高中生物实验12乳酸脱氢酶同工酶的分
生化实验：聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶
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净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳
分离蛋白质的原理
净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳是对天然状态生物大分子 进行的电泳，目的是为了保持蛋白质的天然构象、其亚 基之间的相互作用及其生物学活性。利用蛋白质分子中 所带净电荷、分子质量、形状的差异，在电场中泳动的 速度和方向不同，从而达到分离的目的。多数蛋白质的 pI在中性偏酸性范围，通常是将样品在碱性缓冲系统中 进行电泳，蛋白质分子带负电荷，以不同速度向阳极迁 移，称为阳极电泳；对于一些碱性蛋白，使用酸性缓冲 系统进行电泳，蛋白质分子带正电荷而向阴极迁移，称 为阴极电泳。
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实验原理
▪ （一）聚丙烯酰胺凝胶电泳 ▪ 聚丙烯酰胺凝胶:
是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis) 在催化剂N，N，N，N—四甲基乙二胺(TEMED)和过硫 酸铵(AP)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此 凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
▪ AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合 反应进行。
玻璃管上端的2cm处，加水封胶 ➢ 在室温中聚合5-10分钟 注意：制胶时避免产生气泡
准备电泳：
将凝胶玻璃管安装在电泳槽本体上 将凝胶玻璃
管从橡胶管上取下，去水，垂直插到电泳槽本体上， 旋紧。
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加样 取电极缓冲液加入上、下缓冲液
槽中，注意上槽液要高过电极，凝胶柱与下 液槽的缝隙处无气泡。凝胶柱上端灌满缓冲 液，用微量进样器吸取一定体积的样品溶液， 小心地将样品加在凝胶柱上端。
(Bis)
自由基
交联
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2017-2018学年高中生物第四部分浅尝现代生物技术实验12乳酸脱氢酶同工酶的分离自我小测浙科版选修1
第四部分浅尝现代生物技术实验12 乳酸脱氢酶同工酶的分离1电泳后，取出凝胶板，经染色后，在37 ℃水浴上保温20～30 min可观察到LDH同工酶呈现( )A．紫红色区带B．蓝紫色区带C．砖红色区带D．橘红色区带2下列不属于LDH的同工酶的是( )A．H4 B．H3MC．H2M3 D．HM33本实验所选用的动物血清来自( )A．牛、羊、马B．胎牛、小牛、老牛C．雌性成年牛、雄性成年牛、幼年牛D．牛、水稻、人4LDH同工酶的用途有( )A．诊断性别B．判断个体的代谢旺盛程度C．辅助诊断疾病D．用于指导动物饲料的喂养5本实验电泳所用的介质是( )A．阿拉伯明胶B．琼脂C．凝胶D．明胶6若某同学做完该实验电泳得到如下结果，则以下的分析错误的是( )A. 1与1′比较可知，小牛中M4酶的含量较胎牛少，而老牛中该酶缺乏B．由1′与2′、3′、4′、5′可知，小牛中LDH的5种同工酶都有C．整个谱带可知牛在不同的胚胎发育时期，LDH同工酶的种类、含量都有差异D．由结果可知，这5种酶一定是同工酶7单基因遗传病可以通过核酸杂交技术进行早期诊断。
镰刀型细胞贫血症是一种在地中海地区发病率较高的单基因遗传病。
已知红细胞正常个体的基因型为BB、Bb，镰刀型细胞贫血症患者的基因型为bb。
