酶转化虎杖苷制备白藜芦醇_董学伟
虎杖中白藜芦醇的酶法制备
虎杖中白藜芦醇的酶法制备
宋宏新;传娟娟;刘静
【期刊名称】《西北植物学报》
【年(卷),期】2010(030)012
【摘要】以白藜芦醇得率为指标,通过对酶制剂的筛选和酶解条件的考察,分别选出酶法提取和酶法转化制备虎杖中白藜芦醇的最佳条件,并对两种酶法进行比较.结果显示:(1)酶法提取最佳酶解条件为:酶解温度45℃,酶解时间60 min,最适pH 5.0,底物浓度17%;酶法转化最佳酶解条件为:酶解温度40℃,酶解时间48 h,最适pH 5.0,底物浓度15%.(2)与空白样品(不加酶)相比,酶法提取白藜芦醇得率增加了3.12 mg/g;酶法转化白藜芦醇得率增加了12.72 mg/g.研究表明,两种方法与不加酶提取相比均提高了白藜芦醇的得率,但酶法转化效果更显著,可用于白藜芦醇的制备.【总页数】5页(P2550-2554)
【作者】宋宏新;传娟娟;刘静
【作者单位】陕西科技大学,生命科学与工程学院,西安,710021;陕西科技大学,生命科学与工程学院,西安,710021;陕西科技大学,生命科学与工程学院,西安,710021【正文语种】中文
【中图分类】Q503
【相关文献】
1.酶转化虎杖苷制备白藜芦醇 [J], 董学伟;余慧琳;陈莉;张春枝
2.酶联半仿生法提取虎杖中白藜芦醇工艺研究 [J], 陈帅;王慧竹;王万超;崔喜秀
3.响应面法优化虎杖中虎杖苷和白藜芦醇的匀浆提取 [J], 周军;徐雷涛;熊曼;董兰改;李湘洲;;;;;;
4.传统提取法和酶转化法从虎杖中制备白藜芦醇的比较研究 [J], 周丽芳;田秋;刘丽;王涛;宋丽华
5.响应面法优化虎杖中虎杖苷和白藜芦醇的匀浆提取 [J], 周军;徐雷涛;熊曼;董兰改;李湘洲
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从虎杖中提取纯度98%以上的白藜芦醇的工艺[发明专利]
![从虎杖中提取纯度98%以上的白藜芦醇的工艺[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/4eb58c1cb5daa58da0116c175f0e7cd18425189b.png)
[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公布说明书[11]公开号CN 101338327A [43]公开日2009年1月7日[21]申请号200810032067.8[22]申请日2008.08.13[21]申请号200810032067.8[71]申请人长沙华诚生物科技有限公司地址410013湖南省长沙市岳麓大道湖南科技大厦18楼[72]发明人刘庚贵 曾润清 黄华学 刘永胜 [74]专利代理机构长沙星耀专利事务所代理人赵静华[51]Int.CI.C12P 7/22 (2006.01)C07C 37/68 (2006.01)C07C 39/21 (2006.01)权利要求书 1 页 说明书 4 页[54]发明名称从虎杖中提取纯度98%以上的白藜芦醇的工艺[57]摘要本发明公开了从虎杖中提取纯度98％以上的白藜芦醇的工艺。
是将虎杖药材经粉碎后由乙醇提取，浓缩回收乙醇后经虎杖专用酶在45℃~50℃恒温酶解4~5天；升温至85－100℃，维持2分钟，将虎杖专用酶灭活；过滤，滤渣即为经过转化的粗品白藜芦醇；再用虎杖专用絮凝剂絮凝沉淀，过滤，清液经氧化铝层析精制，洗脱液再经醇-纯化水结晶与重结晶和真空干燥得成品。
实现将白藜芦醇的纯度提高到98％以上，将产品收率从0.4％~0.5％提高到0.6％以上，并将白藜芦醇的颜色做白且无杂色，提高产品质量，并能真正应用于工业生产，可缩短生产周期，提高工作效率，降低生产成本。
