食品中致病性大肠埃希氏菌及检验-精选文档
大肠埃希菌的鉴定流程及相应试验结果
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食品大肠埃希氏菌标准
食品大肠埃希氏菌标准一、什么是大肠埃希氏菌？大肠埃希氏菌（Escherichia coli，简称E. coli）是一种常见的革兰氏阴性菌，广泛存在于环境中，同时也是人类和动物肠道中的重要共生菌。
大肠埃希氏菌的某些菌株可引起人类食物中毒和感染，造成严重的健康问题。
二、食品大肠埃希氏菌标准的重要性食品安全是人民群众关心的重要问题之一，而大肠埃希氏菌是食品中最为常见的致病菌之一。
制定和执行食品大肠埃希氏菌标准对于保护消费者的生命健康具有重要意义。
1. 食品大肠埃希氏菌标准的目的食品大肠埃希氏菌标准的目的是规范生产和加工环节中对大肠埃希氏菌的控制要求，最终保障食品的安全性和卫生质量。
2. 食品大肠埃希氏菌标准的依据制定食品大肠埃希氏菌标准的依据主要包括国内外相关法律法规和科学研究成果，例如食品安全法、食品卫生法、食品安全国家标准等。
三、食品大肠埃希氏菌标准的内容要求1. 食品大肠埃希氏菌指标食品大肠埃希氏菌标准中会规定食品中大肠埃希氏菌的允许限量，不同食品的指标可能存在差异。
例如，在生肉类食品中，大肠埃希氏菌数目必须小于某个特定值才能合格。
2. 检测方法和要求食品大肠埃希氏菌标准中还包括了针对大肠埃希氏菌的检测方法和要求。
这些方法需要科学准确，并且易于操作。
常用的检测方法包括传统培养法、PCR法等。
3. 食品贮藏和运输要求食品大肠埃希氏菌标准还规定了食品的贮藏和运输要求，以确保在食品生产、储存和运输过程中不发生大肠埃希氏菌的污染和繁殖。
4. 生产企业的责任与义务食品大肠埃希氏菌标准还明确了食品生产企业的责任与义务。
企业必须建立健全的质量管理体系，保证生产过程符合相关标准要求，并对产品进行严格的自检、抽检和监督检验。
四、食品大肠埃希氏菌标准的执行与监督1. 监督机构和责任部门食品大肠埃希氏菌标准的执行和监督是食品安全监管部门的职责，他们承担着对食品生产企业的日常监督、抽样检测和追溯调查等工作。
2. 处罚措施对于违反食品大肠埃希氏菌标准的生产企业，监督机构将会采取相应的处罚措施，例如责令召回不合格产品、暂停生产许可证、罚款等。
牛肉样品中产志贺毒素大肠埃希氏菌和肠致病性大肠埃希氏菌的分离鉴定
牛肉样品中产志贺毒素大肠埃希氏菌和肠致病性大肠埃希氏菌的分离鉴定朱应飞，聂 翔，熊丽霞，吴学平，占忠旭，匡佩琳（江西省检验检测认证总院食品检验检测研究院，江西南昌 330000）摘 要：于2018年9月—2019年3月，每个月从超市和农贸市场中抽取20个样本，共抽取140个牛肉及制品样本，在qPCR初筛时stx阳性率为45.8%，eae的阳性率为52.2%。
每月的stx初筛阳性率分别为65%、60%、80%、5%、25%、45%和40%；eae初筛阳性率分别为70%、70%、65%、0%、40%、65%和55%。
检出携带stx基因的产类志贺毒素大肠埃希氏菌样本4份，样本阳性菌株检出率为2.9%；检出携带eae基因的肠致病性大肠埃希氏菌样本12份，样本阳性菌株检出率为8.6%。
关键词：产志贺毒素大肠埃希氏菌；肠致病性大肠埃希氏菌；分离；鉴定Isolation and Identification of Shiga Toxin Producing Escherichia coli and Enteropathogenic Escherichia coli in BeefSamplesZHU Yingfei, NIE Xiang, XIONG Lixia, WU Xueping, ZHAN Zhongxu, KUANG Peilin (Jiangxi General Institute of Testing and Certification Food Testing Institute, Nanchang 330000, China)Abstract: From September 2018 to March 2019, 20 samples were taken from supermarkets and farmers’ markets every month, with a total of 140 beef and product samples taken. the positive rate of stx was 45.8%, and the positive rate of eae was 52.2%. The monthly positive rates of stx initial screening positive rates