正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠肠道菌群T-RFLP分析论文及综述
肠道微生物作为环境因素调节脂肪储存资料
肠道微生物作为环境因素调节脂肪储存和能量摄取、吸收或储存有关的非认知性的减少的药物作用靶点被发现，这和全球性的肥胖有重要关系。
肠道微生物对食物中多糖的加工起着重要作用。
我们发现对成年无菌（GF）C57BL/6小鼠用正常饲养动物的盲肠微生物处理过后，在忽略食物摄取的情况下喂养14天，增加了60%的身体脂肪总量和胰岛素耐受性。
对无菌小鼠和正常饲养小鼠的研究表明微生物促进了肠道内的单糖吸收，最终诱导了肝脏脂肪的新合成。
禁食诱导脂肪细胞因子（Fiaf），一种血管生成素样蛋白，在正常饲养小鼠的肠上皮细胞中被选择性的抑制。
对无菌小鼠和正常饲养小鼠，普通小鼠和Fiaf基因敲除小鼠的分析表明，Fiaf是一种循环脂蛋白脂肪酶抑制剂，它的抑制作用对由微生物引发的脂肪细胞中三酸甘油酯的沉积必不可少。
对Rag1—/—动物的研究表明这些宿主反应并不需要成熟的淋巴细胞。
我们的发现证明了肠道微生物对宿主从饮食中获取能量起着重要作用。
目前世界上有超过5亿人超重，其中有2.5亿人属于肥胖。
这种增长的流行病威胁着不管是发达国家还是发展中国家，同时引起了一些并发症，包括II 型糖尿病、高血压、心血管疾病和非酒精性脂肪性肝炎。
在美国，64%的成年人超重或肥胖，促使卫生局把这种状况看作是如今公众健康最大的威胁。
大多数人无法做到终身的、对体重控制有意义的饮食习惯改变。
因此，改进食物成分或者发现新的药物作用靶点来减少能量的摄取、吸收和储存对公众的健康有长足的重要性。
人类的肠道中含有数量巨大的微生物群。
这些群落至少包含着1013个细菌，主要是厌氧菌，大约有500—1000个种类，他们总的基因组大概是人类的100倍。
我们可以把微生物看作是新陈代谢的器官，这个器官能精确的调控我们的生理机能——但是我们自身却没有进化出这个器官。
这个器官能处理我们食物中其他难以消化的部分，比如植物多糖。
明确微生物控制的信号通路为找到新的作用靶点以促进人类的健康提供了机会。
IL-10对胰腺功能影响的研究
摘要摘要背景：糖尿病已经成为威胁全球人类健康的非传染性疾病之一，根据世界卫生组织的报道，高血糖在全球范围内，成为继烟草及高血压之后，第三致死的威胁因素。
据国际糖尿病联盟的最新数据统计，2016年全球已有约4.15亿18岁以上糖尿病患者，据估计，18岁以上糖尿病患者将在2040年增加至6.42亿人。
1型糖尿病仅占糖尿病的10％至15％，它是一种Th1介导的自身免疫性疾病，主要表现为抗原特异性T细胞选择性破坏产生胰岛素的胰腺β细胞。
而白介素10（Interleukin-10，IL-10）作为一种有效的抗炎细胞因子，是Th1型免疫反应的强抑制剂。
基因靶向破坏内源性IL-10使机体对原本非病原性的炎症刺激极为敏感，并放大了Th1介导的炎症反应。
因此预期当机体缺乏IL-10时可能会发展为自身免疫性糖尿病，虽然已有研究表明IL-10缺乏的NOD（非肥胖糖尿病）小鼠中自发性糖尿病的发生率与对照的NOD小鼠相似，但是当非NOD小鼠缺乏IL-10时是否会发展为自身免疫性糖尿病还是未知的。
目的：本研究希望通过利用IL-10基因敲除小鼠，探究IL-10缺乏是否是1型糖尿病的发病机制之一，并且进一步探究IL-10的缺失对胰腺功能的影响。
方法：本研究首先监测IL-10基因敲除小鼠空腹血糖变化后，用免疫组织化学进行染色对IL-10敲除小鼠的胰岛组织进行观察；通过qpcr及ELISA检测小鼠胰岛素以及胰高血糖素分泌情况，最后进一步利用免疫组织化学染色及qpcr的方法对血糖异常的机制进行探讨。
结果：本研究发现，相比于WT小鼠，IL-10基因敲除导致小鼠血糖异常降低；IL-10基因敲除小鼠胰岛组织中，胰高血糖素的表达升高，胰岛素表达及血清中含量降低，胰腺组织免疫荧光染色结果发现胰岛组织中α细胞增生。
这一结果与预期相反，并且胰岛组织中激素变化与小鼠血糖变化相矛盾，进一步对血糖降低机制探究发现，IL-10基因敲除导致胰岛组织糖吸收代谢异常，提示IL-10基因敲除可能导致其他与血糖调控相关组织因糖吸收代谢异常受损，进一步导致了血糖降低。
小鼠白细胞介素-10IL-10酶联免疫分析ELISA
小鼠白细胞介素-10（IL-10）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆及相关液体样本中小鼠白细胞介素-10（IL-10）含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠白细胞介素10（IL-10）水平。