200810032067.8权 利 要 求 书第1/1页 1.一种从虎杖中提取纯度98％以上的白藜芦醇的工艺，其特征在于，包括以下步骤：(1)虎杖药材粉碎到通过1号筛≥70％；(2)乙醇提取；加入虎杖重量5～6倍的60％乙醇；提取三次，每次1-2小时；(3)浓缩与回收乙醇；将3次虎杖提取液按已有技术回收乙醇至无醇味，浓缩至相对密度1.15左右。
(4)酶解与灭活：将虎杖提取浓缩液冷却至45℃~50℃，在45℃~50℃之内；加入枸椽酸或柠檬酸调节浓缩液的pH值为4.5~5.0，再加入虎杖药材重量0.2％~0.5％虎杖专用酶在45℃~50℃恒温酶解4~5天；升温至85-100℃，维持2分钟，将虎杖专用酶灭活；过滤，滤渣即为经过转化的粗品白藜芦醇；(5)絮凝沉淀：将粗品白藜芦醇用65％~85％乙醇溶解，过滤；加入粗品白藜芦醇湿重0.8~1.0倍的虎杖专用絮凝剂，充分搅拌10min，然后静置2h，使沉淀充分沉淀，上清液分层良好；过滤，得滤液；(6)层析精制：将滤液进氧化铝层析柱，自有液体流出时开始收集；将液体进行分段，自流出红至黑色液体时更换氧化铝柱；待全部滤液进完氧化铝柱以后，再用用65％~85％乙醇洗脱，一直洗脱至流出液加2倍水不产生混浊止；(7)结晶与重结晶：将氧化铝柱上的流出液加水进行结晶与重结晶，调节乙醇浓度为10％~20％，静置1h，然后过滤，重结晶，直至结晶颜色洁白为止；(8)将结晶真空干燥得成品，成品中白藜芦醇≥98％。
酶转化虎杖苷制备白藜芦醇_董学伟
图 1 酶反应温度对白藜芦醇生成量的影响
2. 3 酶转化虎杖苷 pH 值的确定 虎杖苷溶液中加入适量酶, 60 e , 不同 pH 条件
下反应 30 min, 水饱和正丁醇终止酶反应, 检测白藜 芦醇的生成量, 确定酶反应 pH 。结果显示, pH 为 5. 0 时白藜芦醇的生成量较大( 图 2) 。
8 李代, 吕腾飞 , 张 春枝. 虎 杖活 性成 分的 提取 与分 离[ J] . 大连轻工业学院学报, 2005, 24( 3) : 189~ 191
以虎杖苷为底物进行酶反应, 酶加量为 01 3% 。 用等体积的水 饱和正 丁醇终止 酶反应, T L C 检测。 分别对反应温度、pH 、底物浓度、反应时间进行优化,
根据白藜芦醇的生成量来确定反应的适宜条件。
2 结果与讨论
2. 1 虎杖苷的制备 虎杖饮片 5kg, 80% 乙醇提取得虎杖乙醇提取物
5 Rommel A , W rolstad R E. Influence of acid and base hydr olysis on the pheno lic co mpo sitio n o f red raspberry juice [ J] . J Ag r F oo d Chem A, 1993, 41: 1 237~ 1 241
葡萄皮和虎杖是白藜芦醇生产的主要原料。虎 杖中白藜芦醇的含量较低, 虎杖苷的含量较高, 还有 一定量的白藜芦醇苷。若将虎杖苷和白藜芦醇苷转 化成白藜芦醇, 会大大提高白藜芦醇生产得率, 降低 成本。酸、碱水解可完成上述转化[ 5] , 但酸碱的应用 会造成环境的污染; 纤维素酶和微生物发酵也可完成 上述转化[ 6, 7] 。实验中所使用 的酶是通过诱 导产生 的, 具有水解效率高, 专一性强等优点。
酶转化虎杖苷制备白藜芦醇
酶转化虎杖苷制备白藜芦醇
董学伟;余慧琳;陈莉;张春枝
【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2008(034)012
【摘要】白藜芦醇是一种植物雌激素,具有多种生理功能.文中采用微生物酶对转化虎杖苷制备白藜芦醇,确定了酶转化条件,建立了白藜芦醇的分离纯化方法,获得了纯度高达98%的白藜芦醇样品.采用酶转化法制备白藜芦醇的得率,是虎杖直接提取法的3倍左右,且苷水解酶可循环使用.
