面，否则容易吹打出气泡。
4. 吹打次数100左右，就可以吹打均匀了（有人认为加细胞前吹打30－50次基本就差不多均匀了。
加细胞的时候每接种2孔反复吹打3次，每吹打3次后枪头垂悬与细胞悬液中5秒钟，然后再以一定的速度吸取悬液。
）5. 向每孔中用枪头加入细胞时不要太快，否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周边很少，这种不均匀的分散会产生接触抑制，影响细胞的生长。
所以速度不能太快也不能太慢。
我习惯每块板加完后平握手中，向左3下，向右3下，在往返回复3下移动，目的是使得细胞能分散的均匀些。
（铺板技术是MTT 实验的关键，也是基础，一定要练好。
曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞，最后细胞全死了，建议不要采用这种方法混匀细胞。
其它的声音：1.首先细胞的接种密度一定不能过大，一般每孔1000个左右就够了，我认为宁少勿多。
尤其是对于肿瘤细胞。
10000/孔是太高了，这样即使药物有作用，MTT方法也是表现不出的，最佳点板浓度在4000-5000/孔，太少的话SD值会很大。
2.MTT本身就是比较粗的实验，增殖率10%左右的波动都不算奇怪。
特别是新手，20％的波动也是常见的，所以很可能是技术原因引起的，特别是种板技术一定要过关。
3.我做的是肿瘤细胞的MTT实验,这种细胞长的很快一开始我是用100000/ML的浓度来接种的,结果细胞长的太满结果是没有梯度也没有线性关系.后来调整浓度,用过40000~80000/ML 的浓度都做过MTT实验,结果发现做的结果比较好点的是60000~70000/ML的浓度组的.用40000/M的浓度的组,由于细胞少,药物作用的梯度还是有,只是没有很好的线性关系.还有根据细胞生长速度以及药物的特性(有时间依赖性和浓度依赖性的药物)来确定培养时间是48小时还是72小时. 注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。
加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。
虽然移液器比移液管精确得多，但是如果操作不熟，CV会在8%左右。
另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。
所以要熟练些、快些上板。