肺炎链球菌的检测与分型技术
肺炎链球菌研究现况及血清分型
04 肺炎链球菌的预防和控制
疫苗接种的重要性
疫苗接种是预防肺炎链球菌感染的最 有效手段，通过接种疫苗可以显著降 低肺炎链球菌的发病率和死亡率。
疫苗接种的策略因地区而异，但通常 建议对高风险人群进行接种，如儿童、 老年人、身体虚弱者以及免疫系统受 损者。
目前已有多种肺炎链球菌疫苗，包括 多糖疫苗和结合疫苗，这些疫苗可以 针对不同血清型的肺炎链球菌提供保 护。
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探索肺炎链球菌的毒力因子
01
深入研究肺炎链球菌的毒力因子及其作用机制，为开发新型药
物和疫苗提供理论支持。
解析肺炎链球菌与宿主细胞的相互作用
02
研究肺炎链球菌如何与宿主细胞相互作用，导致感染和疾病的
发生，揭示其致病机制。
探索肺炎链球菌的耐药机制
03
研究肺炎链球菌对抗生素的耐药机制，为抗生素药物的研发提
详细描述
荚膜多糖是肺炎链球菌的主要抗原，不同血清型具有不同的 荚膜多糖抗原，通过检测荚膜多糖抗原可以区分不同血清型 。目前已经发现了超过90种不同的荚膜多糖抗原，对应不同 的血清型。
分子分型方法
总结词
分子分型方法是一种基于肺炎链球菌基因组序列差异的分型方法，具有高分辨率和高重复性。
详细描述
分子分型方法通过比较肺炎链球菌基因组的序列差异，如单核苷酸多态性、插入序列、重复序列等，来确定不同 菌株之间的差异。这种方法能够更精确地区分不同菌株，对于流行病学调查和疾病控制具有重要意义。
抵抗力
抵抗力较强，对一般消毒 剂敏感，对青霉素等抗生 素敏感。
肺炎链球菌的致病性
致病物质
荚膜、自溶酶、神经氨酸 酶、表面蛋白等。
感染途径
主要通过呼吸道飞沫传播， 也可通过接触污染物体表 面或污染水源传播。
肺炎链球菌分型技术-多重PCR分型
多重PCR分型（Multiplex PCR Serotyping）试验开始前，请准备：*分1.2.3. 扩增条件：步骤温度时间预变性95℃15min循环-1 94℃30s循环-2 54℃90s循环-3 72℃60s30个循环延伸 72℃10min保存终止反应后保存于4℃4. 扩增顺序及引物组成：所有引物的工作浓度均为25µM ，下列表中所列体积均为每个25µl 反应中应加入引物的体积。
在每个反应中，内对照引物扩增均应呈阳性。
Reaction 1引物名称 体积µl （V/25µl ） 扩增片段长度bpcpsA-F 0.1160cpsA-R 0.1 6A/B/C-F 0.32506A/B/C-R 0.3 6C-F0.37276C-R 0.3对于Reaction 1和Reaction 1 Supplement未出现血清群/型特异性扩增的样品，进行Reaction 2扩增。
Reaction 2引物名称体积µl（V/25µl）扩增片段长度bp38/25F-F 0.3 57438/25F-R 0.335B-F 0.567735B-R 0.5对于Reaction 3未出现血清群/型特异性扩增的样品，进行Reaction 4扩增。
Reaction 4引物名称体积µl（V/25µl）扩增片段长度bp160cpsA-R 0.1cpsB-F 0.4cpsC-R1 0.2 1187（A）cpsC-R2 0.2 980（B）19FcpsO-F 0.2814（C）19FcpsO-R 0.2若扩增片段为A+C，则为18F若扩增片段为B+C，则为18B/18C若扩增片段为C，则为18A对于Reaction 4和Reaction 4 Supplement未出现血清群/型特异性扩增的样品，进行Reaction 5扩增。
Reaction 5引物名称体积µl（V/25µl）扩增片段长度bp5-R 0.335F/47F-F 0.351735F/47F-R 0.317F-F 0.569317F-R 0.5对于Reaction 6未出现血清群/型特异性扩增的样品，进行Reaction 7扩增。
