ISHprotocol荧光原位杂交技术实验方案
荧光原位杂交实验步骤
荧光原位杂交实验步骤嘿，咱今儿个就来讲讲这荧光原位杂交实验步骤哈！这实验呢，就像是一场精心编排的舞蹈，每一个步骤都得踩准点儿。
先说说样本准备吧，这就好比是给舞蹈演员选好合适的服装和道具。
得把样本处理得妥妥当当的，不能有一点儿马虎。
要是样本没弄好，那后面的步骤可就都白搭啦！你说这重要不？接下来是探针标记，这就像是给舞蹈演员化上独特的妆容，让他们在舞台上更加耀眼。
得把探针标记得精准无误，这样才能在后续的过程中准确找到目标呀。
然后就是杂交啦！这就好像是舞蹈演员们在舞台上开始尽情舞动。
要让探针和样本完美结合，就像舞者之间的默契配合一样。
这可不是随随便便就能做到的哟！杂交之后还得进行洗涤，这就好比是舞蹈结束后给演员们清理一下身上的汗水和灰尘。
把那些多余的、不需要的东西都洗掉，只留下最精华的部分。
再之后就是检测啦！这就像是观众们在欣赏舞蹈表演，要能清楚地看到演员们的精彩表现。
通过检测，我们才能知道实验的结果到底怎么样。
最后是分析数据，这就像是对舞蹈表演进行评价和总结。
看看哪些地方做得好，哪些地方还需要改进。
这一步可不能小瞧，它能让我们不断进步呢！你想想看，要是在实验过程中有一步没做好，那不就跟舞蹈中有人跳错了步子一样明显吗？所以啊，每一个步骤都得仔仔细细、认认真真地去做。
做这个实验就跟盖房子似的，每一块砖都得放稳了，房子才能坚固。
咱可不能图快就马马虎虎地做，那最后肯定得出问题呀！这荧光原位杂交实验可是个精细活儿，得有耐心、有细心，还得有那么点儿小技巧。
咱可不能小看了这些步骤，它们就像是一个个小环节，串起来才能完成这个大实验。
就像那句话说的，“千里之行，始于足下”，咱得一步一个脚印地把这实验做好。
总之呢，这荧光原位杂交实验步骤可都不简单，每一步都得用心去对待。
只有这样，咱才能在实验中取得好的结果，才能真正领略到科学的魅力呀！你说是不是这个理儿？。
原位杂交ISH方法
原位杂交技术(ISH)步骤与注意事项材料（一）仪器：光学显微镜、烤箱、温箱、水浴箱、电吹风机（二）器皿：塑料反应盒、玻片架、洗涤杯、微量移液器、Eppendorf 管（三）试剂：1．DEPC （所有的试剂以此配制，注：DEPC致癌，应在通风下进行，并避免接触皮肤；含有Tris 中不能用DEPC）3．0.2mol/L HCl 1.72ml 浓HCl，加ddH2O至1000ml4．20%冰醋酸20ml 冰醋酸,加ddH2O至100ml5．蛋白酶（50μg/ml）6．溶液I: 含0.1mol/L Tris、0.1mol/L NaCl、2mmol/L MgCl2、0.05% Triton X-100取12.1g Tris; 5.85g NaCl; 0.41g MgCl2·6H2O，溶于800ml ddH2O中，再加入0.5ml Triton X-100，用HCl调pH至7.5，加ddH2O至1000ml。
8×105Pa高压蒸汽灭菌15min7．溶液II: 含0.1 mol/L Tris、0.1mol/L NaCl、50mol/L MgCl2。
方法：取12.1gTris；5.85g NaCl ; 10.15g MgCl2·6H2O，溶于800ml ddH2O中，用HCl调至9.5 ddH2O至1000ml。
8×105Pa高压蒸汽灭菌15min。
8．4%多聚甲醛：A液：称4g多聚甲醛，加40ml ddH2O，加温至60℃后，边摇边滴加1mol/L NaOH至全部溶解。
B：液：1.69g NaH2PO4·2H2O，加30ml ddH2O至溶。
C液：0.39gNaOH 溶于20ml ddH2O中。
先将B液与C液混合后再加入A液，以1mol/L NaOH或HCl调pH 值至7.2~7.4，加ddH2O至100ml。
4℃保存。
9．去离子甲酰胺：新的。