【总页数】3页(P122-124)
【作者】董学伟;余慧琳;陈莉;张春枝
【作者单位】大连交通大学环境与化学工程学院,辽宁,大连,116028;商丘职业技术学院园林食品加工系,河南,商丘,476000;大连工业大学生物与食品工程学院,辽宁,大连,116034;大连工业大学生物与食品工程学院,辽宁,大连,116034
【正文语种】中文
【中图分类】TS2
【相关文献】
1.传统提取法和酶转化法从虎杖中制备白藜芦醇的比较研究 [J], 周丽芳;田秋;刘丽;王涛;宋丽华
2.白藜芦醇合成酶(RS)基因转化胡萝卜及高白藜芦醇转基因胡萝卜株系的筛选 [J], 林明;曹蕾;郭世辉;王育娜;夏信明;贺俐;林国华;何水林
3.虎杖苷转化菌的筛选及所产酶的性质研究 [J], 张玉千;周学;郑丹;陈蓓旖;周盟盟
4.一种酶反应装置的开发及在白藜芦醇酶法制备中的应用 [J], 蒋俊涛;林子寒;朱海东
5.微生物转化虎杖苷粗提物生成白藜芦醇的研究 [J], 袁润蕾;徐萌萌;孙艳娟;李猷;孙启玲;万端极
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3结论
现代药 理学研究结果表明, 白 藜芦醇具有抗氧 化、抗自由基作用, 对造成动脉粥祥硬化和血栓形成 的各种氧化反应起抑制作用。白藜芦醇也是源于植 物的雌性激素, 它对激素依赖性肿瘤( 包括乳腺癌、前 列腺癌、子宫 内膜 癌和卵 巢癌等) 有明显 的预防 作 用[ 11] 。
1 材料与方法
1. 1 材 料 虎杖饮片, 购自大连同仁堂大药房; 虎杖苷标准
品, 购自上海同田生化技术有限公司; 白藜芦醇标准 品, 购自中国药品生物制品检定所; 薄层层析板 Kieselgel. 60F 254, 购自 德国 Merck 公 司; 虎杖 苷水 解 酶, 大连工业大学提供; 其它化学试剂均为分析纯试 剂。
时间/ min 0 45 50 51 56
A ( 乙腈) 5
52. 5 84 100 100
B( 水) 95
47. 5 16 0 0
1. 2. 3 酶的制备 将发 酵菌 种诱 导培 养至 产酶 高 峰期, 加 0. 02
m ol/ L H Ac- NaAc 缓冲液( pH 5. 0) , 室温抽提 2h, 离 心, 上清液经硫酸铵沉淀, 缓冲液重新溶解, 即得粗酶 液, 该酶性质、催化特点另文报道[ 10] 。 1. 2. 4 酶转化虎杖苷的条件优化
将 1 kg 虎杖饮片粉碎后加 6~ 8 倍 80% 乙醇, 60 e 提取 3 次, 每次 2~ 3h。合并滤液减压浓缩、干 燥得虎杖乙醇提取物 80. 6g, H P L C 检测虎杖乙醇提 取物中白 藜芦醇含 量为 4. 48% 。 以虎杖 饮片为 基 准, 白藜芦醇提取得率为 0. 36% 。
图 3 酶反应底物浓度和反应时间对 白藜芦醇生成量的影响
2. 5 酶转化法制备白藜芦醇 取经 AB- 8 大孔树脂分离后的虎杖苷, 配制成 40
g/ L, 调 pH 为 5. 0, 加入适量酶, 60 e 反应 3 h, 除去酶。 酶反应液减压浓缩, 低温干燥, 得酶解产物白藜芦醇。 T LC 检测结果显示底物转化率为 100% ( 图 4) 。
浓度为 40g/ L 的虎杖苷底物, 加入 01 3% 的虎杖
苷水解酶, pH 5. 0, 60 e 反应 3h, 虎杖苷可完 全转化 为白藜芦醇。从虎杖中直接提取白藜芦醇, 得率约为
虎杖饮片的 0. 36% ; 采用酶转化法将虎杖苷 转化成
白藜芦醇后再提取, 得率为虎杖饮片的 1. 05% 。酶
