反胶束萃取在食品中的研究与进展

分离工程期末论文反胶束萃取在食品中的研究与进展Research Progress of Reversed Micellar Extraction in Food Science学院：化学工程学院专业班级：化学工程与工艺化工081学生姓名：林佳楠学号： 050811129指导教师：戴卫东（副教授）2011年6月1 引言或绪论随着现代生物工程技术的不断发展，传统的溶剂萃取方法难以满足生化分离的要求。

1977年Luisi等人[1]首次发现胰凝乳蛋白酶可以溶解于含表面活性剂的有机溶剂，提出反胶束概念，短短几十年，反胶束萃技术已经广泛应用于蛋白质、酶、氨基酸和细胞色素等生物活性大分子的分离提纯。

反胶束萃取技术基于液-液相转移，萃取条件温和，萃取效率高且反胶束体系能模拟细胞天然环境作为酶催化反应介质，在食品工业领域有良好的应用前景。

2 反胶束萃取原理和制备2.1 基本原理表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶束浓度(CMC)时，便形成聚集体，称为正常胶束。

表面活性剂溶于有机溶剂，当浓度大于临界胶团浓度时，会在有机相中形成聚集体，称为反胶束。

反胶束中极性头朝内，非极性尾朝外排列形成亲水内核，称为“水池”。

如图1所示。

萃取时，待萃取的原料液以水相形式与反胶束体系接触，调节各种参数，使其中要提取的物质以最大限度转入反胶束体系(前萃取)，后将含该物质的前萃液与另外一个水相接触，再次调节pH、离子强度等参数分出要提取物质。

2.2 体系性质反胶束体系的性质常用参数W0(或R)，θ与N来表示，其中W0为水与表面活性剂的摩尔比，θ是增溶水相对总体积的浓度，N是组成每个反胶柬微粒的表面活性剂分子个数(聚焦数)。

当W0一定时，θ与N决定了胶柬微粒的相对浓度。

其中最重要的参数为W0 。

2.3 增溶动力学蛋白质在反胶束中增溶，普遍认为动力是蛋白质表面的电荷与形成反胶束内表面的表面活性剂极性头之间的静电引力，如AOT(丁二酸—2—乙基已基酯磺酸钠)/异辛烷形成的反胶束中，AOT是阴离子表面活性剂。

当原料样pH＜pl时，蛋白质带正电，则增溶太，pH＞pl则增溶小。

离子强度也有类似现象，很多研究表明蛋白质与表面活性剂间的疏水作用也有很大作用。

反胶束中，酶的动力学与水中相似，只是由于酶与表面活性剂作用、底物分配和交换，因而Km(米氏常数)、Kcat(转换数)是复杂的多变量函数。

2.4 制备方法目前常用转移法、注入法、溶解法制备反胶束体系。

3 反胶束萃取技术在食品中的研究进展3.1 反胶束萃取技术分离蛋白质和氨基酸3.1.1 分离蛋白质混合物不同种类的蛋白质分子由于体积、表面电荷分布、疏水性质等的不同，在反胶束体系两相间有不同的分配系数，调节体系相关参数可以将目标蛋白质选择性萃取入反胶束有机相或富集于水相主体溶液，使混合体系的蛋白质分级分离。

Lee等人[2]以反胶束萃取技术分离混合蛋白质体系中的α—乳白蛋白和β—乳球蛋白(质量比为1:1)，实验发现，当初始水相总蛋白质浓度为1 mg/mL、pH为9、钠离子浓度为0.1 moI/L时，萃取后85％的α—乳白蛋白进入AOT/异辛烷反胶束粒，而80％的β—乳球蛋白仍残留于水相溶液。

Su等人[3]用AOT/异辛烷反胶束体系分离牛初乳乳清蛋白质，当蛋白质水相主体溶液pH值为6.35，钠离子强度为0.1 mol/L时，反胶束萃取后90％以上的免疫球蛋白G留在水相溶液，而其他蛋白质基本进入反胶束有机相。

Nishiki等人在二烷基磷酸盐/异辛烷反胶束体系中研究溶菌酶和肌红蛋白的分离行为，实验结果发现，当水相KCl浓度为0.1 mol/L、pH为9.0时，溶菌酶基本进入反胶柬微粒，而肌红蛋白则留在水相；调节第二水相pH 11～12时，90％以上的溶菌酶可以反萃取到浓度为1.5 mol/L的KCl溶液中。