肺炎链球菌鉴定流程
肺炎链球菌鉴定流程肺炎链球菌（肺炎链球菌属）是导致人类社区获得性肺炎（CAP）最常见的病原体之一。
准确鉴定肺炎链球菌对于指导适当的抗菌治疗和监测抗菌剂耐药性的出现至关重要。
该鉴定过程涉及多个步骤，包括：革兰氏染色：革兰氏染色是鉴定肺炎链球菌的第一步，因为它是一种革兰氏阳性球菌，通常成链状排列。
形态学检查：通过显微镜检查革兰氏阳性标本，可以观察到肺炎链球菌的典型的链球菌形态。
链条的长度和排列模式可能因菌株而异。
荚膜染色：肺炎链球菌具有多糖荚膜，可通过荚膜染色技术（例如，奎肯斯泰特染色）显现出来。
荚膜的存在是肺炎链球菌鉴定的关键特征。
血清学检测：血清学检测，如奎肯斯泰特试验，可用于确定肺炎链球菌的荚膜血清型。
肺炎链球菌的荚膜由不同的血清型组成，每种血清型与不同的抗原性决定簇（PSA）相关。
生物化学测试：多种生物化学测试可用于确认肺炎链球菌的鉴别，包括：溶血反应：肺炎链球菌通常在绵羊红细胞琼脂平板上显示β溶血反应。
胆盐耐受性：肺炎链球菌可耐受高浓度的胆汁盐，这是区分其与其他链球菌的重要特征。
尿素酶活性：肺炎链球菌通常产生尿素酶，可水解尿素。
分子诊断：分子诊断方法，如聚合酶链反应（PCR），可用于快速鉴定肺炎链球菌，尤其是在培养困难的情况下。
PCR检测靶向肺炎链球菌基因，如lytA或cpsA。
抗菌剂敏感性测试：进行抗菌剂敏感性测试对于指导针对肺炎链球菌的适当治疗至关重要。
通常使用琼脂稀释法或扩散法来确定肺炎链球菌对各种抗菌剂的敏感性。
鉴定肺炎链球菌的流程通常涉及以下步骤：1. 革兰氏染色：确定标本中是否存在革兰氏阳性球菌。
2. 形态学检查：观察革兰氏阳性球菌的链球菌形态。
3. 荚膜染色：显示肺炎链球菌荚膜的存在。
4. 血清学检测：确定肺炎链球菌的荚膜血清型。
5. 生物化学测试：进行溶血反应、胆盐耐受性和尿素酶活性测试以确认鉴别。
6. 分子诊断：如有必要，进行PCR检测以快速鉴定肺炎链球菌。
7. 抗菌剂敏感性测试：确定肺炎链球菌对各种抗菌剂的敏感性。
肺炎链球菌分型技术-荚膜肿胀分型 Quellung Typing
荚膜肿胀分型试验
（Quellung Typing）
试验开始前，请准备：
1%甲基兰溶液。
试验步骤：
1.用无菌棉签刮取新鲜培养的细菌，溶于0.85%的NaCl溶液中，配制3.0麦氏
单位菌悬液。
2.分别吸取分型血清和1%甲基兰溶液各5µl于载玻片上充分混合。
3.在步骤2的混合液中添加5µl步骤1的菌悬液，混合均匀。
4.盖上盖玻片，室温下静置3min。
5.100x油镜下观察试验结果。
尽量在半小时内观察结果，勿要使两个玻璃片间
的液体干燥。
如果镜下观察：荚膜涨起可见（菌体自身肿胀）、菌体周围可见厚薄不等、边界清晰的无色环状物，为阳性试验结果。
将血清分型结果及时添加至Streptococcus pneumoniae isolates data bank。
利用荚膜肿胀法，采用丹麦Statens Serum Institut公司生产的Pneumotest Kit对肺炎链球菌血清型/群进行鉴别，判定流程如下：
再将菌悬液分别与血清P-T反应；
交叉凝集判定具体血清型/群。
例如一份样品分别与血清B和R反应，则此标本为血清群3肺炎链球菌。
*Sørensen UBS., Typing of Pneumococci by Using 12 Pooled AntiAntisera, J. Clin. Microbiol. 1993; 31: 2097-2100.。
肺炎链球菌检验
3
生物标记物发现
质谱技术可以发现与肺炎链球菌感染相关的生物 标记物，有助于疾病的早期诊断和预后评估。
生物信息学在肺炎链球菌检验中的应用
数据整合与分析
01
生物信息学可以对来自不同实验平台的数据进行整合和分析，
挖掘肺炎链球菌感染相关的生物标志物和药物靶点。
药物设计
02
基于生物信息学方法，可以预测和设计针对肺炎链球菌的新型