用纯化的小鼠白细胞介素10抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入小鼠白细胞介素10，再与HRP标记的IL-10抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的IL-10呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠白细胞介素10（IL-10）浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成 48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×48 1×96 2-8℃保存标准品：900pg/mL 0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
小鼠粪菌实验报告
一、实验背景肠道菌群是人体内最重要的微生物群落之一，与人类健康和疾病密切相关。
近年来，粪菌移植（Fecal Microbiota Transplantation，FMT）作为一种治疗肠道菌群失调的方法，受到了广泛关注。
本实验旨在通过小鼠粪菌移植，研究肠道菌群对小鼠生理和病理状态的影响，为临床应用提供理论依据。
二、实验目的1. 采集健康小鼠的粪便，提取其中的细菌；2. 将提取的细菌进行培养、鉴定和纯化；3. 将纯化的细菌移植到无菌小鼠体内，观察其对小鼠生理和病理状态的影响；4. 分析肠道菌群对小鼠生理和病理状态的影响机制。
三、实验材料1. 实验动物：昆明小鼠，雌雄各半，体重20-25g；2. 试剂：无菌生理盐水、胰蛋白酶、DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、测序试剂盒等；3. 仪器：离心机、培养箱、PCR仪、测序仪等。
四、实验方法1. 小鼠粪便采集：将小鼠粪便收集于无菌容器中，置于-80℃冰箱保存。
2. 细菌提取：将粪便样本在室温下解冻，加入无菌生理盐水，充分混匀后，用无菌滤纸过滤去除杂质。
3. 细菌培养与鉴定：将过滤后的细菌悬液接种于琼脂平板，置于37℃培养箱中培养24小时，观察菌落形态，并进行细菌鉴定。
4. 细菌纯化：挑取典型菌落，接种于新平板，重复培养，直至获得纯化菌株。
5. 粪菌移植：将纯化菌株接种于无菌小鼠体内，观察小鼠生理和病理状态的变化。
6. 肠道菌群分析：对移植前后小鼠肠道菌群进行高通量测序，分析菌群结构变化。
五、实验结果1. 成功提取了小鼠粪便中的细菌，并进行了鉴定和纯化；2. 纯化菌株移植后，无菌小鼠的生理和病理状态发生了明显变化，表现为肠道菌群结构改变、肠道功能改善等；3. 高通量测序结果显示，移植前后小鼠肠道菌群结构发生了显著差异，可能与生理和病理状态的变化有关。
六、实验讨论1. 本实验成功实现了小鼠粪菌移植，并观察到了肠道菌群对小鼠生理和病理状态的影响；2. 纯化菌株移植后，无菌小鼠的肠道菌群结构发生了显著变化，可能与肠道功能改善有关；3. 高通量测序结果显示，移植前后小鼠肠道菌群结构发生了显著差异，为临床应用粪菌移植提供了理论依据。
IL—10和锂对肿瘤细胞及正常细胞的生物调节作用
IL—10和锂对肿瘤细胞及正常细胞的生物调节作用
钟梅;袁勇
【期刊名称】《中国免疫学杂志》
【年(卷),期】1996(012)003
【摘要】观察了ＩＬ－１０及锂对瘤细胞系的数种生物调节作用，包括瘤细胞系的增殖，细胞表面标志改变，瘤细胞分化的诱导，并观察了ＩＬ－１０及锂对肿瘤及正常小鼠巨噬细胞ＮＯ释放的影响，ＩＬ－１０对小细胞肺癌（ＳＣＬＣ），膀胱癌（ＢＩＵ８７）、胃癌（７９０１）及单核细胞淋巴瘤（Ｕ９３７）均有增殖抑制作用。
ＩＬ－１０增强小细胞肺癌肿瘤相关抗原的表达及Ｕ９３７的ＭＣＨⅡ类抗原表达。
ＴＰＡ诱导Ｕ９３７的分化可被ＩＬ－１０
【总页数】4页(P163-166)
【作者】钟梅;袁勇
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】R730.51
【相关文献】
1.桦褐孔菌多糖对溃疡性结肠炎大鼠模型血清IL-6、IL-10的调节作用 [J], 李越;郝秀春;甘凤丽;赵洪艳;王利;单志芹
2.黄连素对2型糖尿病大鼠血脂调节作用及对IL-6、IL-10及CRP水平的影响 [J], 左秀玲;朴金龙;薛丰田;赵喜新
3.IL-1β、IL-6、IL-10在慢性牙周炎不同临床阶段的免疫调节作用 [J], 莫丽妮;林
旭征
4.高效免疫调节剂对S180肉瘤小鼠IL-6及IL-10表达的调节作用 [J], 常欣峰;宋春花;罗宝英;罗亚楠;李欢;黄志华;韩立民
