酪蛋白糖巨肽40CGMP41对小鼠肠道菌群的影响毕业设计

(此文档为word格式，下载后您可任意编辑修改！)第一章前言1.1酪蛋白糖巨肽(CGMP)的研究背景1.1.1 CGMP的生物来源酪蛋白糖巨肽（Casein Glycomacropeptide 简称CGMP），是Delfour等[1]于1965年发现的一种含有唾液酸的糖肽，是乳中κ- 酪蛋白(κ- CN，惟一含有糖成分的CN)上的一个多肽片段。

κ- 酪蛋白是酪蛋白的一种，它是酪蛋白中唯一一种含有糖成分的酪蛋白，在牛脱脂乳中含量约占总酪蛋白的13%，在人乳中占总酪蛋白的30%。

氨基酸组成分析表明，κ- 酪蛋白含有169个氨基酸残基，两个胱氨酸残基(两个，SH基)，通常含有一个磷酸基，富含脯氨酸、丙氨酸、谷胺酰胺、谷氨酸等，分子量约为1.9×104[1]。

κ-酪蛋白中有半乳糖(Gal)、N一乙酰氨基半乳糖(GalNAc)、N一乙酰神经氨酸(NeuNAe)(唾液酸)三种糖。

酪蛋白糖巨肽就是水解κ- 酪蛋白产生的[2,3]。

干酪加工时凝乳酶水解酪蛋白（主要是κ- CN）的苯丙氨酸- 蛋氨酸键，生成不溶性的副-κ- CN(肽链的1～105 部分)和可溶性的多肽(肽链的106～169部分)两部分，此多肽含有较多的碳水化合物，称之为―糖巨肽‖，酪蛋白来源的糖巨肽称为―酪蛋白糖巨肽‖。

κ-酪蛋白来源的CGMP的氨基酸序列已清楚,它是由从κ-酪蛋白的N 末端106 位氨基酸(Met) 开始至169 位 C 末端(Val) 结束的64 个残基构成的。

牛的CGMP有A 和B 2 种遗传变异型,其不同在于该多肽链的136 位和148 位的氨基酸不同,A 型的136 位和148 位残基氨基酸分别为Thr 和Asp ,而B 型为Ile 和Ala。

此外,该多肽的131、133、135、136 和142 位的苏氨酸残基为配糖体化的部位,149 位的丝氨酸为磷酸化的部位[2,3]。

在凝乳酶凝集乳酪制造过程产生的乳清中含有大量的CGMP ,有研究[4]指出,甜乳清中其含量约为 1.2～1.5g/ L ,估计相当于总乳清蛋白含量的20 %～25 %左右。

1.1.2 CGMP的生物学活性1.1.2.1 .结合霍乱毒素和大肠杆菌毒素霍乱毒素由一个亚单位A和五个亚单位B组成，其中B亚基与细胞表面的寡糖受体结合以后，A亚基就会激活细胞中的腺苷酸环化酶，最后导致细胞死亡[5]。

有研究显示此寡糖受体是一个G M1寡糖，其结构为：Gal β1→3GalNAcβ1→4(NeuAcα2→3)Galβ1→ 4Glcβ1→1Cer (Glc =glucose ,Cer =ceramide)[6，7]。

此结构的寡糖受体与糖巨肽的寡糖结构类似，因此CGMP可以作为毒素中和剂抑制霍乱毒素与受体的结合，保护细胞免受毒素的侵染。

1.1.2.2.抑制细菌和病毒黏附CGMP与宿主细胞上的受体蛋白具有相似性，优先与细菌和病毒结合，从而抑制细菌和病毒的繁殖[8]。

多项研究结果表明CGMP能够有效阻止龋齿、病原菌Streptococcus mutans，S. sanguis，S. sobrinus在口腔表面的黏附[9，10]，并且能够调节牙齿菌斑的微生物，有助于控制牙齿菌斑上酸类物质的形成，减少牙齿上羟基磷灰石分解。

