Cre小鼠
心外膜细胞标记基因介导的Cre重组酶在双转基因小鼠心脏的表达
曾
彬（ ９ ８ 。 ． １ ７ ￣） 男 汉族 ， 医学博士 。 主治医 师； 研究方 向为冠心病
基础与临床
参
考
文
献
４ Ｐａ ｋ ＣＹ ，Ｐ ｅ ｃ ｒ ｉ ｒ ｅ ＳＡ ，Ｖｏ ｅ ｌ ．ｅ １ ｎ Ｄｒ ｈ ｅ Ｍ ｔａ ．Ａ ｍｙ ｌ ｉ ｔ ｒ ｃ ｉ ｇ Ｓ ｄ —ｎ ｅ ａ ｔｎ
１ Ｍ ｕ ｒ ｒ ｙ ＣＥ， Ｓ ｏ ｐ ａ Ｍ Ｈ ，Ｒｅｎ ｅ Ｈ ， ｅ ａ ． Ｈ ａ ｍａ ｏ ｏ ｅ ｉ ｏ ｎ ａ ｉ ｅ ｋｅ ｔ １ ｅ ｔ ｐ ｉ ｔｃ ｓ ｅ ｃ ｌ ｏ ｎ ｔｔ ａ ｓ ｉｆ ｒ ｎ ｉ ｔ ｎ ｏ ｃ ｒ ｉｃ ｍｙ ｃ ｔ ｓｉ ｏ ｔ ｍ ｅ ｌ ｄ ｏ ｒ ｎ ｄ ｆｅ ｅ ｔａ ｅｉ ｔ ａ ｄ ａ ｏ ｙ ｅ ｎ ｍｙ — ｓ ｃ ｒ ｉ ｌｉ ｆ ｒ ｔ ．Ｎａ ｕ ｅ ２ ０ ４ ８ ６ ９ ） ６ ４～ ６ ８ ａ ｄａ ｎａ ｃｓ ｔ ｒ ， ０ ４， ２ （ ８３ ： ６ ６． ２ Ｍｏｉ ｎ ｓｍａ ｎ Ｃ， Ｋａ ｆ ｎ ＣＫ ，ＬｉＰ，ｅ １ Ｕｂ ｑ ｉｏ ｓ ｔ ａ ｇ ｎ ｕ ｍａ ｔａ． ｉ ｕ ｔ ｕ ｒ ｎｓ ｅ ｅ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｎ ｅ ｂ ｓ ｄ ｒ ｃ ｍｂ ｎ ｔｏ ｒｖ ｎ ｂ ｈｅ ｂ ｑ ｉｉ ｘ ｒ ｓ ｉ ｎ ａ ｄ Ｃｒ － ａ ｅ ｅ ｏ ｉ ａ ｉ ｎ ｄ ｉ ｅ ｙ ｔ ｕ ｉ ｕ ｔｎ ｐ ｏ ｔ ｒｉ ｅ ｒ ｆｓ ． Ｄｅ ｅ ｏ ｍｅ ｔ ２ １ １ ８ （ ）：１ ９ １ ７ ｒ ｍｏ ｅ ｎ ｚ ｂ ａ ｉｈ ｖ ｌ ｐ ｎ ， ０１ ， ３ １ ６ ～ ７．
动子 下 ） 小 鼠 杂 交 ， 生 的 Ｆ 的 产 １代 可 以被 表 达 的 Ｃ ｅ切掉 阻 碍 Ｌ ｃ ｒ ａ Ｚ翻译 的终止 序列 后起 动 Ｌ ｃ ａＺ表 达， 因此某 些组 织 或 细 胞 就 可 以被 Ｘ Ｇ ｌ 色 而 准 －ａ染 确 追 踪［ 。本 实 验 中所 用 Ｔｂ １－ ｒ ６ ］ ｘ ８Ｃ ｅ小 鼠受 心 外 膜细 胞标 记基 因 Ｔｂ １ ｘ ８调控 ， 当其 与 Ｒ Ａ ６小 鼠 ０Ｓ ２ 交配 后 ， ｘ ８标记 细胞 及 其 分 化 的细 胞 都得 到 了 Ｔｂ １
基于 PB 技术的 Cre 特异性表达小鼠品系的筛选研究
1.材料和方法：
1.1 小鼠品系及饲养 本实验所用老鼠为 FVB 和 C57BL/6J 两种自交系， 在复旦大学发育研究生物所江湾动物 房饲养。 Luciferase 报告小鼠： 在 FVB 小鼠的受精卵中显微注射注射带有 Luciferase 报告基因的 线性化质粒，得到的转基因小鼠。 Rosa26 报告小鼠：由 Philippe Soriano 首先建立，已被广泛应用于 Cre 小鼠表达谱的 鉴定。 双阳性报告小鼠：将上述两种报告小鼠杂交，得到带有 Luciferase 和 LacZ 报告基因 的双阳性纯合小鼠。 Lck-Cre 小鼠： Lck 启动子是一种淋巴细胞特异性表达的启动子， Lck-Cre 小鼠品系中，
100 l 100 l 10 ml e buffer 1M MgCl2 10% NP-40 400mM Potassium ferricyanide 400mM Potassium ferrocyanide 1% Sodium deoxycholate 25 mg/ml X-gal 1 M Tris (pH 7.3)
流程： A． 切片
2.5 ml 15 g 1.25 ml 100 l To 50 ml
1M PIPES 1M MgCl2 0.5M EGTA 8% PFA
1 ml 20 l 100 l 250 l To 10 ml
1M MgCl2 10% NP-40 0.5M PB 1% Sodium deoxycholate
引言