5.胸腺肽-α1对脓毒症患者血清IL-8及IL-10的调节作用 [J], 李俊岭;陈秀珠;潘志国;吴汉聪;丁洪;李梅香;邓涛;苏磊
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白细胞介素-10基因敲除小鼠血液生理生化指标分析
１ ． １ 实 验 动 物 纯 合 型 Ｉ Ｌ一１ ０ Ｋ Ｏ小鼠（ １ ２ ９一 Ｉ Ｌ ｌ ０ ／ Ｊ ） 及对照组 Ｉ Ｌ一１ ０ ＷＴ小 鼠 （ Ｃ ５ ７ Ｂ Ｌ ／ ６ ） ， 雄 性， 均 购 自美 国 Ｊ ａ ｃ ｋ ｓ ｏ ｎ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ公 司。小 鼠的饲 养 和繁殖按照无特 定病原体 （ ｓ ｐ ｅ ｃ ｉ ｉ ｆ ｃ ｐ ａ ｔ ｈ ｏ ｇ ｅ ｎ ｆ ｒ ｅ ｅ ） 级 动
Ｋ Ｏ小 鼠和 ６只 Ｉ Ｌ一１ ０ ｗＴ小 鼠 ， 空腹 １ ２ ｈ ， 用 摘 除眼 球法采 血 ， 每 只取血 ０ ． ８ ｍ Ｌ ， 装入Ｅ ｐ ｐ ｅ ｎ ｄ ｏ ｆ管 中， 室温 静置 ３ ０ ｍ ｉ ｎ ， ３ ０ ０ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ离心 １ ０ ｍ ｉ ｎ ， 分离 血清 ， 用 日 立Ａ Ｕ ５ ４ ０ ０全 自动生化 分析 仪 ， 美 国罗 氏诊 断产 品有
分析 白细胞介素 一１ ０ （ Ｉ Ｌ一１ ０ ） 基 因敲 除小鼠和野生型 小鼠血液生理 生化指标差异 。方 法
与野生型小鼠比较 ， Ｉ Ｌ一１ ０基 因敲 除小鼠血液生理指标 中红细胞参数 明显 降低 ， 血小
用摘除眼球法采集 Ｉ Ｌ一１ ０基 因敲除小鼠和野生型小鼠血液 ， 用全 自动 生化分析仪及血 细胞分析仪检 测常 用血液
影响 小鼠部分的血液 、 血清生化指标。
Ｉ Ｌ一１ ０基 因缺失 可
【 关键 词】 白细胞介素 一 １ ０ ； 基 因敲除 ； 血液学 ； 生化标记物
白细胞介素 一１ ０ （ ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ｌ ｅ ｕ ｋ ｉ ｎ一 １ ０ ， Ｉ Ｌ一１ ０ ） 是一 种 分子量相 当于 １ ８～２ １ ｋ Ｄ的细胞 因子 ， 属于 Ｔ辅 助 细 胞 ２类因子 （ Ｔ ｈ ２ ） ， 由各种 淋 巴细 胞产生 ， 能抑 制多 种 炎性 细胞产生各 种炎性 细胞 因子 ， 在下调 炎症反应 中 发挥关键作用… ， 是 目前非常受关注 的抗炎介质 之一 。 建立 Ｉ Ｌ一１ ０基因敲除 （ ｋ ｎ ｏ ｃ ｋ ｏ ｕ ｔ ， Ｋ Ｏ） 动物 模型对深 入 阐明 Ｉ Ｌ一１ ０的功 能和 致病 机 制 有 十分 重 要 的意 义 。 目前该小 鼠在 国外 的报道 主要是集 中于它们 在动物模 型中的应 用 ， 以及这 些 基 因在 机体 中各 种 功 能 的研 究 ， 而它们 的生理生化 等部分 生物 学特性 未见相 关 报 道。２ ０ １ ２年 ３ —１ ２月 ， 本 实验选 取 Ｉ Ｌ一１ ０ Ｋ Ｏ小 鼠 作 为实验组 ， 以Ｉ Ｌ一１ ０野生 （ Ｉ Ｌ一１ ０ ｗ ｉ ｄ ｅ ｔ ｙ ｐ ｅ ， Ｉ Ｌ一１ ０ ｗＴ ） 小 鼠作为对照组 ， 对其 血液生 理指标 和血 清生化 指标进行检测分析 ， 为研究 Ｉ Ｌ一１ ０相关疾病 提供部分
功能性食品论文-益生菌调节肠道菌群的研究现状
天津科技大学《功能性食品学》研究生课程论文益生菌调节肠道菌群的研究现状学生姓名：······学号：······专业：营养与食品卫生学学院：食品学院摘要常见益生菌主要指两大类乳酸菌群：一类为双歧杆菌，常见的有婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌等；另一类为乳杆菌，如嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌和罗伊氏乳杆菌等。
应用于人体的益生菌有双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌和酵母菌等。
从安全性角度考虑，目前工业用益生菌主要来源于健康人体、动物和传统食物（发酵乳制品、泡菜、纳豆等发酵食品）。
国内外学者对益生菌进行了很多研究和介绍，但多数只局限于它的使用效果上，对其作用机理缺少系统而深入的总结。
本文主要以乳酸菌、双歧杆菌和芽孢杆菌为对象，综述了其在调节肠道菌群和促进机体免疫的作用机理及相关研究进展。
关键词：肠道菌群；益生菌；研究现状1.肠道菌群概况1.1胃肠道正常菌群人的胃肠道栖息着大约30个属500多种细菌，主要由厌氧菌、兼性厌氧菌和需氧菌组成。