转化法制备白藜芦醇得率是直接提取法的 3 倍, 且转 化后的酶活力降低小, 可循环使用。经硅胶柱层析分
图 1 酶反应温度对白藜芦醇生成量的影响
2. 3 酶转化虎杖苷 pH 值的确定 虎杖苷溶液中加入适量酶, 60 e , 不同 pH 条件
下反应 30 min, 水饱和正丁醇终止酶反应, 检测白藜 芦醇的生成量, 确定酶反应 pH 。结果显示, pH 为 5. 0 时白藜芦醇的生成量较大( 图 2) 。
虎杖苷和白藜芦醇的定性分析采用薄层层析法 ( T L C) , 展开剂采用氯仿- 甲醇- 水体系( 体积比 4. 5 B 2 B 1) , 265nm 紫外光检测[ 8] 。
虎杖苷和白藜芦醇的定量分析采用高效液相色 谱法[ 9] , 改进后色谱条件: O D S( C18) 反相色谱柱; 流 速, 1m L/ min; 柱温, 30 e ; 检测波长, 270nm ; 进样量, 5LL; 乙腈- 水系统洗脱梯度, 程序如下:
离, 白藜芦醇的纯度可达到 98% 。可见, 酶转化法制
备白藜芦醇简单、高效、经济, 可实现工业化生产。
参考文献
1 1 骆苏芳, 张佩文, 李锐松. 虎杖 结晶 4 号 对兔血管 的舒 张作用[ J] . 第一军医大学学报, 1992, 12( 1) : 10~ 13
2 刘兆平, 霍军生. 白藜芦醇的生物学作用[ J] . 国外 医学卫 生学分册, 2002, 29( 3) : 146~ 148
6 向海艳, 周春山, 陈龙胜, 等. 酶法 提取虎 杖中白藜 芦醇 新工艺研究[ J] . 林产化学与工业, 2004 , 24( 4) : 77~ 80
7 田天丽, 沈竞, 徐萌萌, 等. 虎杖中虎 杖苷的 微生物发 酵转 化研究 [ J] . 四川 大 学学 报 ( 自然 科 学 版) , 2008, 45( 2) : 437~ 440
8 李代, 吕腾飞 , 张 春枝. 虎 杖活 性成 分的 提取 与分 离[ J] . 大连轻工业学院学报, 2005, 24( 3) : 189~ 191
第一作者: 硕士, 工程师( 张春枝为通讯作者) 。 * 辽宁省教育厅资助项目( 2004D 212)
收稿日期: 2008- 01- 22, 改回日期: 2008- 12- 12
122 2008 Vol1 34 No1 12 (Total 252)
1. 2 方 法 1. 2. 1 虎杖苷的制备
虎杖饮片粉碎后加 6~ 8 倍体积分数为 80% 的 乙醇, 60 e 提取 3 次, 每次 2~ 3 h。合并滤液减压浓 缩、干燥得虎杖乙醇提取物。虎杖乙醇提取物溶解后 上 A B- 8 大孔吸附树脂柱, 30% 乙醇洗脱。洗脱液 减压浓缩、干燥得虎杖苷粗品。 1. 2. 2 虎杖苷和白藜芦醇的分析
虎杖苷溶液中加入适量酶, pH 5. 0, 不同温度下 反应 30 m in, 水饱和正丁醇终止酶反应, 检测白藜芦 醇的生成 量, 确定酶 反应温 度。结 果显示, 温 度为 60 e 时白藜芦醇的生成量较大( 图 1) 。
生产与科研经验
实验结果显示, 底物完全转化所需要的时间和底 物浓度有关, 底物浓度为 10 g/ L 时, 0. 5 h 就可完全 转化; 底物浓度为 20 g/ L 时, 1 h 完全转化; 底物浓度 为 40 g/ L 时, 3 h 完全转化; 底物浓度为 80 g / L 时, 3 h 转化率为 50% , 延长反应时 间至 6 h, 底物 也未能 完全转化( 图 3) 。据此确定底物浓度选用 40g/ L , 反 应时间 3h。