10．20×SSC：含有3mol/L NaCl, 0.3mol/L SSC。
原位杂交ISH方法
原位杂交技术(ISH)步骤与注意事项材料（一）仪器：光学显微镜、烤箱、温箱、水浴箱、电吹风机（二）器皿：塑料反应盒、玻片架、洗涤杯、微量移液器、Eppendorf 管（三）试剂：1．DEPC （所有的试剂以此配制，注：DEPC致癌，应在通风下进行，并避免接触皮肤；含有Tris 中不能用DEPC）3．0.2mol/L HCl 1.72ml 浓HCl，加ddH2O至1000ml4．20%冰醋酸20ml 冰醋酸,加ddH2O至100ml5．蛋白酶（50μg/ml）6．溶液I: 含0.1mol/L Tris、0.1mol/L NaCl、2mmol/L MgCl2、0.05% Triton X-100取12.1g Tris; 5.85g NaCl; 0.41g MgCl2·6H2O，溶于800ml ddH2O中，再加入0.5ml Triton X-100，用HCl调pH至7.5，加ddH2O至1000ml。
8×105Pa高压蒸汽灭菌15min7．溶液II: 含0.1 mol/L Tris、0.1mol/L NaCl、50mol/L MgCl2。
方法：取12.1gTris；5.85g NaCl ; 10.15g MgCl2·6H2O，溶于800ml ddH2O中，用HCl调至9.5 ddH2O至1000ml。
8×105Pa高压蒸汽灭菌15min。
8．4%多聚甲醛：A液：称4g多聚甲醛，加40ml ddH2O，加温至60℃后，边摇边滴加1mol/L NaOH至全部溶解。
B：液：1.69g NaH2PO4·2H2O，加30ml ddH2O至溶。
C液：0.39gNaOH 溶于20ml ddH2O中。
先将B液与C液混合后再加入A液，以1mol/L NaOH或HCl调pH 值至7.2~7.4，加ddH2O至100ml。
4℃保存。
9．去离子甲酰胺：新的。
10．20×SSC：含有3mol/L NaCl, 0.3mol/L SSC。
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中的位置的技术。
下面将详细介绍荧光原位杂交的具体步骤和相应的详细说明。
1.细胞准备首先，需要准备细胞样本。
可以选择使用原代细胞，细胞悬液或切片等。
2.固定将细胞固定在载玻片或载玻片上面。
固定通常使用的试剂是乙酸乙酯和甲醇的混合物，通常比例为1:33.水合将载玻片中的组织或细胞水合处理。
这一步可以通过将载玻片浸泡在去离子水或缓冲液中进行。
4.处理将载玻片进行预处理，以使DNA或RNA序列更易于杂交。
常用的预处理方法有：-煮沸：将载玻片浸泡在2×SSC（1×SSC：0.15MNaCl,0.015MNa3C6H5O7·2H2O,pH7.0）中，然后置于热盖板上加热至100°C，持续约10-20分钟。
-碱性水解：将载玻片浸泡在10%NaOH中，进行碱性水解，然后在盐溶液中冲洗。
5.杂交探针准备荧光探针或荧光标记的引物。
探针的选择取决于要检测的DNA或RNA序列。
探针的设计通常基于目标序列的序列信息，并且通过化学修饰和荧光标记以增加其杂交效率和检测灵敏度。
6.杂交将探针加到载玻片上的样本上，并与目标序列进行杂交。
杂交过程中，探针与目标序列进行互补配对，形成探针-目标复合物。
杂交的温度取决于探针的碱基组成和目标序列的GC含量。
7.洗涤将载玻片在洗涤缓冲液中进行洗涤，以去除未与目标序列杂交的探针。
8.检测使用荧光显微镜观察载玻片上的标记。
荧光标记的探针将通过荧光显微镜检测获得荧光信号。
根据荧光信号的数量和强度，可以确定目标序列的位置和数量。
9.成像和分析通过拍摄荧光显微镜图像来记录荧光信号。
使用图像处理软件进行图像分析，包括亮度分析和定量信号分析。
总结：荧光原位杂交是一种用于确定DNA或RNA序列在细胞或组织中位置的强大技术。