有一对夫妇被检测出均为该致病基因的携带者，为了能生下健康的孩子，每次妊娠早期都进行产前诊断。
下图为其产前核酸分子杂交诊断和结果示意图。
(1)从图中可见，该基因突变是由于引起的。
巧合的是，这个位点的突变使得原来正常基因的限制酶切割位点丢失。
正常基因该区域上有3个酶切位点，突变基因上只有2个酶切位点，经限制酶切割后，凝胶电泳分离酶切片段，与探针杂交后可显示出不同的带谱，正常基因显示条，突变基因显示条。
(2)DNA或RNA分子探针要用等标记。
利用核酸分子杂交原理，根据图中突变基因的核苷酸序列(—ACGTGTT—)，写出作为探针的核糖核苷酸序列。
血清乳酸脱氢酶测定
(1)正常LDHl、LDH2见于心肌损伤，如心肌梗塞、心脏手术、心脏移 植排异、充血性心衰、心肌炎。心梗病人出现症状后12一18小时血 清LDH升高，约在第3天达到高峰，7一18天才恢复正常。故对诊断发 病后数天才就医的病人特别有价值。LDHl>LDH2还见于肾梗塞、肾病， 巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、恶性贫血。 (2)恶性肿瘤以LDH3增高为主，LDH3明显大于LDHl，总LDH越高预后 越差。LDH2和LDH3增高见于肺癌、粒细胞白血病，LDH3和LDH4增高 见于淋巴瘤、胶原病和止血紊乱 (血小板增多症、凝血活酶释放)。 (3) LDH5增高见于骨骼肌损伤和肝胆疾病，如杜氏肌营养不良、横 纹肌溶解症、肌肉外伤，LDH5>LDH4见于肝损伤 (肝炎、肝硬化、肝 癌、心衰、肝淤血)，阻塞性黄疸时LDH 4与LDH5均增高，但以LDH4 最为明显。
0-5 30-8 40-97
5.7±2.9
（ 占总 LDH活性的百分比）
a
2
1
2
b
3 1 4 酶活性 5 酶活性 3 4 5
迁移位置 (a)
迁移位置
LDH同工酶电泳图谱
(b)
（a）正常人LDH同工酶电泳图谱 （b）心肌梗塞病人血清LDH同工酶电泳图谱
*生理及临床意义
在代谢调节上起 着重要的作用； 酶 用于解释发育过 活 程中阶段特有的代谢 性 特征； 同工酶谱的改变 有助于对疾病的诊断； 同工酶可以作为 遗传标志，用于遗传 分析研究。
乳酸脱氢酶的同工酶
人体心、肝和骨骼肌LDH同工酶谱
组织器官
心 肝 骨骼肌 正常血清
LDH1
35-70 0-8 1-10
27.1±2.8
LDH2
28-45 2-10 4-18 34.7±4.3
乳酸脱氢酶同工酶
胰蛋白酶 (Trypsin in Pancreas)
一级结构
胰凝乳蛋白酶的活性中心
空间结构
活性中心
酶分子中的化学基团：
结合基团：结合底物
活性中心内
必需
催化基团：催化底物转变成产物
基团
所有
活性中心外的必需基团：维持酶空间构象等
• 骨骼肌中：主要是 LDH5 ，对 NADH 亲和力大，不易 受丙酮酸抑制，作用是使丙酮酸还原生成乳酸，有利 于骨骼肌产生乳酸。
肌酸激酶（ creatine kinase－CK ) 同工酶 ：
二聚体酶，两种亚基：
肌型（M型） 脑型（B型）
脑中含 CK1 ( BB型 ) 心肌中含 CK2 ( MB型 ) 骨骼肌中含 CK3 ( MM型 ) 血清CK2活性的测定对于早期诊断心肌梗死有一定意义 。
3.特点
⑴ 由于分子结构差异，具有不同的电泳速度 ：由1→5 递减。
⑵ 对同一底物表现不同的 Km 值。 ⑶ 单个亚基无酶的催化活性。 ⑷ LDH 同工酶在不同组织器官中的含量与分布比例不同，
使不同组织与细胞具有不同的代谢特点。
• 心肌中：主要是 LDH1，对 NAD＋有较大亲和力，易受 丙酮酸抑制，作用是使乳酸脱氢生成丙酮酸，便于心 脏利用乳酸氧化供能。
（五）生理及临床意义
1．在代谢调节上起着重要的作用； 2．用于解释发育过程中阶段特有的代谢特征； 3．同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断； 4．同工酶可以作为遗传标志，用于遗传分析研究。
酶
活
心肌梗死酶谱
性
正常酶谱 肝病酶谱
12 3 45