小鼠是研究哺乳动物的基因功能的必备模型，最常用的小鼠基因功能研究方法之一是利 用基因剔除技术产生突变型，根据突变表性分析基因的功能。该方法因其巨大的理论和 应用价值获得了 2007 年诺贝尔奖。由传统基因剔除发展而来的条件性基因剔除技术，是 在目的基因两侧引入了 LoxP 序列，通过 Cre 重组酶的表达诱导基因缺失。该方法可以使 用实现基因在不同发育时间和组织中的突变，可以用于研究致死基因在成年期的功能， 并可帮助我们了解特定基因在不同组织或器官中的作用，已被世界各国的研究人员广泛 使用。2007 年发起的国际小鼠基因剔除计划（ IMKC）也正在使用该方法在小鼠胚胎干 细胞（ES 细胞）中大规模诱变小鼠基因，为今后大规模培育条件基因突变小鼠做准备。 条件基因剔除小鼠的研究离不开 Cre 品系的培养和鉴定。传统方法的 Cre 小鼠大多通过 转基因培育：首先克隆出组织特异性表达的启动子序列，将 Cre 编码序列置于其后，通 过线性片段随机插入的方法建立转基因 Cre 小鼠，从而使 Cre 在人工克隆出的启动子的 作用下实现组织特异性的表达。这一方法受到许多限制。首先，已被鉴定和克隆的组织 特异性启动子数量不多；其次，转基因的位置效应会影响 Cre 的组织特异性表达，为克 服位置效应则往往需要筛选多个转基因品系，消耗大量的时间和费用。理论上也可以利 用基因打靶技术培育 Cre 小鼠，但这一策略同样受到对基因表达调控序列认识的限制， 并需要 ES 细胞培养等昂贵步骤。由于这些原因，Cre 小鼠品系培育已被公认为是大规模 小鼠基因研究的一个瓶颈。
Cre转基因小鼠制备技术方法
Cre转基因小鼠制备技术方法
Cre酶是在噬菌体内发现的一种酶，它能特异性的识别LoxP序列，并把同方向排列的两个LoxP序列之间的DNA切掉。
前面说了，我们把LoxP序列放到了打算敲除基因的两侧，那么我们如果把Cre酶放到细胞核里，目的基因就被Cre酶切掉，从而实现目的基因敲除了。
于是人们制作了能够表达Cre酶的转基因小鼠。
把Cre转基因小鼠和插入了LoxP序列的小鼠交配，就可以得到同时携带Cre和LoxP序列的小鼠了。
当Cre在细胞核内遇见LoxP序列，目的基因就被敲除了。
想控制在哪个细胞或者什么时间敲除目的基因，只要控制Cre酶就可以了。
制作Cre转基因小鼠时在Cre酶前面放上特异性的启动子，那么Cre酶就在该启动子表达的细胞或组织内表达，这样就只有这个组织或细胞内的目的基因被敲除。
时间上控制基因敲除的方法更为巧妙。
人们修饰了Cre酶基因，修饰后的Cre基因可以转录为mRNA，也可以在核糖体上翻译为蛋白质。
但是这种蛋白没有穿过细胞核膜的能力，也就无法进入细胞核发挥切割DNA序列的功能。
当人们外源性给予药物他莫昔芬（tamoxifen，缩写TM，是雌激素类似物）后，修饰的Cre酶就会获得穿过细胞核膜的能力。
于是Cre进入细胞核，与基因组相遇，切割掉LoxP之间的序列。
于是人们实现了什么时候给药，什么时间敲除基因（当然得给Cre 一点时间穿过细胞核膜）。
需要注意的是，Cre是一种酶，那么和所有酶一样，它的作用效果不会是百分之百的。
也许100个细胞里表达了Cre，大约70个细胞内的基因被敲除。
增强子驱动的Cre转基因小鼠的构建及Cre基因的表达鉴定
增强子驱动的Cre转基因小鼠的构建及Cre基因的表达鉴定王立良;王淼;张玉建;王浩;刘勇;邵一鸣【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2010(021)003【摘要】目的:探索将增强子应用于构建Cre转基因小鼠品系,为以条件基因敲除为基础的基因功能研究提供更多的工具.方法:通过PCR方法从小鼠的细菌人工染色体扩增UH增强子片段,构建含有Hsp68基础启动子、增强子UH、Cre重组酶基因和SV40 polyA的转基因载体pLW400,将3.3 kb的转基因片段通过显微注射导入小鼠受精卵;为了检测Cre在转基因小鼠中的表达,将转基因一代小鼠与纯合子ROSA26报告小鼠(R/R)交配,收集第14 d胚胎期(E14)的舌组织进行LacZ染色检测鉴定.结果:经鉴定,31只子代小鼠中有6只携带外源基因,整合率为19.4%;与R/+对照相比,E14期的双基因型Cre,R/+舌组织为阳性结果(蓝色).这表明Cre基因在转基因小鼠舌组织内得到表达,并在体内介导ROSA26基因座loxP位点间的重组,且有效删除了2个loxP之间的片段,从而启动了LacZ基因的表达.结论:构建了UH 增强子-Hsp68Cre的转基因小鼠,在舌肌中特异表达Cre基因,提示增强子可以被选择应用于Cre转基因小鼠的构建;为舌肌的发育和再生研究奠定了基础.