荧光原位杂交(FISH)实验步骤
仪器设备1、医用微波炉；2、水浴锅；3、OL YMPUS BX51荧光显微镜；4、OL YMPUS DP11数字显微照相机。
FISH试剂（1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃；（2）20×SSC（pH7.0）；（3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成；（4）25mg/ml蛋白酶K消化液。
（5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。
每次新鲜配制。
（6）杂交后洗涤液：20×SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。
每次新鲜配制。
调节pH前升至室温。
实验步骤1、脱蜡：1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；2）100％酒精两次，每次2min；3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。
2、蛋白酶处理:1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。
将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。
2）37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。
37℃孵育20min。
3）×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。
4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。
3、变性：1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；3）78℃孵育8min；4）即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；5）空气干燥。
4、杂交：1）准备探针；2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。
杂交后的水洗：5）镊子小心去除盖玻片；6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。
荧光原位杂交FISH实验步骤与方法(精选文档)
荧光原位杂交FISH实验步骤与方法（精选文档）（文档可以直接使用，也可根据实际需要修改使用，可编辑欢迎下载）FISH 实验步骤一、实验仪器：荧光显微镜:高速离心机：可达12000r/min高压灭菌锅：160C以上杀菌恒温箱：为杂交提供恒定温度恒温水浴锅照相机(与荧光显微镜配套)：荧光捕捉图片二、试剂的配制：1 、0.2mol/ L (pH7.4 磷酸缓冲溶液(PB试剂为NaH2P04 2H20 和Na2HP04 12H2O。
-----0. 2M 的NaH2P04溶液：31.2g NaH2P042H20,加蒸馏水1000mL溶解-----0. 2M 的Na2HP04溶液:71.632g Na2HP0412H2O 加蒸馏水至1000ml 溶解----0. 2M (pH7.4 磷酸缓冲溶液(PB : 19ml 的NaH2P04溶液和81ml 的Na2HP04溶液充分混合高压灭菌，常温保存。