同工酶乳酸脱氢酶
同工酶乳酸脱氢酶1. 引言同工酶乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，简称LDH）是一种广泛存在于生物体中的重要酶类。
它在多种生物体中起着关键的代谢调节作用，参与糖代谢途径中的乳酸产生和消耗。
本文将对同工酶乳酸脱氢酶的结构、功能、应用以及相关研究进行全面详细的介绍。
2. 结构与功能同工酶乳酸脱氢酶是一种四聚体结构的金属依赖性酶，由两个不同亚基组成，分别命名为M亚基和H亚基。
M亚基主要负责催化反应，而H亚基则参与辅助催化过程。
这两个亚基之间可以通过静电相互作用来调节催化活性。
同工酶乳酸脱氢酶在细胞内起着关键的代谢调节作用。
它参与糖代谢途径中的乳酸产生和消耗，在无氧条件下能够将产生的乳酸转化为能量。
此外，同工酶乳酸脱氢酶在肌肉和心脏等组织中也发挥着重要的功能，参与调节能量代谢和维持细胞内氧化还原平衡。
3. 应用领域同工酶乳酸脱氢酶在医学、生物学和食品工业等领域具有广泛的应用价值。
以下是几个常见的应用领域：3.1 医学诊断同工酶乳酸脱氢酶在医学诊断中被广泛用作生化指标。
它可以作为心肌梗死、肝病、恶性肿瘤等疾病的辅助诊断指标。
通过检测血液或组织中LDH的活性或浓度变化，可以帮助医生判断疾病的类型、严重程度和预后。
3.2 生物技术同工酶乳酸脱氢酶在生物技术领域被广泛应用于基因工程、药物开发等方面。
例如，在基因工程中，LDH可以作为报告基因用于评估转基因细胞或转基因生物体的表达水平。
此外，同工酶乳酸脱氢酶还可以用于药物开发中的药效评价和毒性研究。
3.3 食品工业同工酶乳酸脱氢酶在食品工业中也有一定的应用。
它可以用于乳制品、面包等食品的质量控制和品质评估。
通过检测食品中LDH的活性或浓度，可以判断产品是否新鲜、保存条件是否良好等。
4. 相关研究同工酶乳酸脱氢酶作为一种重要的生物催化剂，近年来受到了广泛的研究关注。
以下是几个与同工酶乳酸脱氢酶相关的研究领域：4.1 结构与功能研究许多科学家致力于揭示同工酶乳酸脱氢酶结构与功能之间的关系。
实验十 同工酶分析
实验四同工酶分析同工酶概述酶是以蛋白质为主要成分的生物催化剂。
在生物体内，有一些酶催化相同的反应，但其结构不同。
它们对底物的浓度、pH、温度等的最适要求不同，酶活力的调控反应及其所在的细胞分布也不一样。
把催化相同反应而结构和理化性质不同的酶的分子类型称为同工酶（isozyme）。
同工酶概念的提出，揭示了不同生物、同一生物不同器官和不同组织起源的酶可作用于同一底物，催化相同的反应，但在其他性质方面可以不尽相同。
大量研究表明，同工酶在生物界是广泛存在的。
在动植物和微生物体中、同一物种的不同个体、同一个体的不同器官、组织和细胞、同一细胞的不同部位、生长发育的不同阶段、不同的代谢条件下，都有不同的同工酶分布。
现在已发现的酶中，有一半以上的酶已经发现有同工酶存在。
可以进行同工酶分析的酶已有100多种。
不同同工酶可以根据电泳迁移率予以区别和编号，以向阳极方向泳动最快的编为同工酶1。
从分子结构上看，同工酶的形成有以下学说或原因：（一）亚单位结构学说亚单位结构学说是研究同工酶理论并对作用机理阐述的较为透彻的学说之一。
该学说认为同工酶是由不同亚基按不同方式结合而成的。
这个学说有广泛的实验证据。
如已经证明乳酸脱氢酶（LDH）是由A、B两个亚基，按不同比例结合成的四聚体，所以有5种同工酶：LDH1（A4）、LDH2（A3B1）、LDH3（A2B2）、LDH4（A1B3）、LDH5（B4）。
（二）不同基因编码由不同的基因或等位基因编码会形成一级结构完全不同或有个别氨基酸残基不同的多肽链。
因而产生同工酶。
由不同基因引起的同工酶存在于同一物种的所有个体中，而由等位基因引起的同工酶以一定比率存在于同一族中。
（三）单一亚单位聚合程度不同有些同工酶的亚单位是完全相同的，如胆碱脂酶（ChE），但不同的酶分子中，亚基数目不同，这就形成分子量不同的5种同工酶。
经研究发现，目前发现的100多种同工酶，其组成比例不同，但以单体（26%）、二聚体（52%）、四聚体（20%）较多，三聚体极少。