摘 要 白藜芦醇是一种植物雌激素, 具有多种生理功能。文 中采用微生 物酶对 转化虎 杖苷制 备白藜 芦醇, 确 定了酶转化条件, 建立了白藜芦醇的分离纯化方法, 获得了纯度 高达 98% 的白藜芦 醇样品。采用 酶转化法制 备 白藜芦醇的得率, 是虎杖直接提取法的 3 倍左右, 且苷水解酶可循 环使用。 关键词 虎杖苷, 虎杖苷水解酶, 白藜芦醇
食品与发酵工业 FOOD AND F ERME NT AT ION INDU STRIES
酶转化虎杖苷制备白藜芦醇*
董学伟1 , 余慧琳2 , 陈 莉3 , 张春枝3
1( 大连交通大学环境与化学工 程学院, 辽宁 大连, 116028) 2( 商丘职业技术学院园林食品加工系, 河南 商丘, 476000) 3( 大连工业大学生物与食品工程学院, 辽宁 大连, 116034)
3 傅蓓蓓, 杜冰, 朱振勤, 等. 白藜芦醇 抗肿瘤 机制研究 进展 [ J] . 国外医学肿瘤学分册, 2003, 30( 5) : 357~ 360
4 Kimur a Y , O kuda H. Resverat rol isolated fr om Po ly gonum cuspidatum r oot pr events t umo r g ro wth and metast asis to lung and t umo r- induced neovascular izat ion in L ew is L ung car cino ma- bear ing mice[ J] . J N utr, 2001, 131: 1 844 ~ 1 849
虎杖饮片 1 kg 粉碎后加 6~ 8 倍 80% 乙醇, 60 e 提取 3 次, 每次 2~ 3 h。合并滤液减压浓缩, 除去乙 醇后的提取物用 水溶解成混悬液, 调 pH 为 5, 加入 适量酶溶液, 60 e 反应 3~ 4 h, 加入 3 倍量 95% 乙醇 终止反应并沉淀出酶。过滤, 滤液减压浓缩、干燥得 虎杖酶解产物 84. 2g, H PL C 检测虎杖酶解产物中白 藜芦醇含量为 12. 48% 。以虎杖饮片为基准, 白藜芦 醇提取得率为 1. 05% 。 2. 8 白藜芦醇的分离纯化
438 g, 得率为 8. 76% 。虎杖乙醇提取物充分溶解后 上 AB- 8 大孔树脂吸附层析柱, 循环直至样品全部 吸附。3~ 4 倍柱体积的去离子水洗脱后, 以 30% 的 乙醇洗脱。洗脱 液减压 浓缩, 低温 干燥, 得虎 杖苷 68. 2 g 粗品。以虎杖饮片为基准, 得率为 1. 36% 。 2. 2 酶转化虎杖苷温度的确定
5 Rommel A , W rolstad R E. Influence of acid and base hydr olysis on the pheno lic co mpo sitio n o f red raspberry juice [ J] . J Ag r F oo d Chem A, 1993, 41: 1 237~ 1 241
以虎杖苷为底物进行酶反应, 酶加量为 01 3% 。 用等体积的水 饱和正 丁醇终止 酶反应, T L C 检测。 分别对反应温度、pH 、底物浓度、反应时间进行优化,
根据白藜芦醇的生成量来确定反应的适宜条件。
2 结果与讨论
2. 1 虎杖苷的制备 虎杖饮片 5kg, 80% 乙醇提取得虎杖乙醇提取物
图 2 酶反应 pH 对白藜芦醇生成量的影响
2. 4 酶转化虎杖苷底物浓度和反应时间的确定 不同浓 度的 虎杖苷 溶液 中加 入适 量酶, 60 e ,
pH 5. 0 条件下反应不同时间, 水饱 和正丁醇终止酶 反应, 检测白藜芦醇苷的生成量, 确定酶反应底物浓 度和反应时间。