2、0.03 mol/ L 磷酸盐缓冲溶液( (PBS)试剂为NaCl 和磷酸缓冲溶液PB——0.03MPBS溶液：22.8gNaCI , 150ml磷酸缓冲溶液(PB，加蒸馏水至1000ml，混匀——0.02 MPBS溶液：取100ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml——0.01 MPBS溶液：取50ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml高压灭菌，常温保存3、4%多聚甲醛溶液（1000ml）（在通风橱内进行操作）-----将略小于2/3体积的水（660ml）加热到50C,------40g多聚甲醛PFA，边搅拌边加入到水中，继续保持60C——1滴2mol/LNaOH溶液，立即澄清，但仍有小颗粒。
——1/3体积的PBS溶液，——用Hcl将pH调至7.2，定容，---- 用孔径为0.22卩谥勺滤膜过滤，—4 C保存最多保存两天，或者取少量保存在-20 C o（加热时温度不宜过高，为60C -65C，否则PFA容易降解，配置好后应尽快使用，否则固定效果较差）。
原位杂交技术（insituhybridization,ISH）
原位杂交技术（insituhybridization,ISH）我们常说，科学家也是艺术家，在明确真理探索科学的道路上，往往会创造出很多极具美感的艺术作品，比如下面的这些实验结果图，美吧~---Olson, B. D. and Downes, G. B.---in situ Hybridization of wild type Drosophila embryos所以今天小笔为大家介绍的就是能做出这种美美图的新技能，原位杂交实验~基本原理简单点说就是碱基互补配对原则。
官方来讲的话，就是我们将外源核酸（也就是常说的分子探针）与组织、细胞上待检测的DNA或RNA进行配对，形成核酸杂交分子，再经过一定手段将这个杂交分子的位置显示出来。
实验技术的更新是很快的，在明确了该技术的可行性后，科学家进一步改进并进行分类，主要有以下几类：荧光原位杂交技术：DNA分子原位杂交技术；在原技术手段上增加了荧光元素，技术手段较为先进，易掌握，运用广泛，一会儿小编会着重介绍哦~毕竟，能够在我们自己的实验中运用上，才是我们的最终目标嘛。
多彩色荧光原位杂交技术：显而易见，是荧光原位杂交的升级版，采用多个荧光来检测，目前的发展及运用也是较多的。
原位PCR：将原位杂交结合PCR技术发展起来的实验方法。
说实话，了解的比较少，我就不班门弄斧了，呵呵。
基因组原位杂交技术：该技术在我们的领域可能运用的毕竟少，主要是根据物种DNA同源性差异实现，在农作物等的杂交育种上运用较广，我就不详细介绍啦~明确了以上的分类及原理后，接下来小编主要讲讲在我们的领域中运用较广的荧光原位杂交方法。
结合示意图可以更好的理解哦~实验材料（重要的，基础材料不赘述）1. 4%多聚甲醛（1x PBS配置）：固定剂2. 蛋白激酶K：使得靶核酸暴露，增加探针和靶核酸结合。
3. 杂交缓冲溶液实验步骤取材：动物组织取材（小鼠采用心脏灌流法）后在4%的多聚甲醛中固定4小时左右， 1x PBS洗5次，每次30分钟，用25%蔗糖脱水过夜（均在4°进行）。
荧光原位杂交操作步骤
荧光原位杂交操作步骤荧光原位杂交听起来很复杂呢，其实操作步骤也有章可循啦。
一、样本准备。
要做这个实验，先得把样本处理好。
如果是细胞样本的话，就得把细胞乖乖地固定在载玻片上，就像把小娃娃放在小床上一样安稳。
这一步可不能马虎，固定不好后面就不好办啦。
要是组织样本呢，得把组织切成薄片，薄到像纸片一样精致才行。
然后同样把它固定好，这就为后面的杂交打下了好基础。
二、探针准备。
接下来就是探针啦。
探针就像是专门去找目标的小侦探。
得按照实验要求把探针配好，浓度要刚刚好哦，太浓了可能会乱了阵脚，太稀了又可能找不到目标。
把探针在合适的缓冲液里调配好，就像给小侦探准备好装备一样。
三、杂交反应。
然后就到了杂交这一步啦。
把准备好的探针滴到有样本的载玻片上，再盖上盖玻片。