of 65%, 60%, 80%, 5%, 25%, 45%, and 40%, respectively; The positive rates of eae initial screening were 70%, 70%, 65%, 0%, 40%, 65%, and 55%, respectively. Four Shiga toxin producing Escherichia coli samples carrying the stx gene were detected, with a positive strain detection rate of 2.9%; From September 2018 to March 2019, 12 samples of enteropathogenic Escherichia coli carrying the eae gene were detected, with a positive strain detection rate of 8.6%.Keywords: Shiga toxin producing Escherichia coli; enterogenic Escherichi coli; separation; appraisal产志贺菌毒素的大肠杆菌（Shiga Toxin Producing Escherichia coli，STEC）和肠致病性埃希氏菌（Enterogenic Escherichi coli，EPEC）是世界上最重要的食源性病原体之一。
大肠埃希氏菌O157H7NM检验 标准文本(食品安全国家标准)
食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验1 范围本标准规定了食品中大肠埃希氏菌O157:H7/NM（Escherichia coli O157:H7/NM）的检验方法。
本标准适用于食品中大肠埃希氏菌O157:H7/NM的检验。
2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：a）恒温培养箱：36 ℃±1 ℃；b）冰箱：2 ℃～5 ℃；c）恒温水浴箱：46℃± 1 ℃；d）天平：感量0.1 g、0.01g；e）均质器；f）显微镜：10×～100×；g）无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或移液器及吸头；h）无菌均质杯或无菌均质袋：容量500 mL；i）无菌培养皿：直径90 mm；j）pH计或精密pH试纸；k）长波紫外光灯：366nm，功率≤6W；l）微量离心管：1.5 mL/2.0 mL；m）磁板、磁板架、样品混合器；n）全自动微生物生化鉴定系统。
3 培养基和试剂3.1 改良EC肉汤（mEC+n）：见附录A中A.1。
3.2 改良山梨醇麦康凯琼脂（CT-SMAC）：见附录A中A.2。
3.3三糖铁琼脂（TSI）：见附录A中A.3。
3.4半固体琼脂：见附录A中A.4。
3.5月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-MUG（MUG-LST）：见附录A中A.5。
3.6氧化酶试剂：见附录A中A.6。
3.7革兰氏染色液：见附录A中A.7。
3.8 PBS-Tween20洗液：见附录A中A.8。
3.9亚碲酸钾（AR级）。
3.10头孢克肟（Cefixime）。
3.11 4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）。
3.12大肠埃希氏菌O157显色培养基。
3.13大肠埃希氏菌O157和H7诊断血清或O157乳胶凝集试剂。
3.14生化鉴定试剂盒。
3.15抗-E.coli O157免疫磁珠。
第一法常规培养法4 检验程序大肠埃希氏菌O157:H7/NM常规培养法检验程序见图1。
埃希氏大肠菌及检验
埃希氏大肠菌及检验一、定义：大肠埃希氏菌更习惯称为大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属，并且大肠杆菌株ATCC 11775是该属的模式菌种。
大肠杆菌的不同菌株间DNA相关性为80%，而与同科的志贺氏菌属（除鲍氏志贺氏菌外）的DNA相关性可达80-87%。
与人类疾病有关的大肠杆菌，统称为致泻性大肠杆菌（此名称不易与致病性大肠杆菌相混淆），一般包括五种：即肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）和粘附性大肠杆菌（EAEC）。
文献报道还有几种，象：凝集性大肠杆菌、即产VT毒素又具有侵袭性的大肠杆菌等，但目前尚未达成统一共识。