【总页数】6页(P304-309)【作者】王立良;王淼;张玉建;王浩;刘勇;邵一鸣【作者单位】中国疾病预防控制中心,性病艾滋病预防与控制中心,北京,100176;University of Pennsylvania,Philadelphia,PA 19104-6160,USA;ApoCell Biosciences,Inc.,Houston,TX 77054,USA;Baylor College ofMedicine,Houston,TX 77030,USA;中国疾病预防控制中心,性病艾滋病预防与控制中心,北京,100176;中国疾病预防控制中心,性病艾滋病预防与控制中心,北京,100176【正文语种】中文【中图分类】Q789【相关文献】1.Tet-on和Cre/loxP双调控肝靶向表达Cre重组酶转基因小鼠的制备和功能评价[J], 赵亚;康健;招明高;汪爱勤;尹文;马玉;黄豫晓;兰海云;孙梦宁;吕欣;杨敬;雷迎峰;张建敏2.消化道细胞表达Cre重组酶转基因小鼠的功能鉴定 [J], 仇玮祎;王友亮;时令;孙岩松;滕艳;杨晓3.心脏和软骨细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的基因型鉴定 [J], 侯宁;王剑;李文龙;张继帅;杨晓4.平滑肌细胞特异表达Cre重组酶转基因小鼠Cre重组酶的表达分布 [J], 杨蕾蕾;吴壮;程萱;徐军;杨晓5.Cre重组酶表达载体的构建及其在转基因小鼠胰腺中的表达 [J], 周江;杨晓;程萱;程静;黄翠芬因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
Tamoxifen诱导Cre-ERT小鼠 使用指南1
Tamoxifen诱导Cre-ERT2小鼠使用指南一、品系介绍：Cre-ERT2小鼠是一类含有雌激素受体（estrogen receptor，ER）的配体结合区突变体（ERT）与Cre重组酶的融合蛋白表达的小鼠。
Cre-ERT2在无Tamoxifen诱导的情况下，在细胞质内处于无活性状态；当Tamoxifen诱导后，Tamoxifen的代谢产物4-OHT（雌激素类似物）与ERT结合，可使Cre-ERT2进核发挥Cre重组酶活性。
利用不同的启动子，可以在不同组织或细胞中特异性调控表达Cre。
如肝特异性表达Cre-ERT2：B6.129-Alb tm1(CreERT2)Srcmo或B6.Cg-Tg(Afp-CreERT)Srcmo。
二、常规Tamoxifen诱导方法：Tamoxifen用玉米油溶解。
因Tamoxifen的光敏特性，操作和保存时应保持避光。
♦Tamoxifen (Sigma‐Aldrich)：CAS # 10540-29-1 ♦玉米油(Sigma‐Aldrich)注意：不同品系的小鼠所用的Tamoxifen诱导方法可能不同，应根据实际使用效果、实验经验和设置加以调整和更改。
此处提供的是初步的常规诱导方法，仅供参考。
1、腹腔注射：（以下方法来自Jax lab）Tamoxifen (Sigma‐Aldrich)：CAS # 10540-29-1 Corn Oil (Sigma‐Aldrich)70% Ethanol (for disinfection)1ml Syringe (BD)3/8” beveled needle – 26 gauge (BD)Procedure:Dissolve tamoxifen in corn oil at a concentration of 20mg/ml by shaking overnight at 37°C. After tamoxifen is in solution, store at 4°C for the duration of injections.Determine injection dose by weight, using approximately 75mg/kg body weight. For adult mice, a standard dose of 100ul tamoxifen/corn oil solution is effective for inducingrecombination.Administer