这时候就像把小侦探放到了有目标的地方，让它们去寻找匹配的东西。
然后把载玻片放到一个合适温度的环境里，这个温度很关键呢，就像给小侦探们创造一个舒适的工作环境。
在这个环境里让探针和样本中的目标DNA或者RNA去结合，这个过程需要一点时间，就像小侦探寻找目标也不能太着急呀。
四、洗涤。
杂交完了之后呢，就要把那些没有结合的多余探针洗掉。
这就像是把那些凑热闹的家伙赶走，只留下真正找到目标的小侦探。
用合适的洗涤液轻轻地洗，可不能太粗暴，不然把已经结合好的也冲走了就糟糕啦。
五、检测。
最后就是检测啦。
这时候要用专门的荧光显微镜去看。
打开显微镜，就像打开一个神秘的宝藏盒子。
如果杂交成功了，就能看到漂亮的荧光信号啦，就像在黑暗中看到了闪闪发光的小星星。
那些荧光信号所在的地方就是探针找到目标的地方呢。
荧光原位杂交虽然有点复杂，但是按照这些步骤一步一步来，就像照顾小宠物一样细心，也能顺利完成这个有趣的实验啦。
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地高辛标记寡核苷酸，荧光标记二抗，ISH，冰冻切片操作过程：1、多甲固定：应尽量在半个小时内完成。
（固定时间以24-36小时为宜，避免RNA降解或固定过度。
）2、切片:为获得高杂交信号，冰冻切片应切成10um-20um。
（选用16um）（切好的片子可以保存在-70度中）但是要注意，保存在-70度中的切片，拿出来以后，立即在4%的多甲中重新固定，避免在重新固定前切片恢复室温。
（重新固定10-15min）3、用0.1MPB洗切片3*5min4、切片放入100%乙醇5min，空气中干燥。
杂交液：（20ml）藏于-20度20*SSC 4ml硫酸葡聚糖 4g去离子甲酰胺 10ml将他们溶解后，加入以下物质：Poly A（10mg/ml） 0.5 mlSsDNA（10mg/ml） 0.5 mltRNA （10mg/ml） 0.5 mlDTT (1M) 2ml50*Denhardts 0.2ml上述溶液可以配置后长期贮藏与-20度中，用前预热到37度。
杂交溶液：将地高辛加入杂交液中，探针的浓度需要摸索（一般是100ng-1000ng/ml，一般是以200ng/ml为起点来摸索条件），所加的杂交液的体积看切片的大小来决定，对于2cm*2cm的组织，一般是加50ul，但是对于嗅球，可能30-40ul足够。
加好杂交液以后，用盖玻片盖上切片（注意中间不要留有任何的气泡），为防止杂交液从盖玻片中流走，注意使切片保持水平，并且注意切片不能干燥，（干燥的话杂交会有一个很高的背景）在湿盒中37度杂交18小时，这个杂交时间可以延长到40小时来提高杂交的信号，但是前提是不能让切片干燥。
杂交后处理;制备0.5*SSC和1*SSC（从20*来稀释）并且保证这两种SSC在使用的时候的温度是55度。
注意配置0.5*SSC和1*SSC中含有10mM的DTT（将1.2g的DTT加入到800ml的SSC中）杂交后，用小镊子将盖玻片轻轻移走，然后倒掉杂交液，将切片放入洗液中，在振摇水浴中按照下面的要求来洗片：快洗： 1*SSC（10mMDTT）室温2*15min：1*SSC（10mMDTT）55度2*15min 0.5*SSC(10mMDTT) 55度1*10min 0.5*SSC（10mMDTT）室温将切片一直放在最后一步的溶液中一直到下一步操作。
检测：将切片转移到TBS缓冲液中（100mM tris-HCl，150mM NaCl，PH=7.5），将切片在TBS缓冲液中洗3*5min，封闭：（可选）将切片放在封闭液中放置30min（封闭液配方:TBS+0.1%triton X-100+1%正常绵羊血清（sigma）或者是1%的其它合适的封闭剂（Roche））,将切片拿出封闭液中，用地高辛抗体和切片在TBS+0.1%triton X-100+1%正常绵羊血清（sigma）或者是1%的其它合适的封闭剂（Roche）于室温下孵育至少4小时，然后在TBS中洗3*5min ，然后在去离子水洗涤几次以去除盐，最后用抗淬灭剂分片观察原位杂交要做的对照;1、切片中mRNA的质量（前提是新鲜的组织样品）和protocol的有效性。