其中专性厌氧菌占99％以上[ 1 ]，而仅类杆菌及双歧杆菌就占细菌总数的90％以上。
胃、十二指肠、空肠细菌的种类及数量极少，主要由于胃酸、胆汁作用及小肠液流量大，蠕动节奏快，细菌在繁殖前即被冲洗到远端回肠及结肠，细菌浓度<103 个/mL，主要为革兰氏阳性需氧菌，如链球菌、葡萄球菌和乳酸杆菌。
而回肠末端由于肠液流量少，蠕动减慢，细菌数逐渐增加到105 ~108 个/mL，主要含乳酸杆菌、大肠杆菌、类杆菌和梭状芽孢杆菌等[ 2 ]。
至结肠,细菌数明显增加，浓度为109~1012 个/mL，主要为厌氧菌，双歧杆菌、类杆菌和乳酸杆菌，而有潜在致病性的梭状芽孢杆菌和葡萄球菌仅有少量。
粪菌移植抗小鼠肠道菌群紊乱所致内毒素血症损伤研究
肠道菌群在动物的新陈代谢、生长发育和维持健康过程中发挥了重要作用,能调节机体免疫功能,使之处于平衡状态,从而避免或减少免疫相关疾病的发生,一旦肠道菌群紊乱将会导致机体出现内毒素血症。
研究发现抗生素混合物干预肠道菌群的小鼠,由于肠道菌群缺失会导致淋巴组织发育受损、免疫细胞内环境平衡失调,并改变胃肠道对感染性或炎性疾病的易感性[1-3]。
内毒素是一种巨分子化合物类脂多糖体,存在于革兰氏阴性菌的胞壁外膜之最外层[4]。
内毒素血症可以在多系统的多种疾病中出现,通常会造成致死性感染性休克、多器官功能衰竭、弥漫性血管内凝血等,病死率极高[5,6]。
而粪菌移植是一种将外源健康微生物群落移植到受体肠道中,从而改变患病受体的肠道微生态紊乱,使之恢复健康稳态的一种技术手段。
近年来,以FMT 为代表的菌群移植技术在人类的临床医学上得到了广泛应用,它可以有效治疗艰难梭菌等引起的肠炎等疾病[7]。
一些在猪上开展的研究表明,使用FMT 方法引入外源“健康”或者“功能”菌群能够快速、有效地改善受体动物的肠道健康,优化肠道菌群,增强免疫机能,强化代谢功能[8]。
然而,由于粪便菌群与肠道中的菌群在数量和组成上还有很大不同[9],因此有必要深入分析和确认是否肠道菌移植和粪菌移植会对动物的生理稳态和代谢进程产生差异影响。
这将为进一步优化菌群移植方法的可行性,开发更为合适的调控技术提供理论基础和技术支持,同时也为菌群移植在畜牧业生产中能够标准量化提供一定的思路。
目前,粪菌移植技术已经在人类医疗中得以应用,即将健康人粪便中的功能性菌群移植至患者胃肠道中,从而通过重建新的肠道菌群来治疗肠内、外疾病。
在畜牧业中,也可通过该技术进行肠道菌群结构的调节,从而改善内毒素血症。
本文旨在通过粪菌移植来调节小鼠的肠道菌群紊乱,抑制由于肠道菌群紊导致的内毒素血症等粪菌移植抗小鼠肠道菌群紊乱所致内毒素血症损伤研究张伟,陈雪龙,陈水云,齐艳萍(安徽科技学院动物科学学院,安徽凤阳233100)摘要:背景:肠道菌群在动物的新陈代谢、生长发育和维持健康过程中发挥了重要作用,调节机体免疫功能,使之处于平衡状态,从而避免或减少免疫相关疾病的发生。
IL-10、TNF-α在脓毒症小鼠小肠黏膜中的表达及其意义
IL-10、TNF-α在脓毒症小鼠小肠黏膜中的表达及其意义刘承远;陈海鸣【摘要】Objective The aim of our study was to investigate the role of IL-10 and TNF-αin a murine sepsis model. Meth-ods 40 BALB/c rats were randomly divided in to experimental group,which the colon ascendens stent peritonitis model (CASP) was applied,and control group. Then,the expression levels of IL-10 and TNF-α in small intestine tissues were measured by ELISA. Results Comparing with control group,significantly increased IL-10 and TNF-αlevels were observed in the CASP group. Meanwhile,TNF-α reached the maximum level much earlier than IL-10,especially in the first 6 hrs. We also demonstrated that the duration of IL-10 peak level was longer than TNF-α,which significantly higher after 72 hrs. Conclusions The severest in-flammatory response period was the first 12 hrs after CASP were applied.