根据此原理，CGMP已经成功地申请专利应用到口腔保健上[11]。

1.1.2.3.抑制胃液分泌Stan[12]等研究发现CGMP能够抑制狗的胃液分泌，减慢胃肠的蠕动。

狗被注射了10~15mg 的CGMP 后，它分泌的胃液酸性减弱，并且胃和十二指肠的的蠕动减慢了。

被注射CGMP的老鼠也有同样的反应。

进一步研究表明，胃蛋白酶消化CGMP 产生了两个可以用Sephadex 分离的片段，Stan 解释说是因为CGMP进入血液从而抑制了胃液的分泌。

Aleinik[13]等人相继也发现CGMP抑制胃液的分泌高达50%，血清中的促胃泌激素也被抑制约8%。

抑制胃液分泌能够降低动物胃蛋白的水解作用，这样可以保护乳中的免疫球蛋白、乳铁蛋白及溶菌酶等蛋白质原封不动地穿过胃，有益于婴儿以及免疫力低下的人增强免疫力。

1.1.2.4.促进双歧杆菌增殖Gyorgy[14]首先发现CGMP是人初乳和常乳中双歧杆菌的生长促进因子。

近年来的很多研究也证实了这个结论[15]。

双歧杆菌是肠道中的益生菌，它可以抑制大肠杆菌等有害菌的生长，起到预防胃肠道疾病的作用。

近年来添加双歧杆菌的多种微生态制剂已经投放市场，有效地缓解乳糖不耐症，预防和治疗肠炎等疾病。

1.1.2.5. 调节免疫系统CGMP能够抑制引起脾细胞增殖的促细胞分裂素的产生。

从而抑制脾脏淋巴细胞（参与炎症反应）的增殖，抑制过敏反应[16]。

Otani[17]等通过实验表明这种抑制活性主要CGMP中的唾液酸其主要作用，如果把唾液酸消化掉，则它就不具有这样的活性。

CMP 可与小鼠单核或巨噬细胞通过多价配位体(例如糖链及其他阴离子基团如磷酸丝氨酸残基)结合, 诱导产生白细胞介素- 1(IL- 1)受体拮抗剂,从而抑制脂多糖介导的脾淋巴细胞增殖[18]。

1.1.2.6.其它生物活性CGMP具有独特的氨基酸组成，特别是几乎不含有芳香族氨基酸，因此可作为苯丙酮尿症患者膳食中首选的成分[19]；CGMP含有较多的支链氨基酸(如Val 和Ile) ，可用于多种肝病的治疗[20]；最近一些研究表明，由CGMP再降解所得的一些小肽有抑制血小板凝集及降低血压效果[21]；CGMP能够有效促进锌的吸收[22]；CGMP的糖链中含有较多的氨基葡萄糖，对炎症性肠疾患者有较好的疗效作用；有研究证实在幼年恒河猴的乳汁中加入CGMP可以促进Ca、P、Fe 的吸收[23]；CGMP含有大量的唾液酸，动物体内试验表明外源唾液酸的摄入能够显著增加脑中神经节苷脂的数量，提高学习能力[24]；在新生动物中还能显著地抑制IgG的产生，有助于下调机体对抗原产生的免疫应答，有效预防过敏反应的发生[25]。

1.2肠道微生态及研究进展1.2.1肠道微生物的形成以及分布人体体表以及体内存在着大量的微生物，包括细菌、古细菌、真菌、寄生虫和病毒等。

这些微生物占人体总重量的1%-2%，因此从某种意义上说一个完整、健康的成年人是诸多物种组成的复合体。

其中肠道是世界上生物密度最高的地方，每克大肠最多有1万亿个微生物[26]。

其中许多微生物对人体健康起到了重要作用，他们可以协助机体的消化、吸收，对外来的病原微生物产生免疫应答等[27]，而同时还有一些微生物则可能导致人体疾病：结肠炎、类风湿性关节炎等。

肠道微生物与宿主之间是一种互惠共生的关系,对维持人类健康和正常菌落稳定的巨大贡献[28]。

这些细菌中有一部分是潜在的致病菌，当肠道环境处于生理或功能性障碍时，他们能引起一系列的感染和腐败反应。

1.2.1.1肠道正常菌群的形成新生婴儿从无菌的环境中出生以后很快就会适应新的环境，并成为大量微生物的宿主，这些微生物都将参与人体内正常微生物菌群的构建。

胎儿的出生方式（自然生产和剖腹生产），婴儿喂养方式（母乳喂养和非母乳喂养）甚至婴儿出生的环境（发达国家和发展中国家，甚至出生的医院）等都会影响婴儿体内正常菌群的构建。