①PolyT探针：如果PolyT探针杂交的信号很弱的话，说明切片的RNA已经降解比较严重。
2、杂交特异性对照：①检测探针只是和RNA结合，用RNA酶处理后如果没有杂交信号的，则说明杂交只是和RNA结合。
（注意，RNA酶的处理应该在固定以后用PBS洗两次*5min立即进行）②用正义和反义探针来杂交，如果用正义探针杂交得不到任何的信号，则可以说明杂交的信号是特异性的杂交预处理：1、在37℃恒温箱内干燥切片后，滴加 5-10μg/ml蛋白酶K，置37℃湿盒内孵育30min， 4℃75％酒精漂洗5min中止蛋白酶K活性。
一般应用蛋白酶K 1μg/ml(于0.1 mol/L Tris,50 mmol/L EDTA,pH8.0缓冲液中)，37℃孵育15~20 min，以达到充分的蛋白消化作用而不致影响组织的形态为目的。
蛋白酶K还具有消化包围着靶DNA的蛋白质的作用，从而提高杂交信号。
甘氨酸是蛋白酶K的抑制剂，常用0.1 mol/L的甘氨酸溶液(在PBS中)清洗以终止蛋白酶K的消化作用，应用胃蛋白酶(Pepsin)20~100 μg/ml(用0.1 N HCl配)37℃、30 min进行消化，所获实验结果优于蛋白酶K。
为保持组织结构，通常用4%多聚甲醛再固定。
2、0.25% 醋酸酐10min, 经70℃ 2×SSC漂洗、40℃ 2×SSC各漂洗15min，2×SSC3min，切片经75-100% 酒精梯度脱水。
1. 蛋白酶K能消化和暴露被遮蔽的靶核酸，以增加探针的可结合性。
蛋白酶K 浓度过低，不能使靶核酸有效暴露，浓度过高则组织消化过度，也会影响检测结果。
蛋白酶K须用蛋白酶K缓冲液配制(0.1mol/L Tris-HCl PH 8.0，50mmol/L EDTA，经高压灭菌后备用)，蛋白酶K应新鲜配制，低温冰箱内分装保存。
蛋白酶K消化组织切片是原位杂交实验流程中重要环节，蛋白酶K浓度应力求准确无误。
2. 根据组织类型、固定液的种类，固定时间和切片的厚薄的不同，蛋白酶K浓度也存在差异，选用蛋白酶K最佳消化浓度是原位杂交成功的必要条件，不可省略预杂交预杂交液;临用前加；△预杂交液不加配制：先以去离子甲酰胺与SSC于室温混合，加入硫酸葡聚糖于50℃促溶，依次加入其它成份。
硫酸葡聚糖在室温常需数小时才能完全溶解。
有时需旋涡振荡。
定容后充分混合。
根据使用方便可分装（最好用铝箔将瓶子包好）存于4℃，可达数月。
注意，杂交缓冲液在使用前切忌污染1、将DEPC处理的切片经ddH2O漂洗 2×5min2、按组织片大小，每张切片滴加40μl杂交液，置37℃温盒内2小时杂交1、抖去甩干杂交溶液，用DAKO魔笔沿组织周围划圈，滴加30μl 探针杂交液/每张切片(内含20ng地高辛标记的探针)，在某温度下（改温度为：TM- ）湿盒内孵育过夜杂交液内加入变性剪切的鲑鱼精子DNA在杂交前加入，与其它杂交液分开储存。
杂交液能在－20℃保存几个月杂交后处理1、将切片置37℃ 2×SSC中漂洗2×10min。
2. 在37℃ 2×SSC 漂洗2×15min、1×SSC 漂洗2×15min、0.25×SSC 漂洗2×15min，均需用振荡漂洗切片。
最适复性温度（Optimunm renaturationtemperature, TOR）：Tor =Tm –25℃苛刻复性温度：Ts = Tm – (10 或15℃)非苛刻复性温度：Tns =Tm – (30 或35℃)在2×SSC 反应液中，可以根据下列公式计算最适复性温度：TOr =0.51 (G+C%)+47℃背景染色的形成是诸多因素构成的。