tamoxifen via intraperitoneal injection (using an ACUC approved injection procedure) once every 24 hours for a total of 5 consecutive days. As a safeguard, sanitize injection site with 70% ethanol prior to injection.Following the final injection, mice should be quarantined for 24 hours before returning to their normal animal room. Disposable pens and bedding should be discarded at this time. For Cre characterization work at the Jackson lab, there is a 7-day waiting period between the final injection and necropsy/histological analysis.Throughout the course of tamoxifen injections and any post-injection wait period, mice should be closely monitored for any adverse reactions to the treatment.References:Madisen, L., et. al., Nat Neurosci. 2010; 13(1): 133–140Sohal, D., et. al., Circ. Res. 2001; 89: 20‐252、灌胃给药：Tamoxifen was fed by garage to mice at doses of 0.13-0.16mg/g.Corn oil was used to dissolve tamoxifen at 37°C or room temperature (shaking) overnight and get the stock tamoxifen whose concentration is 20mg/ml.Reference:Feil R., et. al., Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93:10887–90.Feil R, ., et. al., Biochem Biophys Res Commun.1997; 237:752–7.MetzgerD., et. al.,. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92:6991–5.Zhang Y, ., et. al., Nucleic Acids Res.1996; 24:543–8.。
Tamoxifen诱导Cre-ERT小鼠 使用指南1
Tamoxifen诱导Cre-ERT2小鼠使用指南一、品系介绍：Cre-ERT2小鼠是一类含有雌激素受体（estrogen receptor，ER）的配体结合区突变体（ERT）与Cre重组酶的融合蛋白表达的小鼠。
Cre-ERT2在无Tamoxifen诱导的情况下，在细胞质内处于无活性状态；当Tamoxifen诱导后，Tamoxifen的代谢产物4-OHT（雌激素类似物）与ERT结合，可使Cre-ERT2进核发挥Cre重组酶活性。
利用不同的启动子，可以在不同组织或细胞中特异性调控表达Cre。
如肝特异性表达Cre-ERT2：B6.129-Alb tm1(CreERT2)Srcmo或B6.Cg-Tg(Afp-CreERT)Srcmo。
二、常规Tamoxifen诱导方法：Tamoxifen用玉米油溶解。
因Tamoxifen的光敏特性，操作和保存时应保持避光。
♦Tamoxifen (Sigma‐Aldrich)：CAS # 10540-29-1 ♦玉米油(Sigma‐Aldrich)注意：不同品系的小鼠所用的Tamoxifen诱导方法可能不同，应根据实际使用效果、实验经验和设置加以调整和更改。