二、生物学特性：基本形态特征：此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般大小约0.5μ-0.8μm*1.0μm-3.0μm,因生长条件不同，个别菌体可呈近似球状或长丝状。
此菌多单独存在或成双，但不呈长链状排列。
约有50%左右的菌株具有周生鞭毛而能运动，但多数菌体只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱；多数菌株生长有比鞭毛细、短、直且数量多的菌毛，有的菌株具有荚膜或微荚膜；不形成芽胞，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。
培养特征：由于此菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。
最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围为15-46℃。
在普通营养琼脂上生长表现3种菌落形态：（1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色，在生理盐水中容易分散。
（2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易在生理盐水中自凝。
（3）粘液型：常为含有荚膜的菌株。
此菌兼性厌氧，在有氧条件下生长良好，最适生长pH为6.8-8.0，所用培养基pH为7.0-7.5,若pH值低于6.0或高于8.0则生长缓慢。
生化反应与血清学反应大肠杆菌属于卫生学意义的大肠菌群和粪大肠菌群的范畴，因此，必须符合大肠菌群和粪大肠菌群的有关定义，在检测大肠菌群、粪大肠菌群的基础上，可以应用I（吲哚）、M（甲基红）、Vi（3羟基-2-丁酮）、C（柠檬酸）即IMViC 生化试验对大肠杆菌作进一步鉴定，其IMViC结果为++--或-+--。
食品中致泄埃希氏菌检验
食品微生物检验技术
食品微生物检验技术
一、致泄大肠埃希氏菌概况
概述 致病性（致泄）大肠埃希氏菌 是指能使人、动物(esp.婴儿和幼龄动物)感染及人
食物中毒的一群大肠杆菌。现在已经确认能够对人类产生致病性的菌株有五种，分 别是：肠道致病性大肠杆菌（EPEC）、产肠毒素大肠杆菌（ETEC）、侵袭型大肠杆 菌（EIEC）、产志贺样毒素大肠杆菌（VTEC）（包括肠道出血性大肠杆菌（EHEC ））、肠集聚性大肠杆菌（EaggEC）。
三、注意事项
根据以上生化试验和血清学试验结果作出报告。 （1）大肠杆菌在某些食品中的抵抗力（如含亚硝酸盐的咸食品）或对某些处理过程
的抵抗力弱于致病菌。当它与致病菌同时存在时，只有在食品受污染后要马上检验才 能保证大肠杆菌的计数结果与粪便的污染成正比例。 （2）典型的大肠杆菌IMViC试验结果为“+ + - -”或“- + - -”。该结果表示食品 已经被粪便污染，有传播肠道传染病的危险。
致病性
一、致泄大肠埃希氏菌概况
污染途径：污染水源和土壤，进而污染食物；肉类食品乳制品；水产品等 感染途径：①肠道内感染：腹泻、食物中毒、肠热症；②肠道外感染：鼠疫（烈性
传染病）、泌尿道感染、 肺炎、脑膜炎、伤口化脓、败血症
二、致泄大肠埃希氏菌检测
检样
测大肠菌群 MPN
污染严重的 检样匀液
25g+营养肉汤225mL 36℃±1℃ 6h
或
污染严重检样匀液
36±1℃， 18~24h
鲜桃红色或微红色, 菌落中心呈深桃红 色,圆形,扁平,边缘 整齐,表面光滑,湿润
验证试验 TSI
二、致泄大肠埃希氏菌检测或源自氧化酶试验革兰氏染色
标记氧化酶阴性、革兰氏染 色阴性杆菌可疑典型菌落
致泻大肠埃希氏菌检验标准
致泻大肠埃希氏菌检验标准
1. 范围
本标准规定了致泻大肠埃希氏菌检验的术语和定义、通用要求、样品采集与处理、实验室基本要求、检验程序、结果报告、记录和档案管理等要求。
本标准适用于食品、水源等样品的致泻大肠埃希氏菌检验。
2. 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 4789.4 食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数
GB 4789.16 食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验
3. 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 致泻大肠埃希氏菌Escherichia coli causing diarrhea
能够引起人类腹泻症状的大肠埃希氏菌。