%目的观察白介素(interleukin,IL)-10、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α在脓毒症小鼠小肠黏膜中的表达及其意义. 方法 40只BALB/c小鼠随机分为模型组(脓毒症模型)和正常对照组,采用改良升结肠支架置入腹膜炎(colon ascendens stent peritonitis,CASP)脓毒症小鼠模型,通过ELISA法检测小肠组织匀浆IL-10、TNF-α的表达水平. 结果模型组小鼠外周血TNF-α和IL-10迅速升高,TNF-α高峰的出现早于IL-10,尤其前6h TNF-α上升明显;IL-10水平呈现高表达,持续时间长于TNF-α,直到72h后,IL-10的水平仍然较高. 结论脓毒症小鼠动物模型建立后的前12h,是炎症反应的最重阶段.【期刊名称】《江西医药》【年(卷),期】2015(050)011【总页数】3页(P1173-1175)【关键词】脓毒症;肠黏膜;细胞因子【作者】刘承远;陈海鸣【作者单位】南昌大学第一附属医院急诊外科,南昌 330006;南昌大学第一附属医院急诊外科,南昌 330006【正文语种】中文【中图分类】R631脓毒症（sepsis）是指由感染引起的全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），其病情凶险，病死率高，是外科危重症病人的常见并发症。
肠道菌群在自身免疫性疾病中的研究进展
国际免疫学杂志2021年1月第44卷第1期丨n t J丨mmunol,Jan.2021，V〇1.44，N〇.l• 91 ••综述•肠道菌群在自身免疫性疾病中的研究进展郭风宜1杨潇2高天舒31辽宁中医药大学研究生学院，沈阳11〇847;2辽宁中医药大学附属第二医院内分泌科，沈阳丨10034;3辽宁中医药大学附属医院内分泌科，沈阳110032通信作者：杨潇，Emai丨：17924糾8 @qq•com，电话:024_86802881【摘要1自身免疫性疾病（autoimmune disease, A I D)通过自身产抗体，导致免疫耐受失衡，而起的一系列慢性炎症反应，甚至对机体组织造成损伤。
目前All)发病率逐渐升高,而其确切的发病机制尚不明确肠道菌群作为人体最大的“免疫器官”，参与机体代谢，形成肠粘膜屏障,维持免疫功能1丨_:常随#对人体肠道菌群研究的深入，越来越多的结果表明肠道菌群在自身免疫反应过程中起到重要作用，可能成为今后临床对于All)治疗的新靶点文章就肠道菌群及其在All)中的研究进展进行简要概述。
【关键词】肠道菌群；自身免疫性疾病;免疫反应基金项目：国家自然科学基金（81503474,81874441 );辽宁省科技厅自然基金项目（2019-MS-207 );辽宁省教育厅项目（L201923 );辽宁中医药大学中医脏象理论及应用国家教育部重点实验室项H(zyzxl804)D O I：10. 3760/cma. j. issn. 1673^394. 2021.01.016Research progress of gut microbiota in autoimmune diseasesGuo Fengyi'，Ycmg Xiao_，Gao Tianshu、^Graduate School, Liaoning University o f Traditional Chinese Medicine .Shenyang W0S41 .China Department ofEndocrinology y the Second Affiliated Hospital, Shenyang1\ 0034 .China DefKirtment o f Endocrinology^ AffiliatedHospital o f Liaoning University o f Traditional Chinese Medicine, Shenyang110032, ChinaCorresponding author：Yang Xiao, Email： 17924948@ qq. com , Tel：************【A bstract】Autoimmune diseases ( AID) cause a series of chronic inflammatory reactions by the production of antibodies,leading to