兼性厌氧菌
肺炎链球菌为兼性厌氧菌，在 有氧或无氧环境下均能生长。
营养要求高
肺炎链球菌对营养要求较高， 需要丰富的铁、维生素B等才
能正常生长。
肺炎链球菌的致病性
01
02
03
致病物质
肺炎链球菌主要通过产生 毒素和酶致病，如荚膜多 糖、溶血素等。
感染途径
感染主要通过呼吸道飞沫 传播，也可通过接触污染 物品传播。
设备和专业操作。
药敏试验
总结词
药敏试验用于检测肺炎链球菌对抗菌药物的敏感性和耐药性，指导临床合理用药。
详细描述
药敏试验通过在培养基上接种肺炎链球菌，并添加不同抗菌药物，观察细菌的生长情况，从而判断细菌对抗菌药 物的敏感性和耐药性。药敏试验对于临床医生选择合适的抗菌药物具有重要意义，能够指导临床合理用药，提高 治疗效果并减少耐药性的产生。
疾病类型
感染后可引起大叶肺炎、 脑膜炎、中耳炎等多种疾 病。
肺炎链球菌的流行病学
季节性流行
肺炎链球菌感染有明显的 季节性，冬季和春季是高 发季节。
人群易感性
儿童、老年人、身体虚弱 者及免疫功能低下者易感。
地区分布
全球范围内均有肺炎链球 菌感染的报道，但发病率 和病死率存在地区差异。
02
肺炎链球菌的鉴定方法
肺炎链球菌的鉴定方法来源：检验医学网细菌学检验不仅对疾病的病原学诊断有重要价值，同时对临床治疗的药物选择也具有十分重要意义。
一、生物学性状肺炎链球菌革兰染色呈阳性。
球形或矛头状，成双排列，少呈链状。
在组织中可形成荚膜（人工培养荚膜逐渐消失），无鞭毛及芽孢。
2. 培养特点（1）培养基肺炎链球菌对营养要求较高，需采用质量好的哥伦比亚琼脂基础和新鲜血液（ 5％马血或羊血）。
琼脂浓度可适当下降至1％～1.2％，有利于肺炎链球菌的生长。
1）标本处理及时将采集标本接种到适当的培养基上是提高分离率的前提。
因为，肺炎链球菌对干燥、对寒冷的抵抗力均较弱，在标本离开机体暴露于外界复杂的环境中，其存活率十分低，不及时接种适当培养基是导致分离率低的主要原因。
2）选择性分离培养基培养基中添加5μg/ml庆大霉素有利于肺炎链球菌的分离。
3)培养环境5～10％CO2、35℃培养24～48h。
（3）肺炎链球菌的菌落形态在营养丰富的培养基上，肺炎链球菌形成扁平、中间有凹陷的典型菌落，少数菌可呈粘液型菌落。
3.抗原结构（1）种属特异性抗原：为菌体多糖抗原，存在于肺炎链球菌的细胞壁。
（2）型特异性抗原：是存在于肺炎链球菌荚膜中的一种多糖多聚体，可溶于水，据此抗原可将肺炎链球菌分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……等个型，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型致病性最强。
（3）菌体核蛋白抗原：存在于菌体深部，为蛋白质，无特异性。
二、肺炎链球菌鉴定肺炎链球菌的鉴定，主要应与甲型溶血性链球菌鉴别。
其中以胆汁溶菌试验、菊糖发酵和optochin试验最为常用。
必要时可作小鼠毒力试验加以鉴别。
在上述试验中，肺炎链球菌均应阳性，而甲型溶血性链球菌为阴性。
必要时可用特异性单克隆乳胶或自动化仪器等相应鉴定卡作鉴定。
1. 溶血性检查肺炎链球菌在厌氧或二氧化碳环境中溶血能力大大加强，草绿色溶血环很大，可与其他草绿色链球菌相区别。
2. Optochin(OP)敏感试验optochin即乙基氢化叩卟啉，因结构似于奎宁，故又称为乙基氢化羟基奎宁。
肺炎链球菌检测讲解
国外感染情况
在美国，每年侵袭性SP感染的发生率为72103/10万儿童，而欧洲为10-24/10万儿童/年。 每年约有600多万例中耳炎由SP引起，占急性 中耳炎30-50％；在发展中国家，每年约有 500万5岁以下儿童死于SP引起的肺炎，10-50 万儿童死于SP引起的脑膜炎。（2005年）
2 配制PBS溶液，并分装小试管，每管约 0.5mL，用亚甲蓝粉配制0.1％的亚甲蓝试剂。
SP血清学分型步骤：