4. 通用要求
4.1 实验室应建立完善的生物安全制度，保证工作人员的安全和防护。
4.2 实验室应配备相应的仪器设备和试剂，保证检验的准确性和可靠性。
4.3 实验室应按照相关规定做好废弃物的处理和消毒工作，防止污染环境和危害人员健康。
5. 样品采集与处理
5.1 样品采集
5.1.1 食品样品：采集具有代表性的食品样品，包括原材料、半成品、成品等。
5.1.2 水源样品：采集具有代表性的水源样品，包括自来水、饮用水、地表水等。
5.2 样品处理
5.2.1 食品样品：将样品无菌包装或以其他方式保证无菌操作，避免交叉污染。
《微生物与实验技术》食品中大肠埃希菌的检验实验
《微生物与实验技术》食品中大肠埃希菌的检验实验一、实验目的1.熟悉大肠埃希菌的检验原理2.熟悉大肠埃希菌检验的基本操作二、实验原理1.大肠杆菌，又叫大肠埃希氏菌是条件致病菌，在一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道感染或尿道等多种局部组织器官感染。
因此，检查食品中是否存在治病大肠埃希氏菌具有实际意义。
2. 在TSI琼脂中,典型菌株为斜面与底层均呈黄色，产气或不产气，不产生硫化氢(H2S)。
置MUG-LST肉汤管于长波紫外灯下观察,MUG阳性的大肠埃希氏菌株应有荧光产生,MUG阴性的应无荧光产生，大肠埃希氏菌O157:H7/NM为MUG试验阴性,无荧光。
三、试剂及器材1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤：2 EC肉汤（E.coli broth）：3 蛋白胨水：4磷酸盐缓冲液：5伊红美蓝（EMB）琼脂：6 营养琼脂斜面：7结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）：8革兰氏染色液：9无菌1mol/LNaOH：10无菌1mol/LHCl：四、操作方法样品的稀释1. 固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，8000r/min~10000r/min均质1min~2min，制成1:10的样品匀液或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min~2min制成1:10的样品匀液。
2.液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1.10的样品匀液。
3. 样品匀液的pH值应在6.5~7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl 调节。
4 .用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL 磷酸盐缓冲液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面）振摇试管或换用1支1mL无菌吸管或吸头反复吹打，使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。
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5）、不能在氰化钾培养基上生长，靛基质 试验阳性，V-P试验阴性，不利用枸橼酸 盐。后四项生化特性是典型的大肠埃希氏 菌，与此不一致的即为非典型大肠埃希氏 菌菌。 IMViC试验：如IMViC试验为+、+、-、-， 且乳糖发酵，表明被检物已有粪便污染， 有发生肠道传染病的危险，这是卫生细菌 中常用的检测指标。（I：吲哚形成试验， M：甲基红试验，Vi：V-P试验，C：枸橼 酸盐利用试验）
利用枸橼酸盐生长 + 不能利用 -
一、埃希氏菌属生物学特性
抵抗力 该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强， 55℃经60分钟或60℃加热15分钟仍有部分 细菌存活。 在自然界的水中可存活数周至数月，在温 度较低的粪便中存活更久。对磺胺类、链 霉素、氯霉素等敏感，青霉素对它的作用 弱, 易产生耐药菌株.
食品中肠道致病杆菌的检验
第三节 致病性 大肠埃希氏菌及其检验
大肠埃希氏菌,俗称大肠杆菌,是人类 和动物肠道中正常菌群的主要成员,每 克粪便中约含109个.大肠埃希氏菌随 粪便排出后,广泛分布于自然界.水、 牛乳及其他食品一旦检出大肠埃希氏 菌，即意味着这些物品直接或间接被 粪便污染。