杂交后(Posthybridization)的酶处理和杂交后的洗涤均有助于减低背景染色。
在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐(acetic anhydride)和三乙醇胺(t riethanolamine)中以减低静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色。
在杂交后漂洗中的RNA酶液洗涤能将组织切片中非碱基配对RNA除去。
一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。
必须注意的是漂洗的过程中，切勿使切片干燥。
干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合，从而增强了4(1)2×SSC(2)2×SSC 55℃ 10 min×2(3)05×SSC 50℃ 5 min×2(4)缓冲液Ⅱ(含05%封阻试剂，用缓冲液Ⅰ溶解)37℃ 30 min(5)缓冲液Ⅰ(100 mmol/L Tris HCl,150 mmol/L NaCl pH75)15 min,(6)酶标地高辛抗体(1∶5 000，应用缓冲液Ⅰ解释)37℃ 30 min(7)缓冲液Ⅰ 15 min×2(8)缓冲液Ⅲ(100 mmol/L Tris HCl,100 mmol/L NaCl,50 mmol/L MgCl2,pH95)室温，2 min。
(2)其目的是去除未参与杂交体形成的过剩探针,消除与组织或细胞之间的非特异性结合的探针,降低背景染色,增加信/将杂交玻片从湿盒(或杂交仪)中取出,用2×SSC将盖玻片洗脱,2×SSC 30℃洗2次,每次15 min;1×SSC 42℃洗2次,每次15 min;05×SSC 37℃洗2次,每次15 min,TBS缓冲液洗2次。
注意在漂洗(5)①阳性对照:②阴性对照:用已知不含待测靶核酸序列的组织作对照。
⑤DNA酶消化靶DNA〖HJ1〗(6)非特异性染色可能会来自探针、组织内源性酶、组织细胞、显色系统等;探针特异性不高以及组织细胞内某些成分与显示系统中的抗体成分非特异结合也可造成非特异性染色。
组织细胞内源性酶是原位杂交中非特异性着色的重要原因,目前最常用的酶是过氧化物酶和碱性磷酸酶,这两种酶都广泛存在于组织细胞中,因此用这些酶时应有消除内源性酶的相应步骤。
如过氧化物酶用3% H2O2处理5~10 min;10%冰醋酸处理组切片10 min,或在底物显色液中加入1 mmol/L左旋咪唑可防止内源性碱性磷酸酶的染色。
NBT/BCIP显示碱性磷酸酶时如果在光照下显色也会增强非特异性染色。
必须根据检测系统不同的标记酶作不同的内源酶处理。
2. 探针的长度原位杂交反应中探针浓度应超过靶序列的浓度，探针浓度必须给予该实验最大信噪比，因为背景着色度高低与探针浓度有关。
最佳探针浓度是最低探针浓度达到靶核酸的最大饱和结合度为目的。
探针浓度按其种类而略有不同，放射性标记cRNA探针的浓度为0.5ng/μl，而非放射性标记cRNA探针的浓度1.0ng/μl 。
杂交液的量要适当，每张切片以30-50μl为宜。
保持杂交液不流失的关键是，载玻片的清洁处理必须彻底，应用杂交罩等也很必要。
3.杂交的温度和时间设置和调整杂交温度是RNA原位杂交的重要环节。
杂交温度应低于解链或融解温度(melting temperature Tm)20-30℃。
多数RNA原位杂交Tm为95℃，由于这一温度对保存组织形态完整和组织切片的粘附将产生不利影响，为此在杂交液中常以增加甲酰胺浓度来降低Tm值，因为每增加1％甲酰胺浓度可降低0.72℃。
另外杂交体中GC的百分比，杂交体长度以及杂交液中Na+的浓度也与Tm呈正相关。
杂交反应的时间可随探针浓度的增加而缩短，杂交时间过短会造成杂交不完全，杂交时间过长会增加非特异性着色。