imbalance of immune tolerance,and even damage the body tissues. The incidence ofAID has been increasing in recent year,l>ut the exact pathogenesis is unclear. As the largest " immune organ" ofhuman body,gut microbiota participales in the organic metabolism,forming intestinal mucosal barrier and maintaining normal immune function. With the further research on gut microbiota, more and more research resultsshow that gut microbiota plays an important role in the process of auloimmune response, which may be a newiherapeutic target for AIL). In this paper,the gut microbiota and its research progress in AID were briefly summarized.【Key words】Gut microbiota;Autoimimme disease;Immune responseFund program ：National Natural Science Foundation(81503474,81874441 ) ；IJaoning Provincial Department of Science and Technology Natural Fund Project(2019-MS-207) ； Liaoning Provincial Departmenl of Kdu-cation Project( L201923) ;Key Laboratory Project of the Ministry of Education for the Theory and Application ofTCM Viscera of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine( Zyzx1804)DOI ： 10. 3760/cma. j. issn. 16734394. 2021.01.016自身免疫性疾病（a u t o i m m u n e disease,A I D)是 并损害机体的慢性炎症性疾病，其发病率逐年升高，一种对自身抗原发生免疫反应，产生大量淋巴细胞，但发病机制尚不明确目前治疗以对症治疗为主，• 92•国际免疫~?:杂忐2021<|:I)|第44卷第I期丨丨丨丨J Immum丨U i m.202l ,V〇l.44,!\(>. I激素或诘抗剂控制炎症或者手术治疗都不能彻底治 愈，只能缓解症状。
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桂林医学院毕业设计（论文）正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠肠道菌群多态性分析院系: 生物技术学院学号: *********: **专业: 2009级生物技术****: ***2013年5月22日星期三正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠肠道菌群多态性分析2009级生物技术程骏指导老师朱嗣博摘要【目的】设计应用T-RFLP技术，对正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠的肠道菌群进行多态性分析；【方法】设计一个引物的5‘末端用荧光物质标记（常用荧光物质有HEX,TET,6-FAM等），使样本DNA经PCR后都带有这种荧光物质；【结果】PCR 产物经纯化后酶切，可以先进行琼脂糖凝胶电泳，最后对酶切后的产物末端进行测序得到了T-RFLP 峰谱图, 该图谱能够快速准确地对不同种的菌群进行定性、定量的分析；【结论】成功使用T-RFLP技术对正常小鼠和IL10基因敲除小鼠的肠道菌群进行多态性分析，得到两种小鼠肠道菌群的差异性，经分析可以得到一种或几种菌群对于IL-10有特殊的联系。
对于IL-10的应用有重要作用。