此处提供的是初步的常规诱导方法，仅供参考。
1、腹腔注射：（以下方法来自Jax lab）Tamoxifen (Sigma‐Aldrich)：CAS # 10540-29-1 Corn Oil (Sigma‐Aldrich)70% Ethanol (for disinfection)1ml Syringe (BD)3/8” beveled needle – 26 gauge (BD)Procedure:Dissolve tamoxifen in corn oil at a concentration of 20mg/ml by shaking overnight at 37°C. After tamoxifen is in solution, store at 4°C for the duration of injections.Determine injection dose by weight, using approximately 75mg/kg body weight. For adult mice, a standard dose of 100ul tamoxifen/corn oil solution is effective for inducingrecombination.Administer tamoxifen via intraperitoneal injection (using an ACUC approved injection procedure) once every 24 hours for a total of 5 consecutive days. As a safeguard, sanitize injection site with 70% ethanol prior to injection.Following the final injection, mice should be quarantined for 24 hours before returning to their normal animal room. Disposable pens and bedding should be discarded at this time. For Cre characterization work at the Jackson lab, there is a 7-day waiting period between the final injection and necropsy/histological analysis.Throughout the course of tamoxifen injections and any post-injection wait period, mice should be closely monitored for any adverse reactions to the treatment.References:Madisen, L., et. al., Nat Neurosci. 2010; 13(1): 133–140Sohal, D., et. al., Circ. Res. 2001; 89: 20‐252、灌胃给药：Tamoxifen was fed by garage to mice at doses of 0.13-0.16mg/g.Corn oil was used to dissolve tamoxifen at 37°C or room temperature (shaking) overnight and get the stock tamoxifen whose concentration is 20mg/ml.Reference:Feil R., et. al., Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93:10887–90.Feil R, ., et. al., Biochem Biophys Res Commun.1997; 237:752–7.MetzgerD., et. al.,. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92:6991–5.Zhang Y, ., et. al., Nucleic Acids Res.1996; 24:543–8.。