正常情况下，大肠埃希氏菌不致病，而且还能合 成维生素B和维生素K,生产大肠菌素，对机体有利。 但当机体抵抗力下降或大肠埃希氏菌侵入肠外组 织或器官时，可作为条件致病菌而引起肠道外感 染。有些血清型可引起肠道感染。致病性大肠埃 希氏菌属主要分为五大类，首先根据发病机理分 为三大类， 1、产毒素型大肠埃希氏菌(ETEC)， 2、侵袭型大肠埃希氏菌(EIEC) 3、肠道致病性大肠埃希氏菌(EPEC) 近来又提出另外两类 4、出血性大肠埃希氏菌(EHEC) 5、肠粘附性大肠埃希氏菌(EAEC)
在麦康基培养基上培养的大肠埃希杆菌 大肠埃 希杆菌产生粉红色乳糖发酵菌落。麦康基培养基 是肠道细菌的选择培养基，含胆盐、乳糖和 pH指 示剂中性红。乳糖发酵菌落产生酸，将指示剂变 红。（麦康基琼脂，18小时，37℃）
革兰氏阴性杆菌
革兰氏阳性杆菌
大肠杆菌扫描电镜照片
大肠杆菌透射电镜照片
致病性大肠埃希氏菌中，一般认为能 产生耐热(ST)和不耐热(LT)肠毒素的 两种菌株均可引起人的食物中毒。引 起大肠埃希氏菌中毒的主要是一些动 物性食品，如乳与乳制品、肉类、水 产品等，牛和猪是传播这种病菌、引 起中毒的主要原因。
2019年7月在日本就发生了大肠杆菌 0157型引起的食物中毒，造成9017多 人中毒，10人死亡，其原因与生食萝 卜苗有关，其中92例并发出血性肠炎 及出血性尿毒症。2019年，再江苏、 安徽等地爆发的肠出血性大肠杆菌 0157:H7食物中毒，造成177人死亡， 中毒人数超过2万人。 如仔猪黄、白痢、猪水肿病、牛腹泻 和败血症等均可由大肠杆菌引起。
大肠杆菌革兰氏染色照片
大肠杆菌平板菌落照片
一、埃希氏菌属生物学特性
生化特性 1）可发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇 产酸产气，有些不典型的菌株不发酵或迟 缓发酵乳糖； 2）不同菌株对蔗糖，卫矛醇、水杨苷发酵 结果不一致; 3）本菌可使赖氨酸脱鞍、不能使苯丙氨酸 脱羧。 4）不产生H2S，不液化明胶，不分解尿素;
一、埃希氏菌属生物学特性
形态与染色 本属细菌为革兰氏阴性 两端钝圆、中等大小的 无芽孢杆菌，绝大多数 周生鞭毛，能运动，周 身还有菌毛，不产生荚 膜，某些菌株有荚膜。
普通大肠埃希氏菌Escherichia Coli
一、埃希氏菌属生物学特性
培养特性 1)需氧及兼性厌氧菌 2)对营养的要求不高，在普通琼脂上就生长良好， 在15C-45℃范围内均可生长，但最适生长温度 为37℃，最适pH为7.2-7.4。 3)在普通琼脂平板上培养24小时，可形成圆形、 凸起、光滑、湿润、半透明、边缘整齐、中等 大小的菌落．其菌落与沙门氏菌比较相似，但 是，大肠杆菌菌落对光(45角折射)观察可见荧 光。 4)在肉汤培养基中生长18-24小时变为均匀浑，而 后底部出现粘性沉淀物，并伴有臭味。
LT与ST的比较
特性
分子量 耐热性 免疫原性
不耐热肠毒素
较大，73000 不耐热 有 耐热 无
耐热肠毒素
较小，1苷酯
肠黏膜GM1神经节苷酯
致病机理
活化细胞腺苷酸环化酶，活化细胞鸟苷酸环化酶， 细胞内cAMP含量升高， 细胞内cGMP含量升高， 分泌功能亢进，引起腹 分泌功能亢进，引起腹 泻 泻
5）在鲜血琼脂平板上生长，有些菌株可 见β溶血环。 6）在远藤琼脂上长成带金属光泽的红色 菌落 7）在S．S琼脂平板上多不生长，少数生 长的细菌，也因发酵乳糖产酸而形成红 色菌落； 8）在伊红美兰琼脂上形成紫黑色具有金 属光泽的菌落 9）在麦康凯琼脂上培养24小时后孤立菌 落呈红色
埃希氏菌在S．S琼脂平板上形成红色菌落
I-吲哚（indol）试验 色氨酸→吲哚→玫瑰吲哚 ↑ 吲哚试剂
M-甲基红（methyl red）实验 葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇 葡萄糖→丙酮酸
甲基红 甲基红 +
V-VP（Voges-Proskauer）试验 葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇→二乙酰→红色化合物+ 胍基化合物
C-枸橼酸盐利用（citrate utilization）试验
一、埃希氏菌属生物学特性
致病性：（1）致病因素 侵袭力:大肠杆菌具有抗原和菌毛,抗原有抗吞噬 作用,有抵抗抗体和补体的作用,菌毛能帮助细菌 黏附于黏膜表面.有侵袭力的菌株可以侵犯肠道表 皮层引起炎症. 内毒素:大肠杆菌细胞壁具有内毒素的活性 肠毒素:有两种,不耐热肠毒素(LT),成分可能是蛋 白质,加热65℃经30min即被破坏. LT与霍乱菌肠 毒素作用相似,都是刺激小肠上皮细胞的腺苷环化 酶,使ATP转变为CAMP,促进肠黏膜细胞的分泌功能, 使肠液大量分泌,引起腹泻;耐热肠毒素(ST)无免 疫性,耐热,100℃经10-20min不被破坏,也可使肠 道细胞的CAMP水平升高,引起腹泻.