关键词 T-RFLP技术；基因图谱；IL-10基因Il-10 GENE knockout mice and normal mice intestinal florapolymorphism analysis2009-biotechnology Cheng Jun Supervisor ZhuSibo Abstract 【Objective 】Designing application of T - RFLP technique, the normal mice and IL-10 knockout mice intestinal flora polymorphism analysis. 【Methods 】Designing a primer 5 'terminal marked with fluorescent substances (commonly used fluorescent substance has a HEX, TET, 6 - FAM, etc.), after making the sample DNA by PCR with the fluorescent substance. 【Results 】PCR product after purification of the enzyme, can first carries on the agarose gel electrophoresis, finally after enzyme digestion of the end product sequencing got T - RFLP peak spectra, the map can rapidly and accurately for different kinds of microbes for qualitative and quantitative analysis. 【Conclusion 】Successful using T - RFLP technique of IL-10 knockout mice and normal mice intestinal flora polymorphism analysis, get the differences of two kinds of intestinal flora in mice, by the analysis of one or several kinds of bacteria can be have a special connection for the IL - 10. For the application of IL - 10 play an important role.Key words T - RFLP technique; Gene mapping; Il-10 gene首先介绍一下IL-10，在1989年，Mosmannand及他们的同事描述了一种新的免疫介质，由Th2细胞克隆分泌，能够抑制Th1细胞克隆IL-2和IFNr的合成。
早期被命名为细胞因子合成抑制因子（CSIF），这种因子后来被命名为IL-10，在这被发现的21年期间，很多研究深入剖析了这个细胞因子的生物学特性.IL-10的分子量为35～40kd，通常为二聚体；主要由TH2细胞产生，也可由单核细胞、角质细胞及活化的B细胞产生。
IL-10能够抑制活化的T 细胞产生细胞因子，因此曾称为细胞因子合成抑制因子（csif），特别是抑制th1细胞产生il-2、ifnγ和lt等细胞因子，从而抑制细胞免疫应答。
IL-10可降低单核－巨噬细胞表面mhcⅡ类分子的表达水平，损害了apc的抗原递呈能力，实际上这可能是其抑制细胞介导免疫的原因。
此外，IL-10还能抑制NK细胞活性，干扰NK细胞和巨噬细胞产生细胞因子；但可刺激B 细胞分化增殖，促进抗体生成。
近年来分子生物学技术已被广泛地应用于微生物群落结构分析, 主要的研究方法包括: 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)、荧光原位杂交法( Fluorescence in situhybridization, FISH)、限制性酶切片段长度多态性分析法(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)、变性梯度凝胶电泳法 (Denaturinggradient gel electrophoresis, DGGE)和末端限制性片段长度多态性分析(Terminal restrictionfragment length polymorphism, T-RFLP)等[1]。
T-RFLP的技术原理是根据的保守区设计通用引物，其中一个引物的5‘末端用荧光物质标记，常用荧光物质有HEX,TET,6-FAM等。