条件性敲除小鼠
条件性敲除小鼠定义：条件性基因敲除小鼠（也叫Flox小鼠）是指在目的基因中含有成对的loxp位点的小鼠，与Cre工具小鼠交配后可在特定的组织或细胞中敲除目的基因。
CKO如何实现？重组酶系统（如：Cre-loxP）介导的位点特异性重组技术。
Cre是重组酶（38kDa），可识别34bp 长的DNA 序列loxP。
loxP 两侧各13bp 构成回文结构，中间8bp为非回文结构，因此loxp具有方向性。
（当DNA 分子上存在两个同向loxP 序列时，Cre可将两个loxP 序列之间的DNA 片段切出并环化，同时将loxP 两侧的序列进行连接；当DNA 分子上存在两个方向相反的loxP 序列时，Cre 可导致loxP 之间的序列发生反转。
）CKO敲除的是什么？条件性基因敲除的靶基因中必须带有可以被Cre 重组酶识别的loxP 序列，这种基因称为floxed gene。
带有floxed 靶基因的小鼠称为flox 小鼠。
在这种小鼠中，通常采用DNA 同源重组方法，在拟敲除基因片段的两侧分别放置一个同向的loxP 位点。
loxP 位点的存在应不影响该基因的功能，故选择对照为flox/flox小鼠CKO敲除何时何地发生？除了flox 小鼠以外，重组酶系统介导的条件性基因敲除还需要另一类重要的基因工程小鼠的参与——Cre 工具鼠。
Cre 工具鼠中，将Cre 重组酶的编码序列置于特定的基因启动子下，Cre 的表达特性决定了靶基因何时何地发生敲除。
Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的敲除就发生在哪种组织细胞；Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率；使用诱导型Cre 重组酶可以通过给予诱导剂，决定在特定的发育时期或疾病发生阶段，定时地进行基因敲除。
（范衡宇老师课件）实验时，将flox 小鼠和Cre 工具鼠进行交配，最后获得flox 纯合且Cre 杂合的小鼠。
在这类小鼠中，凡是表达Cre 的细胞，两个loxP 之间的序列被切除，从而实现组织特异性基因敲除。
顶端外胚层嵴表达Cre重组酶转基因小鼠的鉴定
用引物 Ｃｅ １ Ｃｅ ２ ｒ 和 ｒ一 可以扩增 出 ４ １ ｐ 一 ８ ｂ 的片段 ． 用以鉴定 Ｃｅ ｒ 基 因。Ｐ Ｒ反应 条件为 ：４Ｃ预变性 ４ｍｉ：４Ｃ Ｃ ９￣ ｎ ９ ｏ变性 ３ ，０Ｃ 火 ０ｓ６ ￣退 ３ ，２ ０ｓ７ ％延伸 ６ ，０个循环；２ ０ｓ３ ７ ℃延伸 １ ｉ： ℃保存。 ０ｒｎ ４ ａ ２ ． 鼠各组织基因组 Ｄ Ａ的制备 ．３小 ２ Ｎ （） 颈法 １ 用断 处死基因型 Ｃ １ ａ＿ ｒ小鼠． ｏ ０１ ｅ １ ｃ 取各组织样品于Ｅ ｐｎ ｏ ｐ ｅｄ ｒ ｆ 管中。 （） ２ 按照 ２ ． 中提 取 鼠尾 基 因组 的步 骤 提取 各 组织 基 因组 Ｄ Ａ ．１ ２ Ｎ ２２４Ｃ １０ １ Ｃｅ Ｒ Ｓ ２ ．． ｏ１ａ一 ｒ和 Ｏ Ａ ６双 转 基 因 胚胎 获得 （ ） 配 Ｃ ｌ０ １ Ｃｅ １交 ｏｌａ一 ｒ 转基 因小 鼠和 Ｒ ｓ２ ｏａ ６转基因小 鼠． 本室保 存的 ＲＯ Ａ２ Ｓ ６转基 因小 鼠已配至纯合 ． 子代 全部带 Ｌ ｃ ａＺ基因 ． 不需再 鉴定 Ｌｃ ａＺ基 因 （） ２ 在交配第二天检查母 鼠精栓 ， 以看到精栓 为准记为 Ｅ ． 。 ０５天 （） ３ 在胚胎期 ９ — ６ 天用 断颈法 杀死母 鼠 ． ． １． ５ ５ 取各胚胎 的羊膜组 织 于 Ｅ ｐ ｎｏ 管 中． 照 ２ ． ｐ ｅ ｄｆ 按 ． １和 ２ ． 法提取基 因组 Ｄ Ａ． ２ ．２方 ２ Ｎ 鉴定
Ｃ ｅ 因。 ｒ基
ｃｎ ａ ｍｌｅ ｋ Ｃ ｎ ｏ Ｏ１ ｏ ｒ 巾 Ｉ ｂ ｒ ２ 】 ｅ
瞒Ｈ ｏ Ａ ． ｂ ｐｌ 牡 】 ｙ １ ｋ
∞２ ０ 呦 ２