3.1.2 从发酵液中直接分离纯化蛋白质分离蛋白质混合物的研究主要为纯酶形成的纯物质模型系统，反胶束萃取法还可以从复杂的培养基，如发酵液或粗提液中直接萃取蛋白质。

Krienger等人[4]用AOT/异辛烷反胶束体系从桔青霉(Penicillium citrinum)的粗提物中提取和纯化了脂肪酶。

发酵结束后桔青霉菌丝体经过滤，收集含有脂肪酶的上清液得到粗提液，再经萃取可得脂肪酶。

Soni等人[5]用同样的反胶束体系从发酵液中提取了黑曲霉(Aspergillus niger)的胞外酸性磷酸酯酶。

实验结果表明，萃取和反萃取在最优条件下，可从最初发酵液中获得29％的酸性磷酸酯酶。

Yang等人[6]用反胶束萃取从猪血浆中分离纯化γ—球蛋白。

实验结果表明水相的pH值和盐(NaCl)浓度和有机相表面活性剂(A0T)的浓度是影响萃取γ—球蛋白的最重要的因素。

在400 mmol/L NaCl，350 mmol/L AOT 和pH =7.0时，保证产物纯度为85％的条件下，可获得97％的收获率。

Giouvenco[7]用反胶团萃取法从全料液中提取和纯化棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)的胞内脱氢酶，将全细胞的悬浮液注入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)/己醇一辛烷反胶束溶液中，完整的细胞在表面活性剂的作用下被溶裂，析出酶进入反胶束的“水池”中，经反萃可选择性地回收浓度很高的酶。

在最优条件下，对分子质量较小的β—羟丁酸脱氢酶(M w 63ku)和异柠檬酸脱氢酶(M w 80ku)，反萃液中酶活性的回收率超过100％(相对于用无细胞抽提液)，分子质量较大的葡萄糖—6—磷酸脱氢酶(M w 200ku)不能被抽提出来，至少不能抽提到有活性的酶。

细胞碎片留在反胶束相中是这种方法的一个不利因素，它使得反胶相不能重复使用。

如果可以很便利地回收有机溶剂和表面活性剂，那么这种细胞溶解与蛋白质萃取相结合的工艺方法，将成为从细胞中直接提取蛋白质的重要途径。

3.1.2 从油料作物中同时分离油和蛋白质植物蛋白提取的传统方法是从脱脂粕中萃取的，不仅工艺复杂、能耗高，更重要的是加工过程中容易导致蛋白质变性；另一方面，传统方法处理量小，造成大量的蛋白资源浪费，而反胶束溶液不仅可以萃取植物蛋白，同时还可以分离出植物油脂，这一技术一旦有所突破，将引起整个制油工业发生质的变革这一研究已成为反胶束技术在食品科学中研究的最大热点之一。

赵廷俊等人[8]用AOT/异辛烷反胶束体系同时萃取分离植物油中蛋白质和油脂，其中油脂直接萃取入有机相中，蛋折质则溶入反胶束“水池”内，反萃取出蛋白质，冷却反胶束溶液使表面活性剂沉淀分离，最后用蒸馏法将油和烃类分开。

实验采用正交化法，得到蛋白质最佳萃取条件是，萃取时间90 min、KCl浓度0.10 mol/L、pH 5.5、AOT/异辛烷浓度0.16 g/mL；最佳反萃取条件是，萃取时间90 min、KCl浓度1.20 mol/L、pH值7.7。

陈复生等[9]用AOT/异辛浣反胶束体系同时萃取植物蛋白和油脂，采用正交试验，找到了最佳艺条件：时间50 min，KCl浓度0.15 mol/L，AOT/异辛烷为8 g/50mL．得到影响萃取效果各因素主次顺序：时间＞AOT/异辛烷＞KCl浓度．3.1.3 氨基酸用反胶束萃取还可以将氨基酸从发酵液中提取出来。