母体产道中的微生物在婴儿早期的粪样中不会富集，只在刚出生后的前几天内会有，所以说自然生产的婴儿肠道微生物的构建受母体产道的影响不大[29]。

肠道内优先侵入的菌群可以调节寄主肠道上皮细胞内的基因表达，因此可以为它们创造一个合适的生长环境，同时阻止其它细菌的生长。

因此说，个体肠道内原始微生物的定植与个体肠道内固定微生物的组成和分布是有很大关系的。

1.2.1.2肠道微生物的分布胃肠道上段(胃及小肠)微生物含量较少，仅有少量黏附在上皮的细菌以及其它一些过路菌。

胃内酸度高，环境中pH较低且含大量消化酶，不适合细菌生长，所以胃内细菌数量很少，总菌数O～103个, 主要为革兰氏阳性好氧菌, 如链球菌、葡萄球菌和乳酸杆菌, 其中乳酸杆菌的数量约为103CFU/ml。

在回肠末端, 细菌数逐渐增加105～108 CFU/ml, 主要含乳酸杆菌( 102～105 CFU/ml) 、大肠杆菌、类杆菌和梭状芽孢杆菌等。

至结肠, 细菌数明显增加, 浓度为109～1012CFU/ml, 主要为厌氧菌: 双歧杆菌( 108～1011 CFU/ml) 、类杆菌、乳酸杆菌( 104～109 CFU/ml) 占绝对优势为优势菌群, 而有潜在致病性的梭状芽孢杆菌和葡萄球菌仅占少量[30]。

近年来，将分子生物学的方法应用到肠道微生物检测发现：一些兼性厌氧菌包括大肠杆菌、肠球菌（enterococci）和乳酸杆菌，在人体的盲肠中达到非常高的密度和代谢活性，因为盲肠内容物中总细菌rRNA的50%都与这些菌种的一致，而粪便样品中这些菌种rRNA的数量仅达到7% 。

由此可见，这些菌种在盲肠中起到了非常重要的作用[31]。

1.2.2肠道微生物的生理功能随着分子生物学技术的发展和应用，人们日益突破传统技术和方法的局限, 深刻地揭示宿主与肠道微生物之间互惠共生的分子机制: 人体肠道向肠道微生物提供优越的栖息和繁殖环境, 其中包括天然的厌氧条件, 丰富的营养物质, 以及适宜的温度和pH等; 肠道微生物及其代谢产物影响到人体的营养物质加工、能量平衡、免疫功能、胃肠道发育和成熟以及其他多种重要的生理活动。

一般情况下，肠道菌群与人体外部环境保持着一个平衡状态，对人体的健康起着重要作用，但是这种平衡在某些情况下可能被打破，造成人体肠道菌群失调，从而引起多种疾病，如：炎性肠病（IBD）、结肠癌、类风湿性关节炎、遗传过敏性皮炎、最新的研究发现，肠道内细菌构成的比例，甚至可能是决定是否患肥胖症的重要因素。

美国华盛顿大学教授杰弗里·戈登等通过动物实验以及对12名减肥成功人士进行的研究，他们发现，在众多的肠道细菌群落中，有两种细菌的比例关系和肥胖的发生密切相关：在肥胖的人和老鼠的肠道内，一种名为―类杆菌‖的细菌所占的比例比较低，而另一种名为―厚壁菌‖的细菌含量较高。

1.2.2.1保护功能：屏障作用体内正常微生物在肠粘膜上形成一层菌膜以抵御外来微生物的定植，因此对防止组织受到病原菌侵染方面起到很重要的作用。

这种抵御作用还表现在限制过路菌（opportunisic bacterial）的生长。

体外试验发现：细菌之间能够通过争夺肠道上皮细胞上的黏附位点而在粘膜上定植，非致病菌的黏附和定植可以阻止随后进入的致病性大肠菌群在肠粘膜上皮细胞的黏附和定植[33]。

另一方面细菌通过竞争肠道内可利用的营养物质资源和资源来供自身的生长和繁殖，例如：肠道内的Bacteroides thetaiotaomicron. (多形拟杆菌)就是通过这种发式来发挥它的占位作用的。