第四章实验五乳酸脱氢酶_LDH_同工酶的分离纯化
NAD+：10 mL NBT：10 mL PMS：2 mL 0.5 M PH7.6 Tris-HCl: 15 mL 0.5 M乳酸钠：15 mL 0.1NaCl：5 mL 去离子水：43 mL
共计100 mL
四、实验操作
1.样品处理：1 g 组织切碎，加 pH 7.4 Tris-HCl缓 冲液10 mL，匀浆，10,000 g ，4℃，离心10 min，上
离子交换剂结构：以Sephadex-QAE A-50为例
葡聚糖 -N+(CH3)3 –Cl基质 功能基团 平衡离子
电荷基团 反离子
离子交换剂的种类
1 按基质种类不同： 离子交换树脂，离子交换纤维素，离子交换凝胶等
2 按功能基团不同： 强酸型 含磺酸基团 (R-SO3H)， 中等酸型 含磷酸基团 (-O-PO2H4) 弱酸型 含酚基、羧基 强碱型 含季胺基团 [-N+(CH3)3]，弱碱型 含叔胺、伯胺基团[-N(CH3)2] 3 按平衡离子的性质不同：
ABC
D
E
A280
5 10 15 20 25 30 35 40 50
洗脱体积
4.聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定：活性电泳 只做分离胶，胶倒好直接插上试样梳，进行聚合
编号 1 2 3 4 5
总体积
溶液名称 30% Acr –0.8% Bis pH 8.9 Tris -HCl TEMED 10% AP H2O
三、实验试剂
1、20 mM Tris-HCl，pH 7.4缓冲液； 2、A液: 20 mM Tris-HCl，pH 6.3缓冲液 3、B液: A液含60 mM NaCl 4、C液: A液含100 mM NaCl 5、D液: A液含150 mM NaCl 6、E液: A液含240 mM NaCl 7、QAE-Sephadex A-50准备：取1克QAE-Sephadex A-50于烧杯中加入100 mL A
乳酸脱氢酶;肌酸激酶;肌酸激酶同工酶
乳酸脱氢酶、肌酸激酶和肌酸激酶同工酶是人体生理过程中不可或缺的重要酶类。
它们在能量代谢、肌肉损伤和疾病诊断等方面发挥着重要的作用。
本文将分别从乳酸脱氢酶、肌酸激酶和肌酸激酶同工酶的功能、结构及临床应用等方面进行介绍和探讨。
一、乳酸脱氢酶1.功能乳酸脱氢酶（LDH）是一种存在于细胞质中的酶，它参与了乳酸的代谢过程。
在有氧环境下，LDH将乳酸转化为丙酮酸，从而释放出能量。
而在缺氧环境下，LDH则参与乳酸的产生过程，帮助细胞维持能量代谢的平衡。
2.结构LDH是由四个亚基构成的四聚体蛋白质，这四个亚基可以分为两种类型：M亚基和H亚基。
在人体中，有5种不同的亚基组合形式，它们分别存在于不同的组织和细胞中。
3.临床应用LDH在临床上是一个重要的生化指标，它可以用于辅助诊断心肌梗死、溶血性贫血、癌症和肝脏疾病等疾病。
通过LDH的测定，可以帮助医生判断疾病的严重程度、进行病情的监测和评估治疗效果。
二、肌酸激酶1.功能肌酸激酶（CK）是一种主要存在于肌肉组织中的酶，它参与了肌肉中肌酸磷酸酶系统的能量代谢过程。
在肌肉受损或缺氧的情况下，肌酸激酶会被释放到血液中，因此成为了一种用于诊断和监测肌肉损伤的生化指标。
2.结构肌酸激酶是一个由两个亚基构成的二聚体酶，这两个亚基分别被称为B亚基和M亚基。
在人体中，有三种不同类型的肌酸激酶异构体，它们分别被称为CK-MM、CK-MB和CK-BB。
3.临床应用在临床实践中，CK的测定常用于评估心肌梗死、肌肉疾病、运动损伤、中风和肝脏疾病等疾病。
通过监测血清中CK水平的变化，可以帮助医生对患者的病情进行评估和诊断。
三、肌酸激酶同工酶1.功能肌酸激酶同工酶（CK-M）是肌酸激酶中的一种同工酶，与肌酸激酶具有相似的生物学功能和结构。
它主要存在于心肌组织和脑组织中，因此也被用作评估心肌和脑组织损伤的生化指标。
2.结构肌酸激酶同工酶和肌酸激酶有着相似的二聚体结构，但其在组织分布和生物学特性上有所不同。