图 １ １Ｃ ｌＯｌ Ｃｅ — ｏｌ ａ— ｒ 转基 因载体构 建图 （） ４ 取胚 胎进行 Ｌ ｃ ａＺ染色 １ ， ３条件基因打靶技术 ２２ ａ Ｚ染 色 ．． Ｌ ｃ ５ 运用 Ｃｅ Ｌ ｘ ｒ— ｏＰ系统与基因打靶技术相结 合的条件基 因打靶 ． 靶 （） １工作液配制 ： 基因或重要功能域 片段被两个 Ｌ ｘ ｏＰ序列锚定 ． 经同源重组被引入 Ｅ ｓ Ｐ Ｓ Ｎ Ｈ￣Ｏ ・Ｈ２ ． ８ｇＮ ２ Ｐ ４１．３ｇ Ｎ Ｃ ． ｇ 于 １Ｌ Ｂ （ ａ Ｐ ４２ ０３５ ， ａＨ Ｏ ０９ ， ａ １ ５ 溶 ８ ８ 细胞 ．通过显微注射获得靶基 因被两个 Ｌ ｘ ｏＰ序列锚定 的条件打靶小 去 离 子水 中 ． ｐ 至 ７３ 调 Ｈ ．） 鼠．该小 鼠只有在与组织或 细胞特异性 表达 Ｃｅ的转基 因小 鼠交配 ｒ 固 定 液 （Ｂ （Ｈ ．）．５ｍ ０１ｍｏ ＬＥ Ｔ ． ｍＬ ｏ／ Ｐ Ｓ ｐ ７３ ９４ Ｌ，． ｌ Ｇ Ａ ０５ ／ ，２ｍ ｌ Ｌ 后 ．ｒ 介导 的重组发生在特定的组织活细胞 中． Ｃｅ 导致这些组织活细胞 Ｍ ｌ０Ｏ ，０ 戊 二 醛 ００ ） ２ ．１ｍＬ５ ％ ． ｍＥ ４ 中靶基 因被删除 ， 而其他组织 或细胞 中由于 Ｃｅ 表达 ． ｒ不 靶基 因不会 洗 液 （Ｂ （Ｈ ．）８ ． ｍ ２ｍｏ ＬＭｇ Ｉ ． ｍ ０５ Ｐ Ｓ ｐ ７３ ４ ８５ Ｌ， ｌ Ｃ２ ５ Ｌ， ．％脱 氧 胆 ／ ０ 被 改 变 酸 钠 １ Ｌ１％ ＮＰ ４ ｍＥ ０ｍ ， ０ 一 Ｏ１ ） ２实验 步 骤 ． 染色液 （ ｘ ｇｌ ｕｆｒ ， — ａ ０２ｍ 洗液 （Ｈ ．）． ｍＬ — ａ ｂ ｆ ｍＬ Ｘ ｇｌ ． Ｌ， ｅ２ ｐ ７３ ７６ ， ２１ 验 方法 ．实 １ｍｏ ＬＴ ｉ・Ｉｐ ７３０２ｍ ｌ ｒ Ｃ（ Ｈ ．） ． Ｌ） ／ ｓ 核固红染液（ 固红 ０１ ， 核 ． 硫酸铝 １ｇ蒸馏水 １０ ］将核固红溶 ｇ ５， ０ｍ ， 将 Ｃ ｌＯ ｌ Ｃｅ小 鼠断颈处死 ．剖开腹 部 。获取其 胚胎 ．即为 ｏｌａ— ｒ Ｃ ｉ０ ｌＣ ｅ ｏａ６双转基因胚胎 ｏｌａ～ ｒ； ｓ２ Ｒ 取胚胎羊膜组织提取 Ｄ ＮＡ基因组 人 １％硫酸铝水溶液中 ． ５ 加热溶解 ． 冷却过滤后备用。 ） Ｄ Ａ。 Ｎ 再将胚胎进行 Ｌ ｃ ａＺ染色 ． 经脱水处理后 ． 进行石蜡包埋 ， 再将腊 （） ２取胚胎期 ７ — ３ 天的整个胚胎 ， ５ １． ５ 置于固定液 中４ 固定 ２ ６ 。 ＿ ｈ （） ３染色前， 洗液洗 ３４次 ， ＿ 每次 ２一 ０ｒ ｎ Ｏ ３ ｉ。再将组织置于 Ｘ ｇ 染 ａ －ａ ｌ 块切片 ， 以获取 目的组织切片。 将切 片进行核红复染 ． 再经乙醇复水后 液内于 ３ ℃染色过夜 ． ７ 待见到相应组织部位出现蓝染． 即可终止染色。 用 中性树胶封片， 以保存观察 。 用 ２２６石蜡 包 埋 、 片 ．． 切 ２２实 验 步骤 ． （） １将组织置于 固定液中 ４ｃ ｏ过夜。 ２２１ 鼠基 因组 Ｄ Ａ 的提 取 ．．小 Ｎ （） ２ 将组织进行系列组织脱水 。 （） １剪取鼠尾 ， 置于 １ ． ｍＬ离心管中 ， ５ 每管加入 ４ ０ ０ 鼠尾裂解 （） ３ 包埋 ： 过水 的组织转 至处 理好的石蜡（ 将脱 石蜡融化 ， ６ ￣ 于 ０ Ｃ 液 （ ．％Ｓ Ｓ ０１ ｌ ａ １００ ｏ ＬＥ Ｔ ００ ｏ ＬＴｉ・ １１０ ０５ Ｄ 、． ｍ０ ＬＮ Ｃ 、．５ｍ Ｖ Ｄ Ａ、．１ｍ ｌ ｒ Ｃ 、０ ， ／ ｓ ｐ／ Ｌ蛋 白酶 Ｋ）５ ％水浴过夜 。 ．ｍ ｇ ，５ 放置过夜 ） 透蜡 ２ ， 中． ｈ 中间换蜡两次 。将组织转到预热的包埋 框中 ， 用温热的镊子调整组织块的位 置， 放上底板 ， 并在板上 （） ２ 每个离心管加入 ２ ０ ０ Ｌ饱和 Ｎ Ｃ 溶液 （ ｏ／）将 离心管 迅速倾入熔蜡 ． ａ１ ６ｔ ｌ ， ｏ Ｌ 倒上一些熔蜡 ． 小心除去底板 内的气泡 ， 熔蜡凝 固。 使 上 下 剧 烈摇 荡 约 ２ ０次 ０ （） ４ 切片 ： 修整蜡块至所需大小 ， 在轮转切片机 上切 片， 调整刀身 （） ３将离心管置于冰上 ，０ ｎ 室温 １０ ０ｒｍ离心 １ ｍ ｎ １ｍｉ． ２０ ｐ ０ ｉ ０， 将形成 的蜡带移至 ４ ￣预热的水 上， 样品漂 ２Ｃ 使 （ ） 上清 ５０ ４将 ０ 转移至于净的离心管 中， 每管加入 ８０Ｉ ０ Ｌ无 角度为 １。连续切片 ． ｘ 浮在水面上 ．