3 用接种环挑取经次代培养后的肺炎链球菌菌 落，放入小试管中，制成菌悬液约0.5麦氏单 位浓度。
4 用接种环挑取约10μL菌悬液放入载玻片上， 再挑取同量的诊断血清（10μl）放入载玻片上， 并与菌悬液搅拌混匀。
本地区耐药情况
对红霉素、四环素、复方新诺明、 克林霉素和氯霉素的多重耐药情况较为 严重，多重耐药发生率为75%，高于北 京、上海、杭州地区。
SP培养呼吸道标本的运输和保存
尽快送检，要求2h内送到；
肺炎链球菌延迟送检极有可能死亡，而且不适合4℃ 保存；
标本处理前检测是否合格。
痰标本合格的标准：
痰标本 鳞状上皮细胞 白血球 细菌种类
合格
<=10/低倍 >=10
1-3种
不合格 >=25/低倍 <=10
>3种
培养特性
初次分离需要CO2，采用CO2培养箱较好； 18-24h形成细小、圆形、湿润、自溶的菌落，
保存 挑选新鲜培养物置于保存管中，-76℃ 保存。
复活 取出保存管自然平衡至室温，接种适合 平板。
SP血清学分型：
肺炎链球菌的血清分型可以为肺炎链球菌疫苗 研究提供可靠依据，也是一种流行病学调查手 段。
肺炎链球菌的检测与分型技术
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The Ct value corresponding to the detection level of RT-
PCR and MRT-PCR for pneumococcal serotyping
Serotype
RT-PCT
MRT-PCR
Combined with other serotypes
年龄组, 岁
458例死亡。死亡率 >65岁: 7.55/100 000 < 1岁: 0.71 / 100 000
*覆盖2800万 (占美国人口9%)
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13
/ncidod/DBMD/abcs/survreports/spneu06.pdf
欧洲1985 – 2006年<2岁儿童侵袭性肺炎球菌疾 病发病（发表的研究）
2020/11/14
8
沒有感染者
帶菌者
发病者
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9
肺炎链球菌疾病负担
突破血脑屏障 肺炎球菌菌血症
脑膜炎 脑脊液渗漏
鼻窦炎
突破呼吸道粘 膜纤毛防御系 统
中耳炎 鼻咽部移殖
腹膜炎 关节炎等
突破吞噬细胞防御系统
肺炎
2020/11/14 Salyers AA, Whitt DD. In: Bacterial Pathogenesis: A Molecular Approach. 2nd ed. Washington, USA: 10 ASM Press; 1994. p. 322-31
12A
19F
6C
12B
20
7A
12F
21
7B
13
22A
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疫苗可预防疾病死亡数(WHO, 2003年6月)
5岁以内 5岁以上 合计
肺炎球菌疾病 轮状病毒 流脑AC Hib 黄热病 乙型肝炎 百日咳 破伤风 脊灰 麻疹 白喉
http://www.who.int/vaccine_research/about/gvrf/Levine_Orin.pdf.
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12F, 15B, 17F, 20, 22F, 33F, 9N, 10A, llA
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6D?
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11E?