提取待分析样的中DNA，以他为模板进行PCR扩张，所得到的PCR产物的一段就带有这种荧光标记，然后PCR产物有合适的限制性内切酶进行消化，一般选用酶切位点为4bp的限制性内切酶。
由于在不同细菌的扩增片段内存在核苷酸序列的差异，酶切位点就会存在差异，酶切后就会产生很多不同长度的限制性片段。
消化产物用自动测序仪进行测定，只有末端带有荧光性标记的片段能被检测到。
因为不同长度的末端限制性片段必然代表不同的细菌，通过检测这些末端标记的片段就可以反应微生物群落组成情况[2]。
这种方法还可以进行定量分析，在基因扫描图谱上，每个峰面积占总峰面积的百分数代表这个末端限制性片段的相对数量，即末端限制性片段的数量越大其所对应的面积越大[3]。
一、材料和实验流程1、实验材料、试剂和设备1.1实验材料：正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠的粪便以及它们的肠道组织。
样本有两组,一组样本有十六个,另一组样本有八个。
1.2实验试剂：细菌基因组DNA 提取试剂盒，PCR 反应体系所需试剂DNA 聚合酶、dNTP、buffer、上下游引物（自己设计，标记荧光，交由生工合成），纯化试剂盒，酶切反应体系所需试剂酶、buffer，DNA电泳液电泳所需试剂琼脂糖凝胶、电泳液、marker、loading等。
1.3实验设备：移液枪，枪头，PCR仪，金属浴仪，DNA电泳仪，灭菌锅，离心机，振荡器，PH计，净化工作台，DNA分析测序仪（交由生工分析）等。
2、实验流程2.1 细菌基因组DNA提取（小鼠粪便基因组提取试剂盒）1）将样品加到2ml的EP管中；2）加400ulAP1和4ulRNaseA，65℃温浴10min，每三分钟颠倒混匀一次（温浴时间可适当延长）；3）加130ulAP2，混匀，冰浴5min，14000rpm 5min；4）将上清转移到2ml吸附柱内，14000rpm 5min；5）将收集管内上清移入一个新的EP管内，不可有沉淀，加入1.5倍的AP3，混匀；6）分次将混合液移入一个新的2ml吸附柱内，8000rpm 1min，弃掉收集管中液体；7）将吸附柱移入一个新的收集管内，加500ulAW，8000rpm 1min，弃掉收集管中液体；8）再加500ulAW，14000rpm 2min；9）将吸附柱移入一个2ml的EP管内，加100ul超纯水（55℃）洗脱，室温静置5min，8000rpm 1min，在通风处放置1min，再重复一次效果更佳。
2.2 引物设计上游引物8F(5′-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3′)，在5′末端加上荧光物质6-FAM 标记，下游引物806R(5′-GGACTACCRGGGTATCTAA-3′)，在5′末端用HEX进行标记[4][5][6]。
2.3 PCR扩增反应O代替模板PCR 扩增反应体系采用50 μL, 模板量为2 μL, 阴性对照用ddH2DNA。
PCR 扩增条件为: 94 °C 5min;94 °C 30 s, 52 °C 30 s,72 °C 2 min, 共30 个循环; 72 °C 10 min。
PCR反应完成后用DNA凝胶回收试剂盒切胶回收800bp 位置的DNA条带。
2.4 限制性内切酶酶切选用HhaⅠ作为实验的限制性内切酶。
酶切体系采用40 μL, PCR 产物为6 μL,在37 °C 酶切6 h, 反应完成后, HhaⅠ在65 °C 水浴中20 min失活。
2.5 琼脂糖凝胶电泳分析在酶切完全之后，取5ul的酶切液进行电泳，140V，30min，看电泳条带，一般这个条带会很淡，因为主条带被切碎成很多的片段，大小不一，分布的很开，因此我们主要还是看800bp位置的条带是否还是存在，一般酶切完全之后这个位置的条带基本就已经没有了，其实在酶切的过程中就会进行多次电泳来决定其酶切的时间和程度，以便于及时停止酶切反应，保证酶切的质量。
2.6 T-RFLP分析的流程图上面是两张简易的T-RFLP流程图，可以比较直观方便了解其实验的步骤：2.7 T-RFLP图谱预处理对于每个图谱，去除荧光强度小于100和片段大小≦35或者≥500的片段数据，将剩下片段的峰面积进行标准化处理，并去除相对丰度小于1％的片段[7][8]。
2.8 数据分析将T-RFLP的数据转换成1～0矩阵（1表示有，0表示无），利用SPSS16.0中的聚类分析工具（Classifiy-hierarchical Analysis），采用非加权配对算法平均法对每组样本进行聚类分析。
接下来用软件SPSS16.0进行物种丰度（S）和Shannon-Weiner指数（H）的计算,结果用图表显示。