待样品展开 ，再将蜡带切成所需长度 ，移至载玻片上 ， 水乙醇 ， 混匀 ， 可见絮状沉淀 。 ３ ￣干燥 过 夜 ７Ｃ （） ５ 室温 １０ ０ｒｍ离心 １ｍｉ． ２０ ｐ ０ ｎ 弃上清。 ２２７核固红复染 ． ． （） ６ 每个离心管加 １ｍ ７ ％乙醇 ， Ｌ５ 振荡 吹打。 室温 １００ｒｍ离心 ２０ ｐ ５ ｉ， ｍｎ 弃上清。 （） １将石蜡切片放在 ５ ℃烤片 ２ 。 ８ ｈ （） ２ 将石蜡组织切 片进行二 甲苯脱蜡 （５ｍｎ ２ 系列乙醇复水。 １ ｉ ） ｘ （） ７ 将步骤 ６ 重复一次。 （） ３ 置于核固红染液 内染色 ３ ， ０ｓ放入水中稍洗 。 （） ８ 将离 心管管 口向下 ， 室温干燥约 ２ ｍ ｎ 使 乙醇挥 发即可 ， ０ ｉ， 不 （） ４ 染色后 的切片经 ９ ％、０％、Ｏ ％浓度
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Cre小鼠
随着基因工程技术的发展以及基因编辑技术的成熟，越来越多的科研人员使用基因编辑的小鼠模型来研究基因表达、遗传疾病以及临床实验前的药效测试等。
然而，在一些研究中，科研人员只需要对某一时期针对某一特定基因进行研究，它需要满足可以在特定组织或特定生命周期中目的基因表达的条件，而这种条件性小鼠模型叫做Cre 工具鼠。
Cre 鼠的构建最有效的方法之一是通过 Cre-Loxp 重组酶系统实现的，特定的Cre 工具鼠可以在某组织特异性基因启动子调控下表达组织特异性 Cre 重组酶。
Cre-loxp 重组系统
Cre-loxp 重组酶系统，由 Cre 重组酶和 loxp 位点两部分组成。
具体实现方式是通过对一段特定的DNA 序列进行定位并且利用Cre 重组酶对其剪接，运用该系统可针对特定细胞或组织进行「基因改造」。
Cre-loxp 重组酶系统的作用方式
Cre 重组酶识别 loxP 位点两端的反向重复序列并结合形成二聚体，然后此二聚体与另一个loxP 位点上的二聚体结合形成一个四聚体。
LoxP 位点是有方向性的，四聚体连接的两个位点在方向上是平行的。
然后两个loxP 位点间的DNA 序列被Cre 重组酶切断。
接着，DNA 连接酶快速高效地将这些链连接起来。
重组的结果取决于 loxP 位点的位置和方向。
Cre 工具鼠的构建
目前有四种常见Cre 鼠的构建策略，每种方法各有其优点和不足，选择哪种方法根据科研目的和实际情况而定，下面为大家简单介绍下这几种模型。
质粒表达载体Cre 鼠模型：通过受精卵原核注射的方法，获得Cre 随机插入基因组的转基因小鼠。
定点敲入 Cre 鼠模型：利用 CRISPR/Cas 技术将 Cre 基因定点敲入相关内源基因位点，依靠内源性基因调控序列确定 Cre 表达特征。
BAC 转基因 Cre 鼠模型：将 Cre 基因先敲入至 BAC 克隆的特定基因调控元件序列后，构建BAC 克隆载体，并将此BAC 载体进行受精卵原核注射法，构建 BAC 转基因 Cre 小鼠模型。
虽然该转基因技术也是随机整合插入，但其具有降低了质粒 DNA 随机插入引起的位置效应影响，避免了Cre 基因5』端敲入可能引起的杂合缺失有表型等方面的优势。
安全位点敲入 Cre 小鼠模型：目前的 Cre 小鼠模型构建策略。
为了避免基因随机插入可能导致诸多不利因素影响（比如表达位置影响作用及插入突变等），通过将 Cre 定点敲入到所谓的「安全」位点，比如 Rosa26、Hprt 和 Hipp 11 等位点。
其中以 Rosa26 位点最为常用。
Cre 工具鼠的种类及应用
Cre 工具鼠主要分为 3 类：全身性 Cre、组织特异性 Cre 和配体或药物诱导 Cre。
全身性Cre：通过诱导剂来调节驱动Cre 重组酶的启动子活性。
例如 CAG/CMV-cre 等
组织特异性Cre：由组织特异性启动子表达，一般需要两种转基因小鼠交配使用。
例如 Alb-Cre、Lyz2-Cre 等。
配体或药物诱导Cre：通过将Cre 重组酶与激素受体的配体结合
域（ligand-bindingdomain，LBD）相融合，形成定位于胞浆的融合蛋白，只有在激素诱导后，融合的Cre 蛋白才会通过构象变化从锚定蛋白 HSP90 上解离下来，进入细胞核，识别 loxP 位点并发生重组。
例如：雌激素诱导型。