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同工酶的概念要准确理解。
随堂训练 SUITANGXUNLIAN
1 下列属于乳酸脱氢酶(LDH)催化得到的物质是( )
①乳酸 ②NADH ③NAD＋ ④H＋ ⑤丙酮酸
A．①③ B．②④⑤
C．⑤
D．①
答案：B 解析：根据下图可知：
CH3－CHOH－COOH(乳酸)＋NAD＋(乳酸L脱DH氢酶)CH3－CO－COOH(丙酮酸)＋NADH＋H＋ 生 成物为 3 个：丙酮酸、NADH、H＋。
题例领悟 TILILINGWU
【例题 1】 乳酸脱氢酶能使乳酸发生下列的哪一变化 型辅酶 NAD＋分解
C．使乳酸氧化生成 CO2、H2O D．使乳酸分解成乙醇 解析：本题考查乳酸脱氢酶的作用。根据教材中对其的描述，乳酸脱氢酶(LDH)可以发 生以下变化
LDH CH3－CHOH－COOH＋NAD＋ (乳酸) (氧化型辅酶 NAD＋) CH3－CO－COOH＋NADH＋H＋ (丙酮酸) 所以，正确的答案是 A。 答案：A
将乳酸脱氢酶的反应式搞清楚，尤其是各物质的分子简式。
【例题 2】 下面对同工酶概念的说法，正确的是… ( ) A．能将不同物质催化反应为同一物质的一组酶 B．能催化同一化学反应，但其酶蛋白分子的组成却不同的一组酶 C．所起的作用都是催化作用的一组酶 D．催化同一个物质生成的物质却不同的一组酶 解析：根据同工酶的概念所述，同工酶是指催化同一化学反应，但其酶蛋白的分子组 成却不同的一组酶，所以选项 B 是正确的。 答案：B
乳酸脱氢酶同工酶的分离
1．除了 LDH 还有哪些酶具有同工酶？ (1)哺乳动物的肝脏中，己糖激酶有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4 种同工酶； (2)碱性磷酸酯酶(AKP)有 4 种同工酶； (3)微生物中也有同工酶，大肠杆菌中天冬氨酸磷酸液酶，共有 3 种同工酶。 2．LDH 同工酶有什么用途？同工酶又有什么应用？ LDH 同工酶的分布有明显的组织特异性，所以可以根据其组织特异性来协助诊断疾病。 正常人血清中 LDH2>LDH1。如有心肌酶释放入血清中，则 LDH1>LDH2，利用此指标可以观察 诊断心肌疾病。临床意义： (1)急性心肌梗塞发作后，早期血清中 LDH1 和 LDH2 活性均升高，但 LDH1 增高更早， 更明显，导致 LDH1 与 LDH2 的比值升高。 (2)肝炎、急性肝细胞损伤及骨骼肌损伤时 LDH5 都会升高。 (3)患活动性风心肌湿性炎、急性病素性心肌炎、溶血性贫血、肾坏死等病 LDH1 也可 升高。 (4)恶性病变时 LDH3 常增高。 同工酶是基因表达的产物，生物发育过程中基因的表达受时间和空间的控制，所以同 工酶的研究在生理或病理变化、分子进化、育种等方面都有意义。近年来，同工酶检测在 有些方面已被 DNA 标记所取代。但由于同工酶的检测在操作上比检测 DNA 简便，所以在一 定程度上还可发挥作用。 3．LDH 活性染色法能否用于定量测定，能否用于比色法测定其他生化反应？ LDH 活性染色法可用于溶液的比色定量测定。此法也可用于其他生化的氧化还原反应。 但由于 NBTH2 不溶于水，在琥珀酸脱氢酶测定中，可使 PMSH2 与溶于水的 2,6 二氯酚靛酚相 偶联而进行比色测定。 4．同工酶能否用 SDS 聚丙烯酰胺电泳分离？为什么？ SDS 是解离剂，而许多同工酶是由 2 种亚基以不同比例组成的全酶，被解离后进行电 泳，获得的是亚基的条带，无法显示同工酶的条带。所以同工酶不能用 SDS 聚丙烯酰胺电 泳分离。
2 关于同工酶的叙述，不正确的是( ) A．LDH 各种同工酶的化学本质都是蛋白质 B．LDH 共有 5 种同工酶，分别为 H4、H3M、H2M2、HM3、M4 C．LDH 是由 2 种亚基 L 和 M 以不同比例组成的四聚体 D．LDH 同工酶可用于研究酶的专一性 答案：D 解析：根据教材中对同工酶概念、特性的描述，D 是不正确的。同工酶的用 途之一是用以辅助诊断疾病等。