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4
肺炎链球菌的发现
1881年美国George Sternberg与法国Louis Pasteur首次各別从唾液中发现微尖型的双球菌
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沒有感染者
帶菌者
发病者
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9
肺炎链球菌疾病负担
突破血脑屏障 肺炎球菌菌血症
脑膜炎 脑脊液渗漏
鼻窦炎
突破呼吸道粘 膜纤毛防御系 统
中耳炎 鼻咽部移殖
腹膜炎 关节炎等
突破吞噬细胞防御系统
肺炎
2020/11/14 Salyers AA, Whitt DD. In: Bacterial Pathogenesis: A Molecular Approach. 2nd ed. Washington, USA: 10 ASM Press; 1994. p. 322-31
年龄组, 岁
458例死亡。死亡率 >65岁: 7.55/100 000 < 1岁: 0.71 / 100 000
*覆盖2800万 (占美国人口9%)
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/ncidod/DBMD/abcs/survreports/spneu06.pdf
欧洲1985 – 2006年<2岁儿童侵袭性肺炎球菌疾 病发病（发表的研究）
PHiD10: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 5, 7F
29
41F PCV13: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 5, 7F, 3, 6A, 19A
31
42
PPV23: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 5, 7F, 3, 19A, 2, 8,
而目前的命名Streptococcus pneumoniae是在
1974被确定，主要是经过rRNA基因序列分析而
得名。
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著名的转化试验 1928年 Griffith
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肺炎链球菌定植与扩散
鼻窦
脑膜
鼻
鼓膜
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血管 肺
肺 骨骼
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至少有60%的健康学龄前儿童、30%的健康学龄儿童
16
急性中耳炎: 容易被忽略的感染
肺炎球菌会导致
Pasteur将患有狂犬病病死儿童的唾液植入兔子， 而Sternberg将自己唾液植入兔子，二者结果皆 可在兔子血液中分离出双球菌。
1886年Fraenkel认为应将该菌归类为肺炎球菌
同年Weischelbaum建议命名为Diplococcus pneumoniae
但是直到1920年才正式被承认
IPD* M e ningitis 164
144
侵袭性肺炎球菌疾病
124
104
脑膜炎
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*每10万 < 2 岁儿童的年发病数
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西班牙 比利时 法国
芬兰
英国
丹麦
瑞士
瑞典
挪威
德国 奥地利 意大利
1/10万
国家
Adapted from McIntosh 2007. Epidemiology and Infection (2007), 135:644-656
肺炎链球菌的检测与分型技术
肺炎链球菌简介
(Streptococcus pneumoniae; Pneumococcus)
一般称为肺炎双球菌或球菌
Gram+ 双球菌或链球菌，α溶血（草绿色溶血 环）
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荚膜包覆的肺炎链球菌具有致病力 荚膜多糖体 该菌株致病的主要因子 可以保护菌株免于被巨噬细胞等吞食 具有抗原性 各具免疫反应特异性 目前可知超过90种
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侵袭性肺炎球菌疾病及其相关死亡 CDC急性细菌性疾病监测* （2006年）
数
率（1/10万）
数 率（/10万）
1400
1200
1000
800
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400
200
0
<1
1
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5-17
18-34 35-49 50-64 > 65
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28A
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PCV7: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F
28F
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肺炎球菌疾病死亡率最高的10个国家 多数位于亚洲和非洲
18.0%
16.0%
14.0% 12.0%
全人群
占全球死亡的%
10.0%
8.0%
6.0%
4.0%
2.0%
0.0%
印 度
尼 日 利 亚
埃
刚
塞
果
俄
比
亚
阿
中
富
国
汗
巴 基 斯
安 哥 拉
孟 加 拉
乌 干 达
坦
Sourc2e0:2W0/H11O/14
15
全球所有年龄疫苗可预防疾病死亡数
与成人在鼻咽部携带有肺炎球菌
无症状携带者Βιβλιοθήκη 鼻腔鼻咽部： 移殖部位
气溶胶
吸入
气管
肺炎球菌 疾病患者
扩散
Musher DM. In Mandell G, Bennett JE, Dolin R editors. Principles and practice of infectious
disease. 4th ed. New York, USA: Churchill Livingstone, Inc.; 1995. p.1811-26
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Streptococcus pneumoniae Capsule major virulence factor
91 different capsule types (serotypes).
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