该过程关键在于有效控制影响氨基酸溶解的参数，这些参数是反胶束的结构和氨基酸的离子化状态。

氨基酸的结构和其离子化状态将决定反胶束体系内的相互作用和氨基酸溶解。

氨基酸可以通过静电或疏水作用增溶于反胶束中。

利用氨基酸与反胶束作用的差异，可以选择性地分离某些氨基酸。

翁连进等人[10]已成功开发了从胱氨酸母液中提取精氨酸的工艺，该工艺采用4级萃取，3级洗涤，可以使反胶束中精氨酸的纯度大于98％，整个工艺精氨酸的回收率大于98％。

而目前工业上仍在应用的离子交换法从胱氨酸母液中提取精氨酸的工艺回收率仅为10％。

Cardoso等[11]采用三辛基甲基氯化铵(TOMAC)/己醇/正庚烷反胶束体系对3种结构和疏水性不同的氨基酸:天冬氨酸(pI 3.0，疏水性氨基酸)、苯丙氨酸(pI 5.76，弱疏水性氨基酸)和色氨酸(pI 5.88，疏水性氨基酸)的萃取条件进行了研究。

结果表明，即使等电点十分相近的苯丙氨酸和色氨酸也可以完全分离。

3.2 酶学研究3.2.1 酶活性的研究已报道有50多种酶的反胶束体系中具催化活性。

反胶束体系中核心水团分为自由水和结合水。

W0较小时，核心水团主要是结合水；随W0增大，自由水逐渐增加，核心环境逐渐接近水溶液。

酶分子与表面活性剂问作用取决于酶分子与反胶束性质，酶活性主要取决于核心水团太小，表面活性剂性质，反胶束浓度。

研究发现各种酶活性变化有四种情况。

酶活性随W0增大而逐渐增大，到一定值后基本不变；酶活性随W0增大而降低；酶活性与W0关系呈“钟罩型”曲线，核心水团大小合适时，酶活性最大；有些酶在一定的W0值时，酶括性几倍、几十倍甚至几百倍于水中的活性，即所谓酶的“超活性”，如过氧化物酶约为水中的100倍，酸性磷酸酶则为水中的200倍．另外各种酶活性与反胶束的组成有关。

Karpe等[12]研究了α—凝乳蛋白酶在AOT/异辛烷体系中的酶超活性，用双电层理论解释，同时考虑局部电场强度和局部离子强度影响通过计算，很好地符合泊松一玻兹曼等式．他们认为酶超括性是由于：①“水池”中底物浓度高于水相中底物浓度；②带负电的底物与带负电的表面活性剂表面产生斥力作用于酶，使酶活性增大。

近年来，人们积极寻找具有超活性的酶，特别是在普通水相中活性很低或反应要求较高的酶类用来水解油脂等。

3.2.2 酶的提取和分离反胶束萃取技术可以从发酵液中提取胞外酶。

Krishnakant等人采用浓度为0.20 mol/L 的A0T/异辛烷反胶束溶液从全发酵液中提纯磷酸酯酶，通过优化工艺过程，酶的回收率为29％。

刘国军等人以AOT/异辛烷反胶束溶液从发酵液中提取纳豆激酶，实验发现异丙醇有助于酶的反萃取；经反胶束萃取和反萃取后，酶的纯化倍数为2.7，活性为天然酶的80％。

Chou等人以AOT/异辛烷反胶束溶液从鸡蛋中提取溶菌酶，提取所得溶菌酶活性为天然状态的90％，酶活力达7.3×10-4 u/mg。

任虹等人[13]以CTAB/异辛烷反胶束溶液萃取纤维素酶，发现添加助溶剂正辛醇可以提高萃取率且纤维素酶萃取率随水相pH值的升高而增大；当水相初始pH 值为11、KCl浓度为0.05 mol/L、有机相正辛醇与异辛烷体积比为2：9时，酶的萃取率可达90％以上，适宜条件下反萃取后纤维素酶活性基本不损失。

反胶束萃取技术还可以直接提取胞内酶，Giovenco等人[14]报道，反胶束萃取技术从全料液中提取和纯化棕色固氮菌的胞内脱氢酶。

在反胶束的表面活性剂作用下，菌体细胞先被溶裂，析出的酶进入反胶束微粒，可通过反萃